Name: Isolare e analisi cellule del pancreas Mesenchima mediante citometria di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Impara a isolare cellule mesenchimali pancreatiche da tessuti murini embrionali, neonatali e adulti mediante citometria a flusso. Questo metodo consente l'analisi dell'espressione genica e dei marcatori di superficie per studiare lo sviluppo pancreatico.

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Gli autori ringraziano Adi Sasson per l'assistenza tecnica e Helen Guez per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione di avvio n. 336204 del Consiglio europeo della ricerca.

Gli esperimenti sono stati condotti secondo i protocolli approvati dal Comitato per la ricerca sugli animali dell'Università di Tel Aviv.
1. Isolamento del tessuto pancreatico dai topi
<ol>
	<li>Per i topi adulti:
	<ol>
		<li>Preparare il tampone per la digestione: 0,4 mg/mL di collagenasi P e 0,1 ng/mL di DNasi I disciolte nella soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS). Preparare appena 5 mL di tampone per topo in provette coniche da 15 mL e tenerle in ghiaccio fino al momento dell'uso.</li>
		<li>Eutanasia dei topi secondo le linee guida istituzionali.</li>
		<li>Sezionare ogni topo per rimuovere il pancreas (per istruzioni, vedere il riferimento 18); metterlo in un piatto di coltura contenente HBSS. È possibile eseguire questa fase sotto uno stereomicroscopio e, per aumentare l'efficienza della digestione, tagliare il tessuto in 2 - 4 pezzi.</li>
		<li>Posizionare il tessuto pancreatico in una provetta contenente tampone digestivo (preparato al punto 1.1.1). Tenere le provette sul ghiaccio fino a quando tutti i topi non sono stati sezionati e i tessuti pancreatici raccolti.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.1.2 - 1.1.4 con i mouse rimanenti.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per embrioni e topi neonati:
	<ol>
		<li>Preparare il tampone per la digestione: 0,4 mg/mL di collagenasi P e 0,1 ng/mL di DNasi I disciolta in HBSS. Per gli embrioni e i cuccioli al 7° giorno postnatale (p7) o più giovani, preparare appena 1,5 - 2 ml di tampone per topo in una provetta conica da 15 ml. Per i cuccioli di età pari o superiore a 7 anni, preparare 3-4 ml di tampone per topo in una provetta conica da 15 ml. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.</li>
		<li>Eutanasia dei topi secondo le linee guida istituzionali. Per gli embrioni, rimuovere tutti gli embrioni dall'utero materno e metterli in una piastra di coltura da 10 mm contenente PBS. Seziona un embrione alla volta.</li>
		<li>Appoggia il topo sulla schiena, con la testa rivolta lontano dall'investigatore. Usando una pinza sottile, sollevare la pelle addominale e aprirla sulla linea mediana per esporre la cavità addominale fino al diaframma del topo18.</li>
		<li>Usando una pinza fine, staccare il fegato dalla parete addominale posteriore. Con un movimento continuo verso la coda del topo, estrai gli organi interni (inclusi fegato, stomaco, milza, intestino, reni e pancreas) e mettili in un piatto di coltura contenente HBSS.</li>
		<li>Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere il fegato e i reni per esporre il pancreas (Figura 1). Usando una pinza sottile, stacca il pancreas dallo stomaco, dal duodeno e, infine, dalla milza.</li>
		<li>Posizionare il tessuto pancreatico in una provetta contenente tampone digestivo (preparato al punto 1.2.1). Per i cuccioli p14 o più grandi, tagliare il tessuto in 2 pezzi per aumentare l'efficienza della digestione. Tenere le provette sul ghiaccio fino a quando tutti i topi non sono stati sezionati e i tessuti pancreatici raccolti.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.2.2 - 1.2.6 con i mouse rimanenti.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Digestione del pancreas
<ol>
	<li>Incubare le provette contenenti il tessuto pancreatico (in tampone digestivo) in un blocco riscaldante a 37 °C per 30 minuti con agitazione a 700 giri/min. Dopo 15 minuti, agitare manualmente i tubi capovolgendoli 3 - 4 volte e riposizionarli nel blocco riscaldante. 
	NOTA: Se si utilizza un blocco riscaldante senza capacità di agitazione, capovolgere i tubi ogni 5 - 10 minuti. Assicurati che il tessuto sia digerito correttamente. In caso contrario, tagliare il tessuto in pezzi più piccoli prima dell'incubazione o aumentare l'agitazione.</li>
	<li>Per fermare la digestione dei tessuti, posizionare le provette sul ghiaccio e aggiungere 10 ml di HBSS freddo a ciascuna provetta. Centrifugare le provette a 4 °C e 300 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.</li>
	<li>Risospensione:
	<ol>
		<li>Per i topi adulti e i cuccioli di p14 o più grandi, risospendere il pellet con 6 mL di PBS e filtrarlo attraverso un colino cellulare da 70 μm posizionato sopra una nuova provetta in polipropilene a raccolta conica da 15 mL. Per garantire il massimo recupero cellulare, lavare la provetta originale con altri 6 mL di PBS e filtrarla attraverso il filtro cellulare sulla provetta di raccolta.</li>
		<li>Per embrioni e cuccioli di età inferiore a p14, risospendere il pellet con 2 mL di PBS e filtrarlo attraverso un colino cellulare da 35 μm posizionato sopra una provetta da 5 mL per la raccolta di polistirene a fondo tondo (provetta FACS). Per garantire il massimo recupero cellulare, lavare la provetta originale con altri 2 mL di PBS e filtrarla attraverso il filtro cellulare sulla provetta di raccolta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifugare le provette a 4 °C e 300 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante. Rimuovere il liquido con cura, poiché le celle sono attaccate in modo lasco al tubo di polistirolo.</li>
</ol>
3. Preparazione di singole celle etichettate
<ol>
	<li>Preparazioni tampone: Per l'isolamento cellulare mediante FACS, preparare il tampone di smistamento mescolando PBS (senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio), siero fetale bovino (FBS) al 5% e EDTA 5 mM. Per l'analisi della citometria a flusso, preparare il tampone di analisi integrando il tampone di smistamento con azoturo di sodio allo 0,05%. Entrambi i tamponi possono essere conservati a 4-8 °C per un massimo di 2 mesi.</li>
	<li>Risospendere le celle nel buffer di ordinamento o di analisi. Risospendere ciascun pancreas isolato da embrioni e cuccioli di età inferiore a p7 in 1 mL, da cuccioli di età compresa tra p8 e un mese in 1,5 mL e da topi di età superiore a un mese in 3 mL. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 35 μm posizionato sopra una provetta di polistirene a fondo tondo (provetta FACS).</li>
	<li>Per i controlli di colorazione, prelevare aliquote da 50 a 100 μl dai campioni prelevati nella fase precedente (non più del 5% del volume totale del campione) e inserirle in nuove provette FACS; includere una provetta per ogni fluoroforo utilizzato, comprese le proteine DAPI e fluorescenti, nonché per un controllo non colorato><.
	NOTA: Quando si utilizzano topi transgenici con cellule che esprimono una proteina fluorescente, o quando il numero di cellule è limitato, includere un tessuto non transgenico come controllo di colorazione. Se le cellule che esprimono una proteina fluorescente vengono utilizzate senza ulteriore colorazione, procedere al passaggio 3.8.</li>
	<li>Far girare le cellule a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e aspirare il surnatante.</li>
	<li>Per il blocco, risospendere le cellule con una soluzione bloccante (100 μL di tampone di selezione o di analisi integrato con 1 μL di IgG di capra) e incubare per 30 minuti su ghiaccio.</li>
	<li>Per colorare i marcatori della superficie cellulare, preparare una miscela che includa tutti gli anticorpi coniugati con fluorofori desiderati in un volume di 100 μl per campione. Preparare 2 diluizioni di anticorpi in tampone di selezione o di analisi (cioè, diluire l'anticorpo per ottenere il doppio della concentrazione richiesta; se si desidera una diluizione finale di 1:200, diluire l'anticorpo 1:100). Senza lavare la soluzione bloccante, aggiungere 100 μl della miscela alle celle del campione per ottenere un volume di colorazione finale di 200 μl. Incubare per 30-60 minuti su ghiaccio e al buio.</li>
	<li>Per impostare i parametri di analisi o di selezione (vedere i passaggi 4.3 e 5.2), preparare provette aggiuntive che contengano solo uno degli anticorpi utilizzati (controllo della colorazione). Preparare 2 diluizioni di anticorpi nel tampone di selezione o di analisi (come descritto al punto 3.6). Assicurarsi di includere una singola diluizione di controllo della colorazione per ogni fluoroforo utilizzato, nonché un controllo non colorato. Senza lavare la soluzione bloccante, aggiungere 100 μL di miscele di anticorpi alle cellule (preparate al punto 3.3) per ottenere un volume di colorazione finale di 200 μL. Incubare per 30 - 60 minuti su ghiaccio e al buio.</li>
	<li>Lavare riempiendo ogni provetta con tampone di analisi o di selezione fino a un volume massimo di 4 mL. Facoltativamente, filtrare nuovamente le cellule attraverso un filtro cellulare da 35 μm (come descritto al punto 3.2).</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere con cura il surnatante.</li>
	<li>Risospendere i campioni nel buffer di analisi o di smistamento. Risospendere le cellule isolate da embrioni in 500 μL, da cuccioli di età inferiore a un mese in 1 mL, da 1 a 3 mesi di età in 2 mL e da topi di età superiore a 3 mesi in 3 mL. I controlli di colorazione possono essere risospesi in 300 μL di tampone.</li>
	<li>Aggiungere 200 ng/mL di DAPI alle cellule risospese per identificare le cellule morte. Assicurarsi di includere una provetta contenente cellule non colorate senza DAPI per le impostazioni del citometro. Procedere allo smistamento delle cellule (passaggio 4) o all'analisi (passaggio 5).</li>
</ol>
4. Ordinamento delle celle
<ol>
	<li>Preparazioni:
	<ol>
		<li>Per la selezione delle cellule prima dell'estrazione dell'RNA, rivestire una provetta di raccolta da 1,5 ml con un inibitore della RNasi immediatamente prima della cernita. A tal fine, aggiungere 1 mL di tampone di smistamento, contenente 0,01 U/mL di inibitore della RNasi, a una provetta di raccolta sterile da 1,5 mL. Dopo 5 minuti, agitare il tubo e rimuovere il liquido.</li>
		<li>Per la selezione delle cellule prima della coltura cellulare, aggiungere 3 mL di terreno di coltura sterile (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 20% di FBS, l'1% di L-glutammina e l'1% di penicillina-streptomicina) in una provetta sterile da 15 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prima di caricare una provetta in una selezionatrice FACS, agitarla brevemente per risospendere le cellule. Tenere i tubi rimanenti sul ghiaccio.</li>
	<li>Inizia analizzando i controlli di colorazione per determinare i parametri di smistamento (ad esempio, tensione e compensazione) e le porte di smistamento (ad esempio, popolazione cellulare totale, cellule DAPI-negative vive e popolazioni di cellule da ordinare).</li>
	<li>Una volta impostati i parametri di smistamento e i cancelli, caricare i campioni e avviare lo smistamento delle cellule nelle provette di raccolta. 
	NOTA: Le condizioni di smistamento dipendono fortemente dallo strumento. Utilizziamo una larghezza dell'ugello di 100 μm, una pressione di 23,1 psi e una velocità di smistamento massima di 5.</li>
	<li>Procedere all'estrazione dell'RNA o alla coltura di cellule selezionate. 
	NOTA: Per l'estrazione dell'RNA, centrifugare le cellule a 2.000 x g per 5 minuti e rimuovere il liquido in eccesso prima di continuare con un protocollo di estrazione standard. Per le cellule di coltura, se le cellule sono state selezionate in condizioni non sterili, lavarle due volte riempiendo la provetta con il terreno di coltura e centrifugandola a 300 x g per 7 minuti prima della coltura per ridurre al minimo la loro contaminazione.</li>
</ol>
5. Analisi cellulare mediante citometria a flusso
<ol>
	<li>Prima di caricare ogni provetta nel citometro, agitarla brevemente per risospendere le cellule. Tenere i tubi rimanenti sul ghiaccio.</li>
	<li>Iniziare analizzando i campioni non colorati e quelli con colorazione singola per determinare i parametri di analisi (ad esempio, tensione e compensazione).</li>
	<li>Una volta impostati i parametri di analisi, caricare ogni campione, compreso il controllo di colorazione, e registrare i risultati. Analizza i risultati ottenuti utilizzando il software di analisi della citometria a flusso.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, descriviamo un metodo per isolare e analizzare le cellule del microambiente pancreatico. Questo metodo può essere utilizzato per isolare le cellule mesenchimali dal tessuto pancreatico embrionale e adulto. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per isolare le cellule endoteliali dal pancreas adulto e neonatale 5,17. Tuttavia, potrebbe non essere adatto per ottenere una sospensione riproducibile di cellule epiteliali pancreatiche (protocolli alternativi sono descritti nei riferimenti 18, 23 e 24). Utilizzando questo metodo, le cellule marcate in fluorescenza, che esprimono proteine fluorescenti o immunocolorate per i marcatori di superficie, possono essere purificate mediante FACS o analizzate mediante citometria a flusso. L'RNA può essere estratto da cellule purificate per profilare il loro modello di espressione genica. In alternativa, le cellule purificate possono essere coltivate per stabilire una linea cellulare per la successiva analisi proteomica. Questo metodo consentirà la caratterizzazione dei fattori espressi dal microambiente del pancreas, che ne governano l'organogenesi, la fisiologia e la fisiopatologia.
Il mesenchima pancreatico supporta l'organogenesi tissutale favorendo la proliferazione dei precursori e delle cellule differenziate 5,9. Queste cellule hanno dimostrato di supportare l'espansione dei progenitori pancreatici derivati da cellule staminali embrionali umane (hESC) 17,25,26. Pertanto, delineare l'identità dei fattori mesenchimali embrionali faciliterebbe gli attuali sforzi per generare cellule beta produttrici di insulina da hESC e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) come potenziale cura per il diabete. Studi genetici sui topi hanno permesso l'identificazione di fattori di crescita, come Fgf10, che sono prodotti dal mesenchima per promuovere l'espansione dell'epitelio pancreatico durante le prime fasi di sviluppo del pancreas 3,9. Con l'obiettivo di identificare ulteriori fattori espressi nel mesenchima embrionale, abbiamo isolato queste cellule utilizzando la microdissezione catturata al laser, estratto il loro RNA ed eseguito l'analisi dell'espressione genica26. Tuttavia, oltre ad essere laborioso, questo metodo si basa sull'identificazione delle cellule in base alle loro caratteristiche morfologiche, il che ne limita l'uso alle fasi di sviluppo precedenti alla ramificazione dell'epitelio nel mesenchima circostante (cioè e12.5). Per caratterizzare le cellule mesenchimali nelle fasi successive dello sviluppo, abbiamo impiegato il metodo qui descritto 5,17.
Abbiamo usato questo metodo per analizzare l'espressione dei marcatori di superficie da parte del mesenchima pancreatico neonatale5. Inoltre, le cellule mesenchimali sono state isolate dal tessuto pancreatico embrionale e neonatale di Nkx3.2-Cre; I topi R26-EYFP, in base alla loro marcatura fluorescente in questa linea di topi, sono stati coltivati per stabilire linee cellulari17. L'analisi proteomica di queste cellule ha permesso l'identificazione di fattori secreti dal mesenchima pancreatico con la capacità di promuovere i progenitori pancreatici derivati da hESC17. Abbiamo inoltre utilizzato questo metodo di isolamento cellulare per purificare le cellule mesenchimali da tessuti pancreatici adulti per l'estrazione dell'RNA e l'analisi dell'espressione genica17. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per identificare geni e proteine espressi dal mesenchima pancreatico, con la capacità di supportare lo sviluppo delle cellule pancreatiche.
È stato inoltre dimostrato che le cellule mesenchimali pancreatiche svolgono un ruolo nella tumorigenesi del pancreas. Il PDAC è caratterizzato dalla formazione di uno stroma desmoplastico ricco di fibroblasti composto da fibroblasti, cellule immunitarie e ECM27. Sebbene si pensasse che lo stroma promuovesse lo sviluppo di molti tipi di cancro, è stato dimostrato che frena la progressione del PDAC 15,16,28. Ciò suggerisce che i componenti dello stroma pancreatico secernono fattori che inibiscono la tumorigenesi. Inoltre, i cambiamenti nella composizione cellulare dello stroma e nel fenotipo cellulare possono essere alla base del loro effetto sulle cellule epiteliali 15,16,28. Il metodo qui descritto può quindi aiutare a caratterizzare i diversi tipi di cellule che compongono uno stroma PDAC rispetto al tessuto pancreatico sano. Consentirebbe inoltre la purificazione dei diversi tipi di cellule stromali per caratterizzare potenziali cambiamenti nei loro profili di espressione genica durante la progressione del PDAC. Tuttavia, a causa dei cambiamenti nella composizione della ECM pancreatica durante la tumorigenesi27, possono essere necessari aggiustamenti dei parametri di digestione dei tessuti, come l'inclusione di ulteriori tipi di collagenasi o l'aumento del tempo di incubazione.

omeostasi energetica e la digestione degli alimenti nei mammiferi dipendono da una corretta funzione pancreatica. Il pancreas adulto è composto da due principali compartimenti cellulari: il esocrina e il sistema endocrino. Cellule esocrine, comprese le cellule acinari che producono e secernono enzimi digestivi e le cellule dei dotti che trasportano questi enzimi per l&#39;intestino, comprendono oltre l&#39;80% della massa pancreatica totale 1. Cellule endocrine, che includono le cellule beta produttrici di insulina e glucagone cellule alfa producono, sono organizzati nelle isole di Langerhans che sono incorporati nel tessuto esocrino e secernono ormoni per regolare i livelli di glucosio nel sangue 2. Cellule pancreatiche acquisiscono il loro destino differenziata attraverso una altamente regolamentato, processo a più gradi 3. L&#39;evidenza suggerisce che spunti estrinseci forniti da neuronale, endoteliali e cellule mesenchimali guidare la differenziazione delle cellule del pancreas e la proliferazione in tha embrione 3, 4, 5. Un esempio è il requisito dell&#39;aorta per la specifica dei primi precursori pancreatici 6. Più tardi in fase di sviluppo, le cellule endoteliali sono stati mostrati a svolgere un ruolo centrale nello sviluppo di entrambe le cellule endocrine e esocrine del pancreas e di promuovere la differenziazione delle cellule beta 4, 6, 7. Cellule mesenchimali hanno dimostrato di sostenere la sopravvivenza e l&#39;espansione di progenitori pancreatici comuni, principalmente attraverso la secrezione del fattore di crescita FGF10 8, 9. Abbiamo inoltre dimostrato che queste cellule supportano la proliferazione di endocrine ed esocrine precursori, nonché di cellule differenziate (comprese le cellule acinari e beta) nel pancreas embrionale 5. Recentemente, cellule mesenchimali sono stati ulteriormentedimostrato che regolano il differenziamento cellule endocrine 10. Nell&#39;adulto, funzione delle cellule beta e massa sono stati mostrati dipendere cellule nel loro microambiente, tra neuronale, immunitario, e le cellule endoteliali, nonché periciti 11, 12, 13. Durante la ferita, le cellule endoteliali sono stati mostrati a reclutare le cellule immunitarie al pancreas per promuovere la replicazione delle cellule beta 13. Le cellule endoteliali sono state ulteriormente mostrati per produrre componenti della matrice extracellulare (ECM) per sostenere l&#39;espressione di insulina e beta-cellule funzione 14. Abbiamo recentemente dimostrato l&#39;esigenza di pericytes isolotto per la funzione delle cellule beta 11. Infine, le cellule dello stroma pancreatica sono stati mostrati per regolare la progressione di adenocarcinoma del dotto pancreatico (PDAC) 15, 16. Tuttavia, l&#39;identità di spunti estrinseci che guidano lo sviluppo del pancreas, la funzione, e tumorigenesi sono in gran parte sconosciuti. Identificare spunti forniti dalle cellule del microambiente del pancreas richiede caratterizzare i geni e le proteine ​​espresse da queste cellule. Questo dipende isolare queste cellule dal pancreas per effettuare l&#39;espressione genica e proteomica e / o stabilire linee cellulari. Qui, vi proponiamo un metodo per isolare le cellule mesenchimali del microambiente del pancreas utilizzando tessuti digestione enzimatica e fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) di entrambi cellule immunofluorescently-etichettati o cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti. Questo protocollo è stato eseguito con successo per isolare e analizzare proteina fluorescente gialla (YFP) esprimente cellule mesenchimali del embrionale, neonatale e adulta del pancreas 5, 17.

<table><tbody><tr><td>Collagenasi P</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>DNasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>Le unità efficaci dovrebbero essere almeno 2.000 unitz/mL di</td></tr><tr><td>proteina Hanks' Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>01-862-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Siero IgG di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore dell'RNAsi</td><td>Invitrogen</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72 690</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>Tubo FACS. Assicurarsi che la provetta sia compatibile con il citometro a flusso da utilizzare, poiché ci sono lievi differenze nelle provette richieste tra le marche</td></tr><tr><td>Provetta da 5 ml con 35 &mu; filtro per celle m Tappo a scatto</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>tubo FACS</td></tr><tr><td>70 &mu; filtro cellulare m&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante con agitazione&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>ThermoFisher</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Streromicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria IIu</td><td></td></tr><tr><td>citometro a flusso</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolare e analisi cellule del pancreas mesenchima mediante citometria di flusso

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Il pancreas è composto da cellule epiteliali necessarie per la digestione del cibo e la regolazione della glicemia. È stato dimostrato che le cellule del microambiente del pancreas, comprese le cellule endoteliali, neuronali e mesenchimali, regolano la differenziazione e la proliferazione cellulare nel pancreas embrionale. Nell'adulto, è stato dimostrato che la funzione e la massa delle cellule produttrici di insulina dipendono dalle cellule del loro microambiente, comprese le cellule pericitarie, immunitarie, endoteliali e neuronali. Infine, è stato dimostrato che i cambiamenti nel microambiente del pancreas regolano la tumorigenesi del pancreas. Tuttavia, gli indizi alla base di questi processi non sono completamente definiti. Pertanto, caratterizzare i diversi tipi di cellule che compongono il microambiente del pancreas e profilare la loro espressione genica sono cruciali per delineare lo sviluppo e la funzione dei tessuti in stati normali e malati. Qui, descriviamo un metodo che consente l'isolamento di cellule mesenchimali dal pancreas di topi embrionali, neonatali e adulti. Questo metodo utilizza la digestione enzimatica del tessuto pancreatico di topo e la successiva selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) o l'analisi citofluorimetrica delle cellule marcate. Le cellule possono essere marcate mediante immunocolorazione per marcatori di superficie o mediante l'espressione di proteine fluorescenti. L'isolamento cellulare può facilitare la caratterizzazione di geni e proteine espresse nelle cellule del mesenchima del pancreas. Questo protocollo ha avuto successo nell'isolare e coltivare popolazioni di cellule mesenchimali altamente arricchite dal pancreas embrionale, neonatale e adulto di topo.

Il mesenchima pancreatico è necessario durante lo sviluppo e nell'età adulta. Il metodo descritto qui consente l'isolamento di cellule mesenchimali dal pancreas embrionale, neonatale e adulto. Le cellule mesenchimali, e nessun altro tipo cellulare, esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) nel pancreas di topi Nkx3.2-Cre;R26R-YFP5,11,17,19. Durante lo sviluppo, Nkx3.2 (noto anche come BapX1) è espresso dal mesenchima pancreatico, gastrico e intestinale embrionale, nonché in un sottoinsieme di somiti scheletrici19,20,21. Questo gene è stato espresso nel mesenchima pancreatico dal giorno e9,5 fino al giorno e11,5, consentendo l'espressione genica sotto il controllo di Nkx3.2-Cre a partire dal giorno e9,55,19,20. Sulla base di questa marcatura, le cellule possono essere purificate da tessuto pancreatico totale mediante citometria a flusso. Figura 2 mostra un'analisi mediante citometria a flusso di cellule singole provenienti da tessuti pancreatici embrionali, neonatali e adulti, isolati come descritto in questo protocollo. Mentre i tessuti pancreatici non transgenici non contenevano cellule fluorescenti, il tessuto pancreas di topi Nkx3.2-Cre;R26R-YFP di tutte le età analizzate contiene una popolazione cellulare distinta marcata con YFP (Figura 2; indicata con porte).
Seguendo il metodo qui descritto, le cellule che esprimono proteine fluorescenti possono essere purificate o analizzate mediante citometria a flusso, con o senza ulteriore immunomarcatura. Ad esempio, dopo il sorting basato sull'etichettatura fluorescente, le cellule mesenchimali possono essere coltivate per stabilire una linea cellulare (per almeno cinque passaggi), come mostrato in Figura 3A. Si noti la morfologia fibrocitica delle cellule in coltura, tipica delle cellule mesenchimali. Inoltre, questo sistema è stato utilizzato per analizzare l'espressione genica nelle cellule ordinate. A tal fine, l'RNA è stato estratto da cellule mesenchimali ordinate per sintetizzare il cDNA ed i livelli di espressione genica sono stati analizzati mediante qPCR. Tale analisi ha rivelato che le cellule ordinate esprimono il marcatore pan-mesenchimale vimentina (Figura 3B). Infine, l'espressione di marcatori di superficie da parte delle cellule pancreatiche può essere analizzata mediante citometria a flusso. Ad esempio, abbiamo isolato cellule dal tessuto pancreático di topi adulti Nkx3.2-Cre;R26R-YFP utilizzando il metodo qui descritto e le abbiamo marcate con la glicoproteina di superficie cellulare CD9, che è stata riportata come espressa dai fibroblasti22. Come mostrato in Figura 3C, tutte le cellule marcate fluorescentemente nel pancreas di Nkx3.2-Cre;R26R-YFP esprimono CD9.
<img alt="Stadi di sviluppo dell'embrione e15.5 e p4, immagini al microscopio che mostrano differenze strutturali." src="/files/ftp_upload/55344/55344fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Tessuto pancreatico embrionale e neonatale. Tratto gastrointestinale intero isolato, comprensivo di stomaco, milza, intestino e pancreas, di un embrione e15.5 (A) e di un cucciolo p4 (B). Il tessuto pancreatico è delimitato con una linea blu. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Diagrammi di dispersione della citometria a flusso; embrione, neonato, adulto; fluorescenza gialla rispetto ai dati di dispersione laterale." src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Le cellule mesenchimali sono marcate fluorescentemente nel tessuto pancreatico di topi Nkx3.2-Cre;R26R-YFP. Analisi mediante citometria a flusso di cellule pancreatiche isolate da topi non transgenici (pannelli a sinistra) e transgenici Nkx3.2-Cre;R26R-YFP (pannelli a destra) a diverse età: embrionale (A), neonatale (B) e adulta (C). Le cellule sono state analizzate per dispersione laterale (asse y) e fluorescenza gialla (asse x). Le finestre di selezione (indicate con "D") mostrano la presenza di una popolazione cellulare YFP+ nei topi transgenici, ma non nei controlli non transgenici. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Microscopia a fluorescenza, espressione della vimentina, diagramma scatter di citometria a flusso, analisi genica." src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Analisi delle cellule pancreatiche isolate. (A) Le cellule selezionate dal tessuto pancreatico di topi neonati Nkx3.2-Cre;R26R-YFP (come descritto nella Figura 2B) sono state coltivate per stabilire una linea cellulare. Le cellule in coltura sono state analizzate mediante fluorescenza (verde; pannelli destro e sinistro) e contrasto di fase (grigio; pannello destro). (B) Diagramma a barre che mostra i livelli di espressione di Vimentin1 (Vim1) in cellule selezionate per YFP+ provenienti dal tessuto pancreatico di topi adulti Nkx3.2-Cre;R26R-YFP (come descritto nella Figura 1C; verde) rispetto al tessuto pancreas non selezionato (nero). L'RNA è stato estratto ed è stata effettuata l'analisi dell'espressione genica mediante qPCR; l'espressione è stata normalizzata rispetto a Cyclophilin. N = 4. ***P &lt; 0,001. I dati rappresentano la media ± DS. (C) Analisi mediante citometria a flusso di cellule pancreatiche dissociate da topi adulti Nkx3.2-Cre;R26R-YFP immunomarcate con anticorpo anti-CD9 coniugato con alloficocianina (APC) e analizzate per APC (asse y) e fluorescenza gialla (asse x). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule nel microambiente del pancreas da tessuto embrionale, neonatale e adulto di topo, concentrandosi sull'isolamento di cellule mesenchimali. Questo metodo consente la profilazione dell'espressione genica cellulare e della secrezione proteica al fine di chiarire i segnali estrinseci che regolano lo sviluppo, la funzione e la tumorigenesi del pancreas.

Isolare e analisi cellule del pancreas Mesenchima mediante citometria di flusso

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule mesenchimali pancreatiche per l'analisi dell'espressione genica e dei marcatori di superficie. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo del pancreas, come ad esempio quali segnali vengono espressi dalle cellule mesenchimali e come influenzano lo sviluppo dell'epitelio. I principali vantaggi di questa tecnica sono la relativa semplicità, la rapidità e la possibilità di ottenere un'elevata resa di cellule purificate.Iniziare depositando gli organi interni in una piastra di coltura contenente HBSS e posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico. Staccare il fegato e i reni per esporre il pancreas, utilizzando pinzette fini per rimuovere il pancreas dallo stomaco, dal duodeno e dalla milza. Man mano che ogni pancreas viene raccolto, trasferire il tessuto in un tubo conico contenente un buffer digestivo appena preparato e porre il tubo sul ghiaccio.Dopo aver prelevato tutti i pancreas, trasferire i tessuti in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius per 30 minuti con agitazione a 700 giri al minuto, invertendo manualmente i tubi da tre a quattro volte dopo 15 minuti. Se dopo la prima metà della digestione sono ancora presenti pezzi di pancreas di grandi dimensioni, invertire il tubo ogni cinque minuti negli ultimi 15 minuti e incubare il tessuto per ulteriori cinque-dieci minuti, se necessario. Al termine della digestione, posizionare i tubi sul ghiaccio e aggiungere 10 millilitri di HBSS freddo a ciascun campione.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet in due millilitri di PBS fresco. Successivamente, filtrare le cellule attraverso filtri da 35 micron in provette di raccolta in polistirene rotonde da cinque millilitri e lavare le provette di digestione con due millilitri di PBS fresco, filtrando i lavaggi nelle rispettive provette di raccolta. Quindi, centrifugare nuovamente le cellule ed aspirare con attenzione i soprannatanti senza disturbare i pellet.Risospendere le cellule nel buffer di sorting in base all'età degli animali e filtrarle attraverso nuovi filtri cellulari da 35 micron in nuove provette di raccolta da cinque millilitri. Aliquotare volumi di cellule da 50 a 100 microlitri in nuove provette FACS per i controlli di marcatura, inclusa una provetta per ogni fluorocromo, il colorante per la vitalità, le proteine fluorescenti e un controllo non marcato. Lavare ogni provetta con fino a quattro millilitri di buffer di sorting e quindi centrifugare.Successivamente, risospendere i pellet nel buffer di sorting fresco in base all'età degli animali. Quindi colorare le cellule con il colorante di vitalità. Per il sorting cellulare prima dell'estrazione dell'RNA, immediatamente prima dell'inizio del sorting, rivestire una provetta sterile da 1,5 millilitri per la raccolta con un millilitro di buffer di sorting contenente l'inibitore di RNAse.Dopo cinque minuti, vortexare il tubo di raccolta ed eliminare il liquido. Vortexare il primo controllo di colorazione e inserire il tubo nel citometro a flusso per iniziare a determinare i parametri di selezione. Una volta impostati tutti i parametri di selezione, caricare i campioni e separare le cellule in tubi di raccolta da 1,5 millilitri.Quindi raccogliere le cellule ordinate mediante centrifugazione. Aspirare il soprannatante fino al pellet ed estrarre l'RNA seguendo i protocolli standard di estrazione dell'RNA. Qui vengono mostrati l'apparato gastrointestinale intero isolato, compresi stomaco, milza, intestino e pancreas, di un embrione al giorno embrionale 15,5 e di un cucciolo al quarto giorno postnatale.L'analisi mediante citometria a flusso di singole cellule provenienti da tessuti pancreatici embrionali, neonatali e adulti, isolati come appena dimostrato, rivela che i tessuti pancreatici transgenici di tutte le età analizzate contengono popolazioni cellulari distinte marcate con YFP. Dopo il sorting, queste cellule mesenchimali possono essere coltivate per stabilire una linea cellulare per almeno cinque passaggi. Si noti la morfologia fibrotica delle cellule in coltura, tipica delle cellule mesenchimali.Le cellule ordinate esprimono il marcatore pan-mesenchimale vimentina, come analizzato mediante qPCR dopo l'estrazione dell'RNA e la sintesi del cDNA. Inoltre, l'espressione del marcatore di superficie cellulare pancreatico isolato indica che tutte le cellule marcate con fluorescenza nel pancreas transgenico YFP esprimono CD9, una glicoproteina di superficie cellulare espressa secondo quanto riportato dai fibroblasti. Dopo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento dell'RNA possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo l'espressione genica delle cellule mesenchimali.

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