Misurazione e modellazione contrattile asciugatura in Human strato corneo
1 marzo 2017
Questo articolo descrive un metodo per quantificare il comportamento dinamico di essiccazione e le proprietà meccaniche dello strato corneo misurando spazialmente risolta nel piano spostamenti di essiccazione dei campioni di tessuto circolari aderito ad un substrato elastomero. Questa tecnica può essere usata per misurare la diversa trattamenti chimici altera essiccazione e tissutali proprietà meccaniche.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di quantificare la rigidità meccanica dinamica e l'accumulo di stress da essiccazione in campioni ex vivo di strato corneo umano, dopo diversi trattamenti chimici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biomeccanica e delle scienze cosmetiche, come ad esempio come la composizione dello strato corneo o il trattamento del tessuto cutaneo con prodotti per la cura personale possono influenzare le sue proprietà meccaniche e il comportamento dinamico di essiccazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre un'alternativa più rapida ad altri metodi di valutazione meccanica, richiede una quantità significativamente inferiore di tessuto cutaneo e fornisce un'essiccazione più fisiologicamente rilevante impedendo l'evaporazione dalla parte inferiore del campione.
Per preparare i vetrini coprioggetti rivestiti in elastomero, preparare prima l'agente indurente Sylgard 184 con solidi di base con un rapporto base/agente indurente di 55 a uno, fino a quando non è omogeneo. Sono necessari sei grammi in totale. Quindi, degassare la soluzione.
Quindi utilizzare la soluzione per rivestire i vetrini coprioggetti su una centrifuga. Utilizzando una pipetta a foro largo, far cadere un millilitro di miscela al centro di un vetrino coprioggetti. Quindi centrifugare il vetrino coprioggetti a 2.000 giri/min per 60 secondi.
Realizzare cinque o sei vetrini coprioggetti rivestiti in questo modo. Per polimerizzare i vetrini, conservarli in un forno a 60 gradi Celsius per 12 ore. Il giorno successivo, misurare l'ispessimento dei film di elastomero.
Usa una lama di rasoio per sollevare un bordo della pellicola di elastomero dal vetrino coprioggetti. Quindi utilizzare un pennarello indelebile per contrassegnare il lato superiore del film di elastomero e per contrassegnare il vetrino coprioggetti trattato al di sotto. Ora, utilizzando un microscopio invertito, misurare l'altezza Z tra i piani focali dei segni per misurare gli spessori delle pellicole.
Seguire le procedure standard per preparare il tessuto SC. Per realizzare i campioni, prelevare punzoni di sei millimetri di diametro dall'SC. Sui campioni, posizionare un segno al centro della faccia più esterna utilizzando un pennarello indelebile. Successivamente, depositare le perle di marcatore fluorescente sulla superficie SC facendo galleggiare i campioni in 15 millilitri di acqua, contenenti circa 90 microlitri di concentrato di microsfere.
Agitare delicatamente per 30 minuti e regolare la concentrazione del cordone secondo necessità. Dopo il trattamento, immergere ogni campione in acqua per montarlo sull'elastomero. Posizionare un vetrino coprioggetti rivestito con un angolo poco profondo, da 15 a 30 gradi sotto il SC con l'elastomero rivolto verso il lato inferiore del SC. Quindi sollevare il vetrino coprioggetti dall'acqua con l'SC attaccato sopra, laminando così delicatamente il campione SC senza pieghe o aria intrappolata.
Quindi, asciugare i campioni montati in condizioni ambientali per circa un'ora. Una volta asciugati, trasferire i campioni in una camera ermeticamente sigillata contenente una ciotola d'acqua. Lasciare che i campioni si equilibrino all'umidità per 24 ore.
Il giorno successivo, montare un campione in una camera di perfusione per una sessione di imaging prolungata. Posizionare la camera di perfusione sul substrato e sigillare i bordi della camera di perfusione all'elastomero utilizzando grasso per vuoto. Quindi registra immagini fluorescenti e a luce trasmessa con un campo visivo sufficientemente ampio da catturare l'intero campione SC.
Nelle prossime 16 ore, scatta un'immagine ogni 10 minuti. In una cappa chimica, caricare un piccolo tappo di plastica con un millilitro di silano. Trasferire il tappo in un contenitore sigillato con un vetrino coprioggetti rivestito in elastomero, non a contatto diretto.
Lasciarli incubare a temperatura ambiente per cinque ore. Nell'attesa, preparare 20 millilitri di soluzione di perline secondo il protocollo di testo e poi versarla in un piatto da 10 centimetri. Dopo cinque ore, posizionare lentamente i substrati silanizzati con l'elastomero rivolto verso il basso, nella soluzione del tallone.
Caricare due substrati in ogni piatto e lasciare che i substrati reagiscano con le perline per 45 minuti. Successivamente, utilizzando una pinzetta, rimuovere i substrati e sciacquarli in acqua distillata per rimuovere le perle non legate. Quindi asciugarli sotto un leggero getto di aria compressa e conservarli in una scatola sigillata e opaca.
Utilizzando la tecnica precedentemente descritta, trasferire i campioni SC su un substrato trattato in un bagno d'acqua. Subito dopo aver montato l'SC, applicare su di esso una goccia di cinque microlitri di soluzione di perline per pennarelli fluorescenti non diluita. Quindi lasciare asciugare l'SC per 60 minuti.
Ora, misurare lo spessore SC utilizzando il microscopio con una lente soggettiva 40x in una camera di perfusione. Misurare lo spessore di SC nel tempo, utilizzando un accessorio di messa a fuoco remota per registrare la differenza di altezza Z tra i due strati di perline. Uno strato si trova all'interfaccia del substrato SC e l'altro si trova sopra lo SC. Utilizzando le tecniche descritte, è stato preparato un campione SC e rivestito con perle fluorescenti.
Dopo 16 ore di essiccazione, al 25% di umidità relativa, sono stati misurati gli spostamenti. A causa della simmetria circolare dei campioni, questi spostamenti sono stati mediati azimutalmente. Durante l'essiccazione, gli spostamenti azimutali rimangono piccoli.
I profili di spostamento radiale, tuttavia, aumentavano monotonicamente dal centro al bordo e crescevano in grandezza fino a raggiungere un equilibrio. I profili registrati a intervalli di 30 minuti mostrano l'evoluzione temporale degli spostamenti nel piano. Lo spessore medio del SC è diminuito durante l'essiccazione, principalmente nelle prime due ore.
La dinamica dell'essiccamento è stata quindi analizzata adattando i profili di spostamento a un modello di contrattilità lineare ed elastica utilizzando un approccio dei minimi quadrati. Dal modello è stata estratta la sollecitazione di essiccazione contrattuale, nonché il modulo elastico. Entrambi i parametri sono aumentati rapidamente nelle prime due ore di essiccazione.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di far aderire completamente i campioni sul substrato. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la colorazione dei lipidi per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui particolari trattamenti cosmetici alterano la composizione lipidica dei tessuti.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per quantificare la rigidità meccanica dinamica e il comportamento di essiccazione del corneo umano. Misurando gli spostamenti planari di essiccazione di campioni di tessuto su un substrato di elastomero, la tecnica valuta come i trattamenti chimici influenzano le proprietà del tessuto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biomeccanica
- Scienza Cosmetica
Sfondo
- Comprendere le proprietà meccaniche dello strato corneo è fondamentale per le applicazioni di trattamento della pelle.
- I metodi attuali possono richiedere più tessuto o tempo rispetto a quanto desiderato.
- Il comportamento dinamico dell'essiccazione può influenzare l'efficacia dei prodotti per la cura personale.
Scopo dello studio
- Quantificare le sollecitazioni da essiccazione e la rigidità meccanica in campioni di pelle es vivo.
- Valutare l'impatto di diversi trattamenti chimici sulle proprietà della pelle.
- Fornire un'alternativa rapida ai metodi esistenti di valutazione meccanica.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di coprioggetti rivestiti con elastomero utilizzando Sylgard 184.
- Misurazione degli spostamenti di essiccazione risolti nello spazio.
- Valutazione delle proprietà meccaniche dopo il trattamento.
- Prevenzione dell'evaporazione dal lato inferiore del campione per rilevanza fisiologica.
Risultati principali
- Il metodo consente una valutazione rapida delle proprietà meccaniche della pelle.
- Diversi trattamenti chimici alterano in modo significativo il comportamento durante l'essiccazione.
- È richiesta una quantità minore di tessuto rispetto ai metodi tradizionali.
Conclusioni
- Questa tecnica migliora la comprensione della biomeccanica della pelle.
- Fornisce informazioni sugli effetti dei prodotti cosmetici sulla pelle.
- Applicazioni future potrebbero migliorare la formulazione e l'efficacia dei prodotti.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una valutazione rapida e fisiologicamente rilevante delle proprietà meccaniche dello strato corneo in condizioni di essiccazione, supportando la valutazione iniziale di formulazioni cosmetiche e per la cura personale. Quantificando le variazioni dinamiche dello stress da essiccazione e del modulo elastico, fornisce indicazioni predittive sulla funzione barriera e sulla resilienza del tessuto, orientando le decisioni di sviluppo del prodotto. L'approccio ad alto rendimento e con ridotta richiesta di tessuto migliora l'efficienza dello screening e riduce la dipendenza da saggi meccanici tradizionali.
Applicazioni strategiche nella ricerca e sviluppo biotecnologico-farmaceutico
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Indaga in che modo i trattamenti cosmetici alterano le proprietà biomeccaniche dello strato corneo, supportando la verifica di ipotesi meccanicistiche.
- Valore operativo: Consente un'analisi rapida degli effetti delle formulazioni sulla rigidità del tessuto e sullo stress da essiccazione, con consumo minimo di campione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera profili quantitativi di spostamento con risoluzione spaziale che si correlano alle variazioni delle proprietà meccaniche durante l'essiccazione.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione del campione e la misurazione mediante campioni circolari fissati a un elastomero, migliorando la riproducibilità tra i diversi gruppi sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega le variazioni indotte dalla formulazione nel comportamento di essiccazione all'integrità della barriera, sostenendo la rilevanza traslazionale per gli esiti legati alla salute della pelle.
- Valore operativo: Fornisce un monitoraggio continuo dell'evoluzione meccanica durante cicli di essiccazione di 16 ore, consentendo una valutazione dell'efficacia risolta nel tempo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro delle prime fasi di scoperta, in cui l'impatto della formulazione sulla biomeccanica della pelle viene valutato prima dell'ottimizzazione del composto leader, creando un collegamento tra il screening molecolare e la valutazione funzionale del tessuto.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su come i prodotti per la cura personale influenzino la meccanica dello strato corneo e l’accumulo di stress indotto dall’essiccazione.
- Screening: Fornisce costrutti tessuto-elastomero standardizzati pronti per i saggi, adatti al confronto multiplo in schermate di formulazioni.
- Analisi: Estrae lo stress da essiccazione e il modulo elastico da profili di spostamento interpolati, consentendo un confronto quantitativo degli effetti dei trattamenti nel tempo.
- Ricerca Translazionale: Collega la dinamica meccanica dell’essiccazione alla funzione barriera, fornendo indicazioni sulla rilevanza preclinica degli interventi cosmetici.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare diversi attivi cosmetici, idratanti e detergenti in condizioni controllate di essiccazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile degli effetti delle formulazioni sulla resistenza meccanica del tessuto e sul comportamento di essiccazione legato alla barriera.
- Valore operativo: Elevata produttività, basso consumo di tessuto e prevenzione di artefatti da evaporazione migliorano l'affidabilità e la scalabilità del saggio.
- Valore strategico: Permette una riduzione precoce dei rischi associati ai candidati formulativi identificando quelli che aggravano lo stress meccanico indotto dall'essiccazione.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione degli ingredienti cosmetici in base alla compatibilità biomeccanica con lo strato corneo, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni relative all'implementazione
- Competenze nella modellazione biomeccanica e nell'analisi delle immagini per il tracciamento degli spostamenti e l'adattamento del modello.
- Accesso a centrifughe per rivestimenti, camere di perfusione e controllo ambientale per l'essiccazione regolata dall'umidità.
- Standardizzazione delle procedure di perforazione dei tessuti, marcatura con microsfere e rivestimento con elastomero tra diversi utilizzatori.
- Considerazioni adattative per diversi spessori del tessuto o compliance del substrato quando si estende l'applicazione oltre lo strato corneo umano.
- Limitazione pratica: il metodo presuppone un comportamento elastico lineare e simmetria circolare, ipotesi che potrebbero non essere valide in condizioni patologiche o in tessuti fortemente alterati.
