Isolare e analisi cellule del pancreas Mesenchima mediante citometria di flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule mesenchimali pancreatiche per l'analisi del loro gene e dell'espressione dei marcatori di superficie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo del pancreas, come ad esempio quali segnali sono espressi dalle cellule mesenchimali e come influenzano lo sviluppo epiteliale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è relativamente semplice e veloce e che consente una buona resa di cellule selezionate.

Inizia depositando gli organi interni in una piastra di coltura contenente HBSS e posizionando la piastra sotto uno stereomicroscopio. Staccare il fegato e i reni per esporre il pancreas usando una pinza sottile per rimuovere il pancreas dallo stomaco, dal duodeno e dalla milza. Man mano che ogni pancreas viene raccolto, trasferire il tessuto in una provetta conica contenente un tampone digestivo appena preparato e posizionare la provetta sul ghiaccio.

Quando tutte le pancreate sono state raccolte, trasferire i tessuti in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius per 30 minuti con agitazione a 700 giri/min, invertendo manualmente le provette tre o quattro volte dopo 15 minuti. Se dopo la prima metà della digestione sono ancora presenti grossi pezzi di pancreas, capovolgere la provetta ogni cinque minuti per gli ultimi 15 minuti e incubare il tessuto per altri 5-10 minuti, se necessario. Al termine della digestione, posizionare le provette sul ghiaccio e aggiungere 10 millilitri di HBSS freddo a ciascun campione.

Raccogliere le celle per centrifugazione e risospendere i pellet in due millilitri di PBS fresco. Successivamente, filtrare le cellule attraverso filtri da 35 micron in provette di raccolta in polistirene a fondo tondo da cinque millilitri e lavare le provette di digestione con due millilitri di PBS fresco, filtrando i lavaggi nelle provette di raccolta corrispondenti. Quindi centrifugare nuovamente le celle e aspirare accuratamente i surnatanti senza disturbare i pellet.

Risospendere le cellule in un tampone di selezione in base all'età degli animali e filtrarle attraverso nuovi filtri cellulari da 35 micron in nuove provette di raccolta da cinque millilitri. Aliquotare volumi di cellule da 50 a 100 microlitri in nuove provette FACS per i controlli di colorazione, tra cui una provetta per ogni fluoroforo, il colorante di vitalità, le proteine fluorescenti e un controllo non colorato. Lavare ogni provetta con un massimo di quattro millilitri di tampone di selezione e poi centrifugare.

Successivamente, risospendere i pellet in un tampone di selezione fresco in base all'età degli animali. Quindi colorare le cellule con il colorante vitalizzante. Per la selezione cellulare prima dell'estrazione dell'RNA, immediatamente prima dell'inizio della cernita, rivestire una provetta di raccolta sterile da 1,5 millilitri con un millilitro di tampone di selezione contenente inibitore dell'RNAsi.

Dopo cinque minuti, agitare la provetta di raccolta e rimuovere il liquido. Agitare il primo controllo di colorazione e caricare la provetta nel citometro a flusso per iniziare a determinare i parametri di selezione. Quando tutti i parametri di selezione sono stati impostati, caricare i campioni e suddividere le cellule in provette di raccolta da 1,5 millilitri.

Quindi raccogliere le celle selezionate mediante centrifugazione. Aspirare il surnatante fino al pellet ed estrarre l'RNA secondo i protocolli standard di estrazione dell'RNA. Qui viene mostrato l'intero tratto gastrointestinale isolato, compreso lo stomaco, la milza, l'intestino e il pancreas, di un embrione embrionale del giorno 15,5 e di un cucciolo postnatale del quarto giorno.

L'analisi citofluorimetrica di singole cellule di tessuti pancreatici embrionali, neonatali e adulti isolati, come appena dimostrato, rivela che i tessuti pancreatici transgenici di tutte le età analizzate contengono popolazioni cellulari distinte marcate con YFP. Dopo lo smistamento, queste cellule mesenchimali possono essere coltivate per stabilire una linea cellulare per almeno cinque passaggi. Si noti la morfologia fibrotica delle cellule in coltura tipica delle cellule mesenchimali.

Le cellule selezionate esprimono il marcatore panmesenchimale vementina, analizzato mediante qPCR dopo l'estrazione dell'RNA e la sintesi del cDNA. Inoltre, l'espressione isolata del marcatore della superficie delle cellule pancreatiche indica che tutte le cellule marcate in fluorescenza nel pancreas transgenico YFP esprimono CD9, una glicoproteina della superficie cellulare che si dice sia espressa dai fibroblasti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento dell'RNA per rispondere a ulteriori domande sull'espressione genica delle cellule mesenchimali.