Dissezione, microCT scansione e morfometriche analisi del Baculum

L'obiettivo generale di questa dissezione e analisi morfometrica è illustrare la robustezza della nostra metodologia morfometrica nello studio di strutture con forme complesse, come l'osso del pene del topo. Abbiamo concepito per la prima volta questa ricerca quando abbiamo capito che i metodi esistenti per misurare la variabilità del baculo, come la rilevazione delle dimensioni di lunghezza e larghezza, perdevano completamente ogni informazione riguardo alla curvatura e alla complessità della forma; pertanto, abbiamo ideato questo metodo per quantificare la variazione di dimensione e forma di qualsiasi osso o struttura di interesse in tre dimensioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che applica la morfometria moderna a strutture prive di punti di riferimento anatomici.

Questo dovrebbe far progredire il campo fornendo misurazioni migliorate e ripetibili di strutture complesse. Posizionare un topo maschio sessualmente maturo, precedentemente eutanasizzato, in posizione supina ed estrarre il pene applicando una pressione con il pollice lateralmente all'apertura prepuziale. Una volta che il pene emerge, estendere il tessuto attraverso il prepuzio il più possibile.

Successivamente, utilizzando delle forbici, tagliare il corpo del pene in prossimità della regione prossimale al glande, dove si trova il baculo, staccando così il pene. Quindi immergere completamente il pene in circa 200 microlitri di acqua del rubinetto all'interno di una provetta per microcentrifuga. Per ammorbidire il tessuto, incubarlo a circa 50 gradi Celsius per tre-cinque giorni.

L'ammorbidimento del tessuto riduce la probabilità che l'osso si rompa durante l'estrazione. Dopo l'incubazione, utilizzare un microscopio da dissezione e una pinzetta per rimuovere la maggior parte del tessuto circostante il baculo. Dopo la dissezione macroscopica, spruzzare delicatamente etanolo al 70 percento per rimuovere i residui di tessuto e pulire l'osso.

Quindi posizionare il baculo dissezionato in un nuovo tubo da microcentrifuga e lasciare asciugare l'osso a temperatura ambiente con il cappuccio aperto. Per iniziare, preparare il materiale in cui verrà collocato l'osso. Premere un supporto cilindrico per tomografia computerizzata in un blocco di polistirolo da fiorista.

Quindi estrarre il cilindro risultante di schiuma e tagliare fette di schiuma spesse tra due e cinque centimetri. Inserire ora da 10 a 15 baculi essiccati nella schiuma da fiorista lungo la periferia di una singola fetta, per ridurre al minimo le interferenze durante la scansione. Annotare con precisione l'orientamento dell'osso per l'identificazione futura.

Successivamente, posizionare con attenzione le ossa su un supporto in schiuma all'interno del portacampioni della micro-TC e inserire il supporto in uno scanner micro-TC 50. Impostare lo scanner micro-TC 50 come segue: utilizzare 90 kilovolt pascals, una dimensione del voxel di 155 angstrom, un filtro in alluminio da 5 millilitri, 750 proiezioni ogni 180 gradi e un tempo di esposizione di 500 millisecondi.

Procedere quindi alla scansione del campione. Le ossa del baculo sono state dissezionate, preparate e scansionate utilizzando il protocollo descritto. Molte ossa possono essere inserite in una singola scansione TC.

Le immagini sono state quindi elaborate utilizzando la geometria computazionale come descritto nel protocollo testuale. Questo processo di imaging dovrebbe essere applicabile allo studio di una vasta gamma di ossa e di altri soggetti di interesse. L'analisi fornisce informazioni dettagliate sulle caratteristiche dei punti di riferimento dell'oggetto ed è altamente automatizzata.

Questo processo ha richiesto solo circa 10 aggiustamenti manuali durante l'analisi di 369 baculi. La cosa interessante è che i nostri metodi potrebbero essere applicati a una vasta gamma di strutture complesse. Questi metodi ci hanno permesso di quantificare dimensioni e forma del baculo in tre dimensioni.