Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

L'obiettivo generale di questo protocollo è consentire ai ricercatori di catturare, separare e analizzare complessi proteici nativi estratti da lisati tissutali mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide. Questo metodo può aiutare i ricercatori che studiano le proteine poiché è in grado di stabilizzare associazioni proteiche altrimenti labili in condizioni prossime a quelle native, permettendone l'identificazione e l'analisi successiva. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo di metodi biologici comuni, risultando così ampiamente applicabile e adattabile agli obiettivi del singolo ricercatore.

Per iniziare questa procedura, prepararsi per l'elettroforesi su gel di poliacrilamide in condizioni native in presenza di blu come descritto nel protocollo testuale. Collegare gli elettrodi all'alimentatore e far migrare le proteine nel gel a 150 volt finché la banda del colorante non avanza di circa due centimetri nel gel risolutivo. A questo punto, interrompere e scollegare l'alimentatore.

Dopo aver smontato l'apparato di elettroforesi, separare le lastre di vetro della cassetta del gel. Rimuovere e scartare lo strato di accumulo. Tagliare con attenzione il gel appena al di sotto del margine inferiore del fronte del colorante, avendo cura di eseguire il taglio il più liscio e dritto possibile.

Quindi, scartare il pezzo di gel non utilizzato. Rimuovere con cura le parti non utilizzate lungo i bordi della striscia di gel. Posizionare con attenzione la striscia in 10 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato in un contenitore piccolo e mescolare delicatamente per 30 minuti mediante agitazione per raggiungere l'equilibrio.

Dopo l'equilibrazione, scartare e sostituire il PBS con altri 10 millilitri. Pipettare 500 microlitri di DSP 25 millimolare disciolto in dimetilsulfossido nel PBS e continuare a mescolare come in precedenza per 30 minuti. Trascorsi 30 minuti, versare via la soluzione di DSP.

Aggiungere 10 millilitri di HSCL 0,375 molare, pH 8,8, contenente il 2% di dodecilsolfato di sodio per bloccare il DSP non reagito. Proseguire l'incubazione per 15 minuti. Mentre la striscia di gel viene bloccata, preparare le soluzioni per gel SDS-PAGE seguendo i metodi standard.

Non aggiungere i reagenti di polimerizzazione. Dopo l'interruzione della reazione, riportare la striscia del gel nativo blu a temperatura ambiente e inserirla in una nuova cassetta per gel. Per fare ciò, sollevare con cura il gel e posizionarlo su una piastra distanziatrice pulita per cassetta del gel.

Orientare la striscia in modo che sia capovolta rispetto all'orientamento precedente e il bordo inferiore del fronte del colorante sia vicino al bordo superiore della nuova cassetta. Posizionare la striscia in modo che il suo bordo superiore sia allineato con il punto in cui si troverà il bordo superiore della piastra di copertura. Assicurarsi che il fronte del colorante sia parallelo ai bordi orizzontali della piastra di vetro.

Appoggiare un lato della striscia escissa contro una delle pareti distanziali, lasciando spazio sull'altro lato per versare il gel e caricare un marcatore proteico o una scala molecolare. Se il bordo inferiore della striscia di gel presenta aree irregolari o frastagliate, tagliarle con cura. Una volta posizionata correttamente la striscia di gel, appoggiare la piastra di copertura sulla piastra distanziale.

Applicare una pressione delicata per espellere eventuali bolle d'aria intrappolate. Proseguire quindi con l'assemblaggio dell'apparato per la colatura del gel seguendo le istruzioni del produttore. A volte la striscia di gel si sposta durante il posizionamento della piastra superiore.

È utile far sporgere leggermente la striscia oltre il bordo della piastra superiore in modo da poterla regolare con una spatola per correggere eventuali spostamenti. Aggiungere i reagenti di polimerizzazione al buffer del gel risolutivo e versarlo nel cassetto del gel preparato utilizzando una pipetta serologica. Riempire il cassetto del gel fino a circa due centimetri al di sotto della striscia di gel blue native PAGE tagliata, lasciando spazio per lo strato di accumulo.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di butanolo sopra il gel versato e lasciare polimerizzare per 30 minuti lo strato risolutivo prima di eliminare il butanolo. Successivamente, aggiungere i reagenti di polimerizzazione alla soluzione del gel di raccordo. Utilizzando una pipetta sierologica, versare lo strato di raccordo fino a riempire tutto lo spazio vuoto rimanente nella cassetta del gel.

Inclinare la cassetta del gel mentre si versa il livello di sovrapposizione, in modo che riempia lo spazio sotto la striscia di gel ed eviti il trattenimento di bolle d'aria. Mentre il buffer del gel di sovrapposizione riempie lo spazio vuoto sotto la striscia di gel, riportare gradualmente la cassetta del gel a una posizione orizzontale. Continuare a riempire lo spazio adiacente alla striscia di gel asportata con il buffer del gel di sovrapposizione fino a quando non è quasi pieno.

Quindi, lasciare polimerizzare il gel di sovrapposizione per 30 minuti. Una volta che il gel di sovrapposizione è polimerizzato, rimuovere la cassetta del gel dall'apparato di colata, sciacquarla con acqua distillata e assemblare l'apparato di elettroforesi secondo le istruzioni del produttore. Riempire completamente la camera interna con buffer di corsa 1x SDS-PAGE.

Quindi, riempire la camera esterna fino al livello indicato dal produttore. Caricare lo spazio accanto alla striscia di gel escissa con un marcatore di peso molecolare o con il corretto standard proteico. Collegare gli elettrodi all'alimentatore e far migrare i campioni mediante elettroforesi a 120 volt.

Quando il colorante Coomassie esce dal gel, interrompere l'elettroforesi e scollegare l'alimentatore. Analizzare il gel utilizzando metodi standard di elettrotrasferimento e rilevamento proteico mediante anticorpi. La validazione della multimer-PAGE è mostrata qui mediante immunoblot.

Il complesso della chinesina catturato viene scisso dal diphyo-3-itol, dimostrando che gli aggregati ad alto peso molecolare sono formati tramite l'incrocio di subunità più piccole. Qui viene mostrato che nei lisati cerebrali trattati con concentrazioni crescenti di SDS o Triton aumenta la rilevazione della forma monomerica dell'alfa-sinucleina, mentre diminuisce la rilevazione del tetramero oligomerico solubile. Vengono qui riportati risultati rappresentativi di multimer-PAGE utilizzata per catturare complessi solubili in lisati cerebrali di ratto.

I proteine sono state rilevate mediante immunoblot. Il peso monomerico previsto di ciascuna proteina è indicato al di sotto delle corsie. Analogamente, qui è mostrato il rilevamento dei complessi legati alla membrana.

La multimer-PAGE a volte non riesce a rilevare un complesso, come mostrato nel secondo blot del complesso respiratorio SDHA. Una discussione sulle possibili spiegazioni di questo fenomeno è riportata nel protocollo testuale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore se effettuata correttamente.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il cross-linking in gel di complessi proteici nativi, seguito dal re-impiego del gel e dalla separazione mediante SDS-PAGE secondaria. Non dimenticare che lavorare con acrilamide può essere estremamente pericoloso e che è necessario indossare dispositivi di protezione individuale durante la preparazione del gel. Dopo questa procedura, i complessi stabilizzati separati possono essere eluiti o escissi dal gel e analizzati con diverse metodiche, tra cui immunodetection o spettrometria di massa, a seconda delle esigenze del ricercatore.