Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

L'obiettivo generale di questo protocollo è consentire ai ricercatori di catturare, separare e analizzare complessi proteici nativi estratti da lisati tissutali utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide. Questo metodo può aiutare i ricercatori che studiano le proteine perché è in grado di stabilizzare associazioni proteiche altrimenti labili in condizioni quasi native, consentendone l'identificazione e la successiva analisi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza metodi biologici comuni, quindi è ampiamente applicabile e può essere adattata agli obiettivi del singolo ricercatore.

Per iniziare questa procedura, prepararsi per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo blu come descritto nel protocollo di testo. Collegare gli elettrodi all'alimentatore ed elettroforare le proteine nel gel a 150 volt fino a quando la banda del colorante progredisce di circa due centimetri nello strato di risoluzione. A questo punto, fermate e scollegate l'alimentazione.

Dopo aver smontato l'apparecchio per elettroforesi, separare le lastre di vetro della cassetta per gel. Rimuovere ed eliminare lo strato di impilamento. Taglia con cura il gel appena sotto il bordo inferiore del fronte della tintura, avendo cura di rendere questo taglio il più liscio e dritto possibile.

Quindi, scartare il pezzo di gel inutilizzato. Taglia via le parti inutilizzate lungo i bordi della striscia di gel. Posizionare con cura la striscia in 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfofato in un piccolo contenitore e mescolare delicatamente per notazione per 30 minuti per equilibrare.

Dopo l'equilibratura, scartare e sostituire il PBS con altri 10 millilitri. Pipettare 500 microlitri di DSP da 25 millimolari disciolti in dimetilsolfossido nel PBS e continuare a mescolare come prima per 30 minuti. Dopo 30 minuti, versare la soluzione DSP.

A 10 millilitri di HSCL molare 0,375, pH 8,8, contenente il 2% di dodecil solfato di sodio per estinguere il DSP non reagito. Continuare la notazione per 15 minuti. Mentre la striscia di gel è in fase di tempra, preparare le soluzioni di gel SDS-PAGE secondo i metodi standard.

Non aggiungere i reagenti di polimerizzazione. Dopo la tempra, riportare la striscia di gel nativo blu a temperatura ambiente e gettare la striscia in una nuova cassetta di gel. Per fare ciò, raccogli con cura il gel e posizionalo su una piastra distanziatrice per cassetta gel pulita.

Orientare la striscia in modo che sia capovolta rispetto al suo orientamento precedente e che la parte inferiore della parte anteriore del colorante sia più vicina alla parte superiore della nuova cassetta. Posizionare la striscia in modo che il suo bordo superiore si trovi allo stesso livello del punto in cui si troverà il bordo superiore della piastra di copertura. Assicurati che la parte anteriore del colorante sia parallela ai bordi orizzontali della lastra di vetro.

Spingere un lato della striscia asportata contro una delle pareti del distanziatore, lasciando spazio sull'altro lato per il versamento del gel e il caricamento di uno standard proteico o di una scala. Se il bordo inferiore della striscia di gel contiene aree frastagliate o irregolari, tagliarle via con cura. Una volta posizionata correttamente la striscia di gel, appoggiare la piastra di copertura sopra la piastra distanziatrice.

Applicare una leggera pressione per espellere eventuali bolle d'aria intrappolate. Continuare a montare l'apparecchio per versare il gel secondo le istruzioni del produttore. La striscia di gel a volte si sposta quando viene posizionata la piastra superiore.

Aiuta a far pendere un po' la striscia dal bordo della piastra superiore in modo che possa essere regolata con una spatola per correggere eventuali spostamenti. Aggiungere i reagenti di polimerizzazione al tampone di gel risolutivo e versarlo nella cassetta di gel preparata utilizzando una pipetta sierologica. Riempire la cassetta del gel fino a circa due centimetri sotto la striscia di gel nativo blu asportata per lasciare spazio allo strato di impilamento.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di butanolo sopra il gel versato e attendere 30 minuti per la polimerizzazione dello strato risolutivo prima di versare il butanolo. Quindi, aggiungere i reagenti di polimerizzazione alla soluzione di gel di impilamento. Utilizzando una pipetta sierologica, versare lo strato di impilamento per riempire tutto lo spazio vuoto rimanente nella cassetta del gel.

Inclinare la cassetta del gel mentre lo strato di impilamento viene versato in modo che riempia lo spazio sotto la striscia di gel e le bolle d'aria non rimangano intrappolate. Man mano che il tampone di gel impilabile riempie lo spazio vuoto sotto la striscia di gel, riportare gradualmente la cassetta del gel in piano. Continua a riempire lo spazio vuoto accanto alla striscia di gel asportata con il tampone di gel di impilamento fino a quando non trabocca quasi.

Quindi, lasciare polimerizzare lo strato di impilamento per 30 minuti. Dopo che lo strato di impilamento si è polimerizzato, rimuovere la cassetta del gel dall'apparecchio di colata, sciacquarla con acqua distillata e assemblare l'apparecchio per elettroforesi secondo le istruzioni del produttore. Riempire completamente la camera interna con 1x buffer di scorrimento SDS-PAGE.

Quindi, riempire la camera esterna fino al livello indicato dal produttore. Caricare lo spazio accanto alla striscia di gel asportata con una scala di peso molecolare o lo standard proteico appropriato. Collegare gli elettrodi all'alimentatore ed elettroforare i campioni a 120 volt.

Quando il colorante Coomassie fuoriesce dal gel, interrompere la corsa e scollegare l'alimentazione. Analizza il gel utilizzando metodi standard di elettroblotting e rilevamento delle proteine basato su anticorpi. La validazione del multimer-PAGE è mostrata qui tramite immunoblot.

Il complesso chinesinico catturato viene scisso dal difio-3-itolo, dimostrando che gli aggregati ad alto peso molecolare sono formati dalla reticolazione di sostituenti più piccoli. Qui raffigurati, i lisati cerebrali trattati con concentrazioni crescenti di SDS o Triton hanno aumentato il rilevamento dell'alfa-sinucleina monomerica, diminuendo al contempo il rilevamento dell'oligomero solubile tetromero. Qui vengono mostrati i risultati rappresentativi del multimer-PAGE utilizzato per catturare complessi solubili nel lisato cerebrale di ratto.

Le proteine sono state rilevate tramite immunoblot. Il peso monomerico previsto di ciascuna proteina è mostrato sotto le corsie. Allo stesso modo, qui viene mostrata la cattura di complessi legati alla membrana.

Multimer-PAGE occasionalmente non riesce a catturare un complesso, come mostrato nel complesso respiratorio SDHA a due blot. Una discussione sulle possibili spiegazioni di ciò può essere trovata nel protocollo di testo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la reticolazione in-gel di complessi proteici nativi seguita dal ri-casting del gel e dalla separazione mediante SDS-PAGE secondaria. Non dimenticare che lavorare con l'acrilammide può essere estremamente pericoloso e che è necessario indossare dispositivi di protezione individuale durante la colata del gel. Seguendo questa procedura, i complessi stabilizzati separati possono essere eluiti o tagliati dal gel e possono essere analizzati con molti mezzi, tra cui l'immunorilevazione o la spettrometria di massa a seconda delle esigenze del ricercatore.