Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare una piattaforma di co-coltura dinamica basata sulla microfluidica per emulare l'ambiente intraperitoneale con i componenti cellulari e meccanici in cui si verificano le metastasi del cancro ovarico. Utilizzando questo micro per questa piattaforma, aiuta a rispondere alle domande chiave nel campo della biologia del cancro, come il microambiente della disseminazione peritoneale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che una co-coltura 3D a flusso libero controllato con precisione imita meglio la comunicazione in vivo tra le cellule di cancro ovarico e le cellule di metotedia che avviene in una cavità peritoneale.

Dopo aver progettato e disegnato il modello di canale microfluidico e averlo prodotto secondo il protocollo di testo, rivestire uno strato di SU82075 Photoresist sul wafer di silicone con una velocità di rotazione di 1800 giri/min. Cuocere il wafer rivestito di Photoresist direttamente su una piastra calda a 65 gradi Celsius per cinque minuti. E poi a 95 gradi Celsius per 25 minuti per rimuovere il solvente in eccesso.

Spalmare un secondo strato di SU82075 Photoresist sul wafer per uno spessore finale di 250 micrometri. Posizionare il wafer rivestito di Photoresist direttamente su una piastra calda a 65 gradi Celsius per sette minuti e poi a 95 gradi Celsius per 30 minuti prima di raffreddare lentamente il wafer a temperatura ambiente. Quindi, allinea e metti la maschera fotografica direttamente sopra il wafer.

Quindi esponilo alla luce UV per 20 secondi per attraversare la lunghezza del modello. Su una piastra calda, cuocere il wafer rivestito a 65 gradi Celsius per cinque minuti e 95 gradi Celsius per 12 minuti per rimuovere il solvente per la prelimerizzazione. Rimuovere il Photoresist non a croce immergendo il wafer in uno sviluppatore SU8 per 25 minuti.

Quindi, con l'isopropanale, sciacquare il wafer e utilizzare aria pressurizzata per asciugarlo. Combinare la base e l'agente indurente polidimetilsilossano o PDMS con un rapporto di massa di 10 a uno e utilizzare il miscelatore centrifugo sotto la funzione di miscelazione e degassificazione per miscelare la soluzione. Versare lentamente la miscela PDMS sul wafer fino a un'altezza di circa cinque millimetri.

Degassare il PDMS in un essiccatore sottovuoto per 40 minuti. Quindi polimerizzare il PDMS in forno a 65 gradi Celsius per due ore. Staccare con cura la lastra PDMS dal master e tagliare il PDMS lungo i canali fino a raggiungere le dimensioni di un vetrino.

Quindi, con un punzone per biopsia da un millimetro, perforare il PDMS per creare gli ingressi e le uscite del dispositivo. Utilizzare aria pressurizzata per pulire la superficie del PDMS e quindi con nastro adesivo, rimuovere la polvere e i detriti del PDMS. Posizionare ora la lastra PDMS con il lato del canale rivolto verso l'alto in un pulitore al plasma.

Quindi posizionare un vetrino pulito nel pulitore al plasma accanto alla lastra PDMS. Trattare il PDMS e il vetrino sotto il plasma d'aria ad alta frequenza o RF per un minuto. Quindi, dopo aver rimosso i campioni dal pulitore al plasma, legare il PDMS al vetrino per creare un legame covalente irreversibile.

Posizionare il chip PDMS su una piastra calda a 150 gradi Celsius per un'ora per migliorare la forza di adesione e restituire l'idrofobicità del PDMS prima dell'uso. Per rivestire i canali microfluidici con fibronectina, iniziare utilizzando 30 microlitri di etanolo al 75% per sterilizzare i canali. Rimuovere l'etanolo e utilizzare PBS per sciacquare due volte i canali.

Quindi aspirare accuratamente il PBS dai canali. Preparare 10 microgrammi per millilitro di soluzione di fibronectina in M199MCDB105 terreno privo di siero con 30 microlitri di soluzione, riempire lentamente i canali e utilizzare del nastro adesivo per sigillarli. Quindi incubare il chip a quattro gradi Celsius durante la notte.

Per seminare le cellule primarie di mesotelia peritoneale o HPMC nei canali microfluidici, dopo aver risciacquato le cellule coltivate secondo il protocollo di testo, utilizzare due millilitri di terreno di coltura FBS al 10% per risospendere gli HPMC. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare a 3,5 volte 10 al sesto di cellule per millilitro. Riscaldare il chip microfluidico rivestito di fibronectina in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per cinque minuti prima dell'uso.

Quindi aspirare completamente la soluzione di fibronectina e pipettare lentamente 30 microlitri di sospensione di HPMC in ciascun canale. Utilizzare del nastro adesivo per sigillare i canali e posizionare il dispositivo nell'incubatore a CO2 durante la notte. Per indurre la formazione di sferoidi del cancro ovarico, sciogliere lo 0,5% di agarosio in acqua sterilizzata.

Erogare 50 microlitri di soluzione di agarosio nei pozzetti delle piastre da 96 pozzetti. Dopo aver contato le cellule tumorali epiteliali umane precedentemente coltivate, sospenderle nuovamente in terreno di coltura FBS al 5% a una densità di 5.000 cellule per millilitro. Trasferire 200 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto rivestito di agarosio.

E coltivare le cellule a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2 per 48 ore. Trasferire gli sferoidi tumorali in una provetta da centrifuga da 50 millilitri preinumidita con un millilitro di terreno privo di siero e centrifugare gli sferoidi a 750 volte G per cinque minuti. Dopo la preparazione di 2,5 microgrammi per millilitro di soluzione CMFDA in M199MCDB105 terreno privo di siero.

Risospendere gli sferoidi tumorali in un millilitro di soluzione e incubare gli sferoidi a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi contare il numero di sferoidi e utilizzare un terreno privo di siero per regolare la concentrazione a 2.000 sferoidi per millilitro. Prima del caricamento degli sferoidi, iniettare lentamente 100 microlitri di terreno M199MCDB105 privo di siero per lavare via le cellule mesoteliologiche non aderenti all'interno dei canali.

Caricare 30 microlitri di sospensione sferoidale marcata con fluorescenza in ciascun canale. Quindi posizionare il chip microfluidico nell'incubatore a CO2. Assemblare una piattaforma di profusione collegando una siringa caricata con M199MCDB105 di terreno fresco privo di siero a un tubo lungo un metro.

Posizionare la siringa sulla pompa a siringa e fissare lo stantuffo e il corpo della siringa. Quindi installare la pompa a siringa in posizione orizzontale alla stessa altezza del chip microfluidico all'interno dell'incubatore. Infondere rapidamente l'intero tubo con il fluido tenendo premuto il pulsante di avanzamento rapido fino a quando il fluido non trabocca nel tubo.

Quindi eseguire l'iniezione alla portata desiderata. Collegare il tubo all'ingresso del canale secondo il protocollo di testo. Quindi utilizzare un tubo di uscita corto per collegare l'uscita del canale a un tubo conico da 50 millilitri per raccogliere il mezzo di deflusso.

Infine, utilizzare un microscopio a campo chiaro o a fluorescenza per osservare gli HPMC e gli sferoidi tumorali. Utilizzando la piattaforma microfluidica descritta in questo video, gli sferoidi del cancro ovarico sono stati modellati con cellule mesoteliali in condizioni idrodinamiche. Come mostrato in questa figura, le cellule mesoteliali che sono state coltivate nel microdispositivo per 16 ore hanno formato con successo un monostrato di HPMC.

In questo esperimento, sferoidi multicellulari con diametri di circa 100 micrometri di dimensioni simili a quelli trovati nelle società di pazienti sono stati marcati con un colorante fluorescente verde CMFDA. Gli sferoidi sono stati poi trasferiti in canali microfluidici rivestiti di HPMC e sono rimasti in sospensione e le morfologie cellulari sono state catturate. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in diverse ore nell'arco di tre giorni se eseguita correttamente.

Uno su 10 in questa procedura, è importante ricordare di evitare di introdurre bolle d'aria nei canali microfluidici. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il trattamento farmacologico, i test di aderenza, i test di clearance dei mesoteli per rispondere a ulteriori domande, come l'effetto del microambiente introperitoneale sulla progressione del cancro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per esplorare la mestasi peritoneale negli esseri umani.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare un microdispositivo peritoneale con flusso fluidico per avviare il comportamento del cancro ovarico nella cavità peritoneale. Non dimenticare che lavorare con solforati organici come l'acetone, come sviluppatore e cilina, può essere estremamente pericoloso. Le precauzioni MP, come indossare guanti e camice da laboratorio, devono essere sempre prese quando si esegue questa procedura per la prima volta.

Tutte le procedure che riguardano questo ufficio dovrebbero essere eseguite sotto la massima copertura.