Trattamento delle strutture ligamentali con serum esercitato-condizionato: un modello di ingegneria tessuto transazionale
11 giugno 2017
Presentiamo un modello di tessuto ligamentario in cui i trattamenti tridimensionali vengono trattati con il siero umano esercitato condizionato e analizzati per il contenuto di collagene, la funzione e la biochimica cellulare.
L'obiettivo generale di questo modello è determinare l'impatto dell'esercizio fisico e della nutrizione sulla sintesi e sulla funzione del tessuto connettivo. Questa tecnica utilizza siero umano che viene assunto prima e dopo l'esercizio per trattare i tessuti 3D, in modo da poter capire come l'esercizio influisce sulla funzione di legamenti e tendini. La garanzia tissutale 3D combina i vantaggi di saggi in vitro ben caratterizzati con la funzione, la morfologia e le caratteristiche biochimiche dei tessuti in vivo.
Dopo aver preparato in anticipo le lastre da 35 millimetri rivestite di silicone secondo il protocollo di testo, preparare gli stampi di ancoraggio posizionando uno spillo al centro di ogni pozzetto cilindrico negli stampi. Combinare il beta fosfato tricalcico e la soluzione di acido citrico ortofosforico da uno a tre grammi per millilitro in una barca di plastica su ghiaccio. Utilizzare un raschietto per celle di plastica per mescolare energicamente il cemento.
Triturare il cemento per continuare a mescolare e pipettare la miscela negli stampi, quindi centrifugare lo stampo riempito a 2, 250 volte g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, lasciare che gli ancoraggi in cemento brushite si solidifichino a temperatura ambiente per una notte. La mattina seguente rimuovere gli ancoraggi dallo stampo e appuntare due ancoraggi, a 12 millimetri di distanza l'uno dall'altro, in ciascuna piastra rivestita di silicone.
Sterilizzare le piastre appuntate spruzzandole con etanolo al 70%, riempiendo sia le piastre che i coperchi, quindi posizionare le piastre in un armadio di sicurezza biologica o BSC. Dopo almeno 30 minuti, aspirare le piastre e lasciarle provare nel BSC. Riposizionare i coperchi e conservarli nel BSC fino al momento del bisogno.
Rispettare le normative locali sui rischi biologici per l'uso e lo smaltimento corretti di materiale a rischio biologico. Mantenere la sterilità ed eseguire le fasi di formazione dei costrutti in una cappa di sicurezza biologica. Dopo aver preparato fibroblasti primari, reagenti e piastre rivestite di silicone con ancore di brushite appuntate, secondo il protocollo di testo, coltivare le cellule in piastre da 15 centimetri al 70% di confluenza.
Successivamente, preparare una miscela master composta da quanto segue, 681 microlitri per costrutto di sospensione cellulare, 29 microlitri per costrutto di trombina, due microlitri per costrutto di aprotinina e due microlitri per costrutto di acido amminoesanoico. Dopo aver mescolato bene la soluzione, aggiungere 714 microlitri a ciascuna piastra appuntata a forma di otto attorno agli ancoraggi in cemento brushite, assicurandosi che la miscela master entri in contatto diretto con i lati degli ancoraggi. Picchiettare delicatamente ogni piatto per distribuire uniformemente il composto.
Il passaggio più critico è la formazione del gel di fibrina a sede cellulare. Assicurarsi che la miscela master a sede cella entri in contatto diretto con gli ancoraggi e picchiettare la piastra per distribuire uniformemente la miscela. Un piatto alla volta, aggiungere 286 microlitri di fibrinogeno in modo uniforme e goccia a goccia sul piatto.
Far scorrere immediatamente la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro per distribuire il fibrinogeno per formare i gel di fibrina incorporati nelle cellule, quindi procedere alla piastra successiva. Posizionare i costrutti in un incubatore sterile mantenuto a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica e incubarli per almeno 15 minuti per consentire la polimerizzazione del fibrinogeno. Preparare due millilitri per costrutto di terreno di alimentazione integrando il terreno di crescita con 200 micromoli di acido ascorbico, 50 micromoli di prolene e cinque nanogrammi per millilitro di TGF beta 1.
Utilizzare due millilitri di terreno di alimentazione per coprire ogni costrutto e coltivare i costrutti in un'incubatrice sterile mantenuta a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un totale di 14 giorni, o fino al punto finale desiderato, rinfrescando il terreno ogni due giorni con due millilitri di terreno di alimentazione. Per raccogliere il siero umano, prelevare un campione di sangue a riposo secondo il protocollo di testo, quindi chiedere ai partecipanti di eseguire una modalità di esercizio adatta al tuo obiettivo di ricerca. Qui è mostrato un esercizio di resistenza ad alta intensità di 30 minuti.
Raccogliere un campione di sangue 15 minuti dopo la sessione di allenamento, quindi dopo aver lasciato coagulare il sangue, centrifugare il campione a 1.500 volte g per 10 minuti. In condizioni sterili, trasferire il siero in provette sterili per la preparazione dei terreni. Dopo la preparazione dei costrutti legamentosi, eseguire la prova di trazione utilizzando un tester di trazione in un bagno PBS con impugnature stampate inversamente accoppiate al trasduttore di forza.
Ciò mantiene in posizione gli ancoraggi in cemento brushite durante il test. Utilizzando calibri digitali, determinare la lunghezza e l'insieme dei costrutti legamentosi e calcolare l'area della sezione trasversale del tessuto. Sganciare il costrutto del legamento dalla piastra e posizionare gli ancoraggi nelle impugnature stampate al contrario, assicurandosi che la struttura sia immersa nel PBS, quindi regolare la distanza tra le impugnature, impostando la lunghezza della costruzione alla sua lunghezza iniziale.
Iniziare il test e tendere il costrutto fino alla rottura a una velocità di deformazione di 0,4 millimetri al secondo, o 3% al secondo. Dopo il test, elaborare il tessuto ed eseguire la quantificazione del collagene dei legamenti ingegnerizzati secondo il protocollo di testo. Dopo uno o due giorni di coltura, i fibroblasti ACL si sono attaccati al gel di fibrina, hanno esteso i processi cellulari e hanno iniziato a esercitare forze di trazione.
Si genera tensione tra i due punti di ancoraggio e le cellule si allineano parallelamente a questo asse e iniziano a depositare il collagene. Qui è mostrato un grafico rappresentativo della deformazione da sforzo per un legamento testato fino al cedimento. In questi esperimenti, il siero umano è stato isolato da campioni di sangue pre e post-esercizio e utilizzato al posto di FBS per generare terreni arricchiti con l'ambiente biochimico indotto dall'esercizio.
Come mostrato in questo grafico, dopo un periodo di coltura di 14 giorni, i costrutti legamentosi hanno dimostrato un aumento significativo sia del carico di trazione massimo che del contenuto di collagene in risposta al siero post-esercizio. Una volta padroneggiati, i costrutti dei legamenti possono essere realizzati nel corso di due giorni e saranno pronti per i test di trazione, la quantificazione del contenuto di collagene e altre analisi biochimiche in due settimane. Questo modello traslazionale in vitro in vivo fa parte di una missione più ampia per capire come l'esercizio fisico migliora la funzione dei legamenti, dei tendini e, in realtà, di quasi tutti i tessuti del corpo.
Quindi questa è una tecnica davvero robusta e forte in cui possiamo determinare il contenuto di collagene e la funzione del tessuto connettivo dopo trattamenti con esercizio, nutrizione, carico, qualsiasi tipo di fattore di crescita, tutti i tipi di interventi diversi che possiamo fare negli esseri umani o negli animali.
Panoramica
Questo studio presenta un modello di tessuto legamentoso trattato con siero condizionato da esercizio umano per analizzare il contenuto di collagene, la funzione e la biochimica cellulare. L'obiettivo è comprendere come l'esercizio e la nutrizione influenzano la sintesi e la funzione del tessuto connettivo.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ingegneria tissutale
Contesto
- I tessuti connettivi come legamenti e tendini sono cruciali per la funzione muscoloscheletrica.
- L'esercizio è noto per influenzare la salute e la rigenerazione dei tessuti.
- Il siero umano può fornire informazioni sull'ambiente biochimico post-esercizio.
- I costrutti tissutali 3D imitano le condizioni in vivo per ottenere risultati sperimentali migliori.
Obiettivo dello studio
- Determinare gli effetti dell'esercizio sulla funzione dei legamenti e dei tendini.
- Analizzare i cambiamenti biochimici nei tessuti connettivi dopo l'esercizio.
- Sviluppare un modello affidabile per studiare le risposte dei tessuti all'esercizio.
Metodi utilizzati
- Preparazione di costrutti tissutali 3D utilizzando siero umano.
- Centrifugazione e coltura di fibroblasti in un ambiente controllato.
- Test di trazione dei costrutti per valutare le proprietà meccaniche.
- Quantificazione del collagene per valutare la composizione del tessuto.
Risultati principali
- Aumento significativo del carico di trazione massimo e del contenuto di collagene osservato.
- Il siero umano arricchito con fattori indotti dall'esercizio ha migliorato i risultati dei tessuti.
- I costrutti hanno dimostrato allineamento e deposizione di collagene da parte dei fibroblasti.
- Il modello ha imitato con successo le condizioni in vivo per l'analisi del tessuto connettivo.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un approccio innovativo per comprendere gli effetti dell'esercizio sui legamenti.
- Il siero umano può essere efficacemente utilizzato per migliorare i risultati dell'ingegneria tissutale.
- Questo modello può facilitare ulteriori ricerche sulla salute dei tessuti connettivi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This model addresses the translational gap in connective tissue research by using human exercise-conditioned serum to treat 3D ligament constructs, enabling physiologically relevant assessment of tissue function. It supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical programs focused on exercise-mimetic therapeutics or nutritional interventions. The approach provides quantitative mechanical and biochemical readouts that improve predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of exercise-induced biochemical milieu on ligament function and collagen synthesis.
- Operational Value: Provides a human-relevant system to validate targets involved in mechanotransduction and tissue adaptation.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing for compounds or nutrients that mimic exercise benefits on connective tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized 3D ligament constructs with quantifiable outputs including tensile load and collagen content.
- Operational Value: Enables reproducible, serum-mediated conditioning to assess compound effects in a disease-relevant system.
- Assay Readiness: Supports screening workflows requiring functional, morphologic, and biochemical analysis of engineered tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges in vitro findings to human physiology by incorporating post-exercise serum factors.
- Preclinical Model: Offers a non-animal, human-cell-based system for evaluating connective tissue responses to interventions.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on functional tissue outcomes rather than surrogate markers.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for programs targeting musculoskeletal health or exercise-mimetic agents.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of how exercise-induced factors influence ligament synthesis and alignment.
- Screening: Delivers quantitative, functional readouts (tensile strength, collagen deposition) for compound or serum fraction comparison.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as ultimate tensile stress and collagen quantification to compare experimental conditions.
- Translational Research: Uses human cells and exercise-conditioned serum to enhance relevance to human tissue responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing diverse interventions (exercise, nutrition, loading, growth factors) on connective tissue.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by modeling human tissue responses to physiologically relevant stimuli.
- Operational Value: Standardizes construct formation and conditioning with defined serum inputs for reproducible outcomes.
- Strategic Value: Reduces reliance on animal models and improves early assessment of connective tissue efficacy.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of exercise-mimetic or nutritional candidates based on functional tissue improvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, 3D tissue engineering, and sterile tissue culture techniques.
- Dependent on access to human serum samples collected pre- and post-exercise under standardized protocols.
- Needs tensile testing equipment and collagen quantification assays for functional and biochemical analysis.
- Must account for donor variability in exercise response when designing comparative studies.
- Limited to in vitro assessment; does not capture systemic or neurological contributions to tissue function.
