Name: Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Scopri come creare una piattaforma microfluidica dinamica per co-cultura 3D che emula l'ambiente intraperitoneale nello studio della metastasi ovarica. Questo metodo permette di analizzare le interazioni cellulari in condizioni controllate.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Hong Kong Research Council Grant (borse di 17.122.014, C1013-15G, 719813E, e 17.304.514). AST Wong è un destinatario del Croucher Senior Research Fellowship.

1. Microfluidic design del dispositivo e Fabrication <ol><li> Design Master Microfluidic <ol><li> Disegno e disegnare il modello di canale microfluidica con qualsiasi software per computer-aided design (CAD). NOTA: Normalmente, il disegno CAD può essere inviato ad una società fotomaschera per produrre fotomaschera. La progettazione microfluidica consiste di tre canali paralleli identici, ciascuno con le seguenti dimensioni: 4 mm × 25 mm × 250 micron (larghezza × lunghezza × altezza) e impostare 2 mm. Entrambe le estremità del canale sono stati progettati con 127 ° angoli per facilitare l&#39;ingresso e l&#39;uscita di liquido (Figura 1B). Il canale utilizzato in questo protocollo è stato segnalato in una precedente pubblicazione 13. </li><li> Lavare il wafer di silicio con ultrasuoni (500 W / 42 kHz) in acetone, isopropanolo, e acqua deionizzata per 15 minuti ciascuno. Essiccare il wafer con azoto pressurizzato. Riscaldare il wafer di silicio su una piastra calda a 250 ° C per 15 min a completamente asciuttaesso. </li><li> Spin-coat uno strato di SU-8 2075 photoresist (125 micron di spessore) sul wafer di silicio con una velocità di rotazione di 1800 giri al minuto. Cuocere il wafer photoresist rivestite direttamente su una piastra calda a 65 ° C e poi a 95 ° C, per rimuovere il solvente in eccesso, per 5 e 25 minuti, rispettivamente (secondo il manuale del prodotto SU-8). </li><li> Ripetere il passaggio 3 e spin-coat un altro strato di SU-8 2075 photoresist per ottenere uno spessore finale di 250 micron. Cuocere il photoresist rivestite wafer direttamente su una piastra calda a 65 ° C per 7 minuti e poi a 95 ° C per 30 min. Lentamente raffreddare il wafer a temperatura ambiente. Non raffreddare con aria compressa. </li><li> Allineare e mettere fotomaschera direttamente sulla parte superiore del wafer. Esporla alla luce UV per 20 s per reticolare il modello. </li><li> Cuocere il wafer con fotoresist a 65 ° C e 95 ° C su una piastra per 5 e 12 minuti, rispettivamente, per rimuovere il solvente per la polimerizzazione (secondo il manuale del prodotto SU-8). In seguito, raffreddare la cialda ditemperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il photoresist non reticolato immergendo il wafer in SU-8 sviluppatore per 25 min. Lavare il wafer con isopropanolo e asciugare con aria compressa. NOTA: Se una soluzione lattea è stata osservata quando il risciacquo con isopropanolo, indicando sviluppo incompleto, immergere il wafer di nuovo in SU-8 sviluppatore per un tempo di sviluppo più lungo. </li><li> Posizionare la cialda su un piatto caldo a 180 ° C per 10 minuti per guarire il modello da potenziali fessure. Spegnere la piastra calda e lentamente raffreddare la cialda a temperatura ambiente, lasciando sul piatto caldo. </li><li> Aggiungere poche gocce di tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano in un tappo del flacone. Mettere il tappo del flacone in un essiccatore a vuoto. Posizionare il wafer accanto al cappuccio della fiala per silanizzare fetta per 10 min. </li></ol></li><li> PDMS fabbricazione di chip <ol><li> Avvolgere il wafer con un foglio di alluminio per creare un supporto. </li><li> Mescolare il polidimetilsilossano (PDMS) base e catalizzatore in un rapporto di 10: 1 di massacon un miscelatore centrifuga sotto la funzione di miscelazione e degassamento. Versare il composto PDMS lentamente sul wafer ad una altezza di circa 5 mm. Degassare la PDMS sotto vuoto per 40 min. Curare il PDMS in un forno a 65 ° C per 2 h. </li><li> sbucciare accuratamente la lastra PDMS off master e tagliare le PDMS lungo i canali finché è la dimensione di un vetrino. Punch il PDMS con un 1 mm pugno biopsia per creare gli ingressi e le uscite del dispositivo. </li><li> Pulire la superficie PDMS con aria compressa e nastro adesivo per rimuovere la polvere e detriti PDMS. </li><li> Posizionare la lastra PDMS, con il lato rivolto verso l&#39;alto del canale, in un pulitore plasma. Posizionare un vetrino pulito nel più pulito al plasma accanto alla lastra PDMS. </li><li> Trattare il PDMS e vetrino sotto plasma ad aria ad alto livello RF per 1 min. Associare il PDMS al vetrino per creare un legame covalente irreversibile. </li><li> Posizionare il chip PDMS su una piastra calda a 150 ° C per 1 h per aumentare la resistenza di legame e di restituire il Hydrophobicity dei PDMS prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2. Semina il Microfluidic Chip con cellule mesoteliali peritoneale primario (HPMCs) <ol><li> Rivestimento fibronectina dei canali microfluidica <ol><li> Sterilizzare il canale microfluidica con 30 ml di etanolo al 75%. Rimuovere l&#39;etanolo e lavare due volte con 30 ml di PBS sterile (PBS) utilizzando un puntale. Accuratamente aspirare PBS nei canali. NOTA: per minimizzare la contaminazione, la coltura cellulare microfluidica deve essere attentamente condotta in condizioni asettiche completamente attraverso l&#39;uso di una cappa a flusso laminare. </li><li> Preparare una soluzione 10 mg / ml fibronectina nel M199 privo di siero: MCDB105 (1: 1) di media. Pipetta la soluzione su e giù, con particolare attenzione per evitare la formazione di bolle. Non farlo vortice. </li><li> Lentamente riempire ogni canale con 30 ml di soluzione di fibronectina. Sigillare i canali con nastro adesivo e incubare il chip notte a 4 ° C. </li></ol></li><li&gt; HPMCs semina nei canali microfluidica <ol><li> HPMCs cultura in 10% di siero fetale bovino (FBS) terreno di coltura (M199: MCDB105 supplementato con 10% FBS e 100 U / mL di penicillina / streptomicina) sotto il 5% di CO 2 a 37 ° C fino a 80% di confluenza. </li><li> Risciacquare le HPMCs con 3 ml di PBS e trypsinize con 2 mL di 0,05% tripsina / soluzione (TE) 0,01% EDTA per 30 s. Neutralizzare con 4 ml di 10% mezzo di coltura FBS e centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 min. </li><li> Risospendere le HPMCs in 2 mL di 10% FBS mezzo di coltura. Contare il numero di cellule con un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare a 3,5 × 10 6 / ml. </li><li> Riscaldare il chip microfluidica fibronectina rivestite in un incubatore a 37 ° per 5 minuti prima dell&#39;uso. Completamente aspirare la soluzione di fibronectina. </li><li> Lentamente pipettare 30 ml di sospensione HPMC in ogni canale. Sigillare i canali con nastro e posizionare i dispositivi nell&#39;incubatrice CO 2 durante la notte. </li></ol></li></ol><ol><li> formazione sferoide cancro ovarico <ol><li> Mantenere la linea epiteliale umano ovarico cellule di cancro SKOV-3 in 5% FBS mezzo di coltura (M199: MCDB105 con 5% FBS e 100 U / mL di penicillina / streptomicina) e 5% di CO 2 a 37 ° C prima degli esperimenti. </li><li> Sciogliere 0,5% agarosio in acqua bollita. Pipettare 50 ml di soluzione di agarosio in ciascun pozzetto di piastre da 96 pozzetti. Lasciare le piastre nella cappa per 20 minuti per consentire l&#39;agarosio solidificare; agarosio solidificato rivestire i pozzetti possono impedire l&#39;adesione cellulare e indica che le piastre sono pronte per l&#39;uso. </li><li> Lavare le cellule Skov-3 con 3 ml di PBS. Trypsinize con 2 ml di soluzione di TE per 3 min. Neutralizzare con 4 ml di 5% terreno di coltura FBS e centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 min. </li><li> Contare il numero di cellule SKOV-3 con un emocitometro e risospendere le cellule in 5% FBS mezzo di coltura ad una densità di 5.000 cellule / ml. Transfer 200 ml di sospensione cellulare in ciascun agarosio rivestita bene e cultura sotto 5% di CO 2 a 37 ° C per 48 h. </li></ol></li><li> Cancro sferoide carico <ol><li> Trasferimento sferoidi tumorali di un tubo da centrifuga da 50 ml di pre-bagnato con 1 ml di mezzo privo di siero e spin down a 750 xg per 5 min. NOTA: Pre-bagnato puntali e provette da centrifuga può impedire l&#39;attaccamento sferoide indesiderato sulle provette da centrifuga. </li><li> Preparare 2,5 mg / mL di soluzione diacetato 5-chloromethylfluorescein (CMFDA) in privo di siero M199: media MCDB105. Risospendere sferoidi tumorali in 1 mL di soluzione di CMFDA e incubare a 37 ° C per 30 min. Centrifugare a 750 xg per 5 min. </li><li> Risciacquare sferoidi tumorali con 2 ml di mezzo privo di siero e centrifugare a 750 xg per 5 min. Ripetere questo passaggio due volte per rimuovere il colorante fluorescente restante dal mezzo. NOTA: Il segnale fluorescente può essere mantenuto in sferoidi per più di 96 h. </li><li> Risospendere il cancrosferoidi in privo di siero M199: medio MCDB105 e contare il numero sferoide con un emocitometro. Regolare la concentrazione a 2.000 sferoidi / mL con terreno privo di siero. </li><li> Prima di sferoide carico, iniettare lentamente 100 ml di privo di siero M199: media MCDB105 per lavare via le cellule non-aderito mesoteliali all&#39;interno dei canali. NOTA: una iniezione veloce, aspirazione, o la formazione di bolle porterà al distacco del monostrato mesoteliali. </li><li> Carico 30 ml di sospensione sferoide con marcatore fluorescente in ogni canale. Posizionare il chip microfluidica nell&#39;incubatore di CO 2. </li></ol></li><li> assemblaggio piattaforma di perfusione e co-coltura <ol><li> Attaccare una siringa carica di fresco, M199 privo di siero: medio MCDB105 ad un tubo di 1 m di lunghezza. </li><li> Posizionare la siringa sulla pompa a siringa e fissare il pistone ed il corpo della siringa. Installare la pompa a siringa in posizione orizzontale alla stessa altezza del chip microfluidico all&#39;interno dell&#39;incubatrice. NOTA: Il numero e la dimensione delle siringhe dipende dal numero di canali utilizzati e la durata dell&#39;esperimento. </li><li> infondere rapidamente l&#39;intero tubo con media premendo e tenendo premuto il tasto di avanzamento veloce fino a quando il mezzo di overflow del tubo. </li><li> Eseguire l&#39;iniezione alla portata desiderata. Stimare il sforzi di taglio utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55337/eq1.jpg" /> dove τ rappresenta il sforzi di taglio all&#39;interno della camera, Ǫ = portata, μ = viscosità (0,01 g cm -1); Altezza della camera h = flusso, e la larghezza della camera w = flusso. </li><li> Collegare il tubo per l&#39;ingresso del canale. Posizionare il tubo di ingresso eccesso in incubatrice per garantire che il substrato viene riscaldato prima iniettato nei canali. Per facilitare il collegamento tra il tubo e il canale, connettori appropriati possono essere scelti. NOTA: Attenzione a non introdurre alcuna bolla al Syringe, tubi e connessioni. </li><li> Collegare l&#39;uscita del canale ad un tubo conico da 50 mL per raccogliere il mezzo efflusso con un tubo di uscita breve. NOTA: Il sistema completo co-coltura dinamica è mostrato nella Figura 1D. </li></ol></li></ol> 4. Osservazione di HPMCs e cancro Spheroids dopo perfusione <ol><li> Osservare le HPMCs e sferoidi tumorali con un campo chiaro o microscopio a fluorescenza e scattare foto dopo 1 h di perfusione. </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21296855">Global cancer statistics.</a> CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).</li>
<li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Kit+mediates+chemoresistance+and+tumor-initiating+capacity+of+ovarian+cancer+cells+through+activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin-ATP-binding+cassette+G2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling.</a> Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).</li>
<li>Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+contributes+to+the+acquired+apoptotic+resistance+of+nonadherent+ovarian+cancer+cells+through+a+cross+talk+mediated+by+phosphatidylinositol+3-kinase+and+extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2.</a> Neoplasia. 12, 128-144 (2010).</li>
<li>Ksiazek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion%3A+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li>
<li>Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+Fibrin+Derivatives+and+Fibronectin+in+Ascitic+Fluid+from+Patients+with+Ovarian-Cancer+Compared+to+Ascitic+Fluid+in+Liver-Cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis.</a> Thromb Res. 35, 53-64 (1984).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307, 58-62 (2005).</li>
<li>Chang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+cycle+arrest+induced+by+shear+stress%3A+Roles+of+integrins+and+Smad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+driving+force+for+change%3A+interstitial+flow+as+a+morphoregulator%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator.</a> Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).</li>
<li>Rizvi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+cellular+heterogeneity+and+biomarker+modulation+in+3D+ovarian+cancer+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).</li>
<li>Ip, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+chemoresistance+in+epithelial+ovarian+carcinoma+cells+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress.</a> Sci. Rep. 6, 26788(2016).</li>
<li>Avraham-Chakim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-flow+induced+wall+shear+stress+and+epithelial+ovarian+cancer+peritoneal+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading.</a> PloS one. 8, e60965(2013).</li>
<li>Burkhalter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/26/1_Supplement/656.11">Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer.</a> Faseb Journal. 26, (2012).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+assessment+of+three-dimensional+cell+aggregation+in+rotating+wall+vessel+bioreactors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).</li>
<li>Ismadi, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+characterization+of+a+spinner+flask+for+induced+pluripotent+stem+cell+culture+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application.</a> PloS one. 9, e106493(2014).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one.+9%22%5BJournal%5D)">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PloS one. 9. 9, e89966(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo saggio offre un modello flessibile e fisiologicamente rilevanti che possono essere incorporati con vari saggi biochimici e basati su celle, tra cui, ma non limitato a, saggi di adesione, saggi di liquidazione mesoteliali, e lo screening di stupefacenti. Esso può essere applicato alla valutazione dell&#39;effetto del microambiente intraperitoneale sulla progressione del cancro. Tuttavia, potrebbe essere necessario ottimizzare diverse condizioni sperimentali, a seconda degli obiettivi del progetto (ad esempio,<...

<html> Il cancro ovarico è il cancro ginecologico più letale ed è caratterizzata da un&#39;ampia diffusione peritoneale e la formazione di ascite maligna 1. Questo ampio metastasi peritoneale rappresenta una grande sfida clinica ed è associata a esiti clinici povere. Diversamente dalla maggior parte dei carcinomi solidi che metastatizzano attraverso il sangue, il cancro ovarico diffonde in primo luogo all&#39;interno della cavità peritoneale. Le cellule tumorali esistono come multicellulari aggregati / sferoidi durante il processo di metastasi 2. Il fatto che la cultura sospensione può arricchire / cellule tumorali ovariche avvio staminali tumorali suggerisce inoltre che questi sferoidi possono essere associati sia con aggressività del tumore e migliorato chemoresistance 3, 4. Ci sono differenze nella risposta ai farmaci tra le culture 2D e 3D, che hanno presumibilmente diversi meccanismi molecolari 5. _content &quot;&gt; L&#39;interazione essenziale con mesotelio costruisce il microambiente primario per la progressione del tumore ovarico. Queste cellule mesoteliali trovano su una matrice extracellulare (ECM), dove fibronectina è un costituente ubiquitario. Un collegamento tra l&#39;aumentata espressione di mesothelial fibronectina derivato dalle cellule e è stato dimostrato progressione tumorale. fibronectina è abbondantemente presente in ascite maligna 6, 7. cellule tumorali ovariche sono anche in grado di indurre la secrezione di fibronectina dalle cellule mesoteliali per promuovere precoce ovarico metastasi del cancro 8. Prove emergenti mostra che stimoli meccanici, compresi sollecitazione di taglio, possono modulare la morfologia cellulare, l&#39;espressione genica, e, pertanto, i fenotipi di cellule tumorali 9, 10, 11. Come ascite maligna sviluppare e accumulare durante tumor progressione, cellule tumorali ovariche sono esposti al flusso del fluido e la conseguente sollecitazione di taglio. Un certo numero di gruppi, la nostra compresa, hanno dimostrato l&#39;impatto dello stress di taglio sulla progressione del cancro ovarico, comprese le modifiche del citoscheletro, epiteliali-to-mesenchimali transizioni ed stemness cancro 12, 13, 14, 15. Così, un microambiente fisiologicamente rilevanti è importante per la ricerca di tumore metastasi peritoneale. Tuttavia, gli attuali sistemi di coltura in vitro idrodinamici hanno limitazioni mimando e controllo di una costante, basso, fisiologicamente rilevante sforzo di taglio 16, 17, 18, 19. Convenzionale in vitro si avvicina a concentrarsi su entrambi l&#39;ambiente cellulare o meccanico sono ancora limitati insimulando la complessità del microambiente intraperitoneale con adeguata rilevanza fisiologica. Qui, al fine di progettare un nuovo modello del peritoneo di superare i limiti di strategie convenzionali e per avanzare lo studio del vano intraperitoneale in metastasi del cancro, una piattaforma microfluidica basata 3D con flusso del fluido controllato creata. In questo modello, sferoidi cancro ovarico sono stati co-coltura con cellule umane mesoteliali peritoneali primari in chip microfluidici sotto flusso fluido continuo (Figura 1A). Le cellule mesoteliali sono state seminate su fibronectina. Non aderenti sferoidi carcinoma ovarico sono state seminate in canali microfluidica con medie flusso continuo perfuso da una pompa a siringa. Sia l&#39;ambiente 3D e le forze meccaniche dinamiche sono fattori molto importanti della cascata metastatica. Questa piattaforma può essere utilizzata per studiare la microambiente intraperitoneale in termini di cel complessolular e co-coltura interazioni, nonché in relazione agli stimoli meccanici dinamici.

<table><tbody><tr><td>Wafer di silicio</td><td>Wafer universitario</td><td>#1196</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>SU-8 2075 fotoresist&nbsp;</td><td>Sviluppatore Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8&nbsp;</td><td>Microchem</td><td>108-65-6</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td>Polidimetilsilossano (PDMS) + kit di agenti indurenti</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>33-31AA</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td> da 1 mm di diametro <td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>SCI</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0,86 mm (diametro interno)</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Pompa di precisione più lunga&nbsp;</td><td>&nbsp; LSP01-2A</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td>Aggiungere 2,2 g/L di bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>MCDB 105 Medium</td><td>Sigma</td><td>M6395</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Clone</td><td>SH30068,02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0,05% tripsina - 0,01% EDTA, fenolo rosso</td></tr><tr><td>Fibronectina umana</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>agarosio</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>5-clorometilfluoresceina diacetato</td><td>Life technologies</td><td>C7025</td><td>Verde CMFDA</td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Nikon</td><td></td><td>Modello: 80i o ECLIPSE Ti; software: SPOT</td></tr><tr><td>SKOV-3& nbsp;</td><td></td><td></td><td>Dono del Dr. N Auersperg (Università della British Columbia)</td></tr></tbody></table>

modellazione comportamento ovarian cancer multicellulare spheroid in un microdevice dinamica 3d peritoneale

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Il cancro ovarico è caratterizzata da ampie metastasi peritoneale, con sfere tumorali che si trovano comunemente nei ascite maligna. Questo è associata a esiti clinici povere e attualmente manca un trattamento efficace. Sia il tridimensionale (3D) ambiente e le forze meccaniche dinamiche sono fattori molto importanti in questa cascata metastatica. Tuttavia, colture cellulari tradizionali non riescono a ricapitolare questo microambiente tumorale naturale. Così, in vivo -come modelli in grado di emulare l&#39;ambiente intraperitoneale sono di evidente importanza. In questo studio, una nuova piattaforma microfluidica del peritoneo è stato istituito per simulare la situazione di sferoidi cancro ovarico nella cavità peritoneale durante metastasi. sferoidi cancro ovarico generati in una condizione non-aderenti sono state coltivate in canali microfluidica rivestite con cellule mesoteliali peritoneali sottoposte a fisiologicamente rilevanti sforzo di taglio. In sintesi, questa dinamica 3D ovarico mic cancro-mesoteliopiattaforma rofluidic in grado di fornire nuove conoscenze sulla biologia del cancro di base e fungere da piattaforma per lo screening di droga potenziale e lo sviluppo.

Usando questo protocollo, una piattaforma microfluidica è stato istituito per modellare sferoidi cancro ovarico con cellule mesoteliali in condizioni idrodinamiche. cellule mesoteliali peritoneali umani primari sono stati coltivati ​​in microdispositivi per 16 h e osservati al microscopio in campo chiaro. Come mostrato in Figura 2A, il fondo del canale è stato coperto con successo con un monostrato di HPMCs. E &#39;importante notare che la formazione di bolle durante la ...

Per studiare la progressione del tumore ovarico in un modello fisiologicamente rilevanti, sferoidi multicellulari sono state coltivate in un Microdevice sotto flusso del fluido simulato. Questo modello 3D dinamica emula l&#39;ambiente intraperitoneale con i componenti cellulari e meccanici in cui si verifica metastasi del cancro ovarico.

Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare una piattaforma dinamica di co-coltura basata sulla microfluidica per emulare l'ambiente intraperitoneale con i componenti cellulari e meccanici in cui avviene la metastasi del carcinoma ovarico. L'utilizzo di questa microtecnologia per la piattaforma permette di rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, come ad esempio il microambiente della disseminazione peritoneale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che una co-coltura tridimensionale in condizioni di flusso libero precisamente controllato riproduce meglio la comunicazione in vivo tra le cellule tumorali ovariche e le cellule mesoteliali che si verifica nella cavità peritoneale.Dopo aver progettato e disegnato il modello del canale microfluidico e averlo fatto produrre secondo il protocollo descritto, si applichi uno strato di fotoresina SU82075 su una wafer di silicone mediante spin-coating a una velocità di 1800 giri al minuto. Si cuocia quindi la wafer rivestita di fotoresina direttamente su una piastra riscaldante a 65 gradi Celsius per cinque minuti, seguiti da 25 minuti a 95 gradi Celsius per rimuovere il solvente in eccesso.Applicare

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Il saggio di liquidazione mesoteliali qui descritto si avvale di cellule fluorescente e microscopia time-lapse video visualizzare e misurare quantitativamente le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

Descriviamo metodologie per la creazione...

Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

In questo video, dimostriamo lo sviluppo di un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale. Questa coltura organotipica può aiutare a studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione delle metastasi del cancro ovarico nel rivestimento della cavità peritoneale: un metodo per stabilire un modello 3D in vitro del rivestimento peritoneale

In questo video, stabiliamo una coltura di organi omentali ex vivo sovrapposta a cellule di cancro ovarico che esprimono GFP per studiare la colonizzazione del cancro ovarico all'interno dell'espiante omentale. Questo protocollo analizza le strutture delle cellule immunitarie all'interno dell'omento, note come macchie lattiginose che promuovono le metastasi.

Modellazione della colonizzazione cellulare del cancro ovarico dell'omento: un metodo ex vivo per stabilire la colonizzazione della macchia lattiginosa di cellule di cancro ovarico marcate in fluorescenza in espianti di omento murino

Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Qui, presentiamo un protocollo per costruire un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale, composto da cellule mesoteliali umane primarie e fibroblasti stratificati con matrice extracellulare, come strumento per studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

Questo protocollo descrive la generazione di sferoidi derivati dal paziente e l'analisi a valle, tra cui la quantificazione della proliferazione, il test di citotossicità, la citometria di flusso, la colorazione dell'immunofluorescenza e l'imaging confocale, al fine di valutare il farmaco potenziale dei candidati come terapie anti-neoplastiche. Questo protocollo supporta la medicina di precisione con l'identificazione di farmaci specifici per ogni paziente e lo stadio della malattia.

Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali

L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello in vitro 3D per studiare la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro (CAF) in un ambiente di massa tumorale, che può essere affrontato in diversi sistemi di analisi, come l'immunofluorescenza, la trascrizione l'analisi e l'imaging delle cellule di vita.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Mancano modelli completi in vitro che ricapitolino fedelmente la malattia umana pertinente. Il presente studio presenta la creazione e la coltura tridimensionale (3D) di sferoidi tumorali, uno strumento affidabile in vitro per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare umano.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

Questo protocollo descrive la creazione di un modello tridimensionale (3D) ex vivo dell'interazione cellula tumorale-omento. Il modello fornisce una piattaforma per chiarire i meccanismi pro-tumorali all'interno della nicchia adiposa e per testare nuove terapie.

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

C'è un bisogno critico di modelli di cancro 3D che catturino il crosstalk eterocellulare per studiare le metastasi del cancro. Il nostro studio presenta la generazione di epiteliali stromali eteromulticellulari in un ambiente privo di scaffold e scaffold che può essere utilizzato per studiare l'invasione e le distribuzioni spaziali cellulari.

Cellule stromali eteromulticellulari in colture 3D prive di scaffold di cellule tumorali epiteliali per guidare l'invasione

Scopri come creare una piattaforma microfluidica dinamica per co-cultura 3D che emula l'ambiente intraperitoneale nello studio della metastasi ovarica. Questo metodo permette di analizzare le interazioni cellulari in condizioni controllate.

Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale

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