L'uso di traccia Eyeblink condizionamento classico per valutare la disfunzione Hippocampal in un modello del ratto dei disturbi dello spettro fetale alcol

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare come l'uso del condizionamento classico del battito di ciglia, una forma di apprendimento associativo, possa aiutare a rilevare la disfunzione ippocampale in un modello di ratto di disturbi dello spettro alcolico fetale. I cuccioli di ratto neonatale vengono sfidati con un'alta dose di alcol, una concentrazione dell'11,9% in volume di alcol in volume in modo abbuffato. Durante l'equivalente di un terzo trimestre nell'uomo per quanto riguarda la crescita cerebrale.

Questo modello di esposizione all'alcol e la dose sono fattori chiave nella produzione di deficit cerebrali nel corso della vita, imitando i casi umani di FASD. Un'importante regione del cervello che viene compromessa dall'esposizione precoce all'alcol è l'ippocampo. Dopo che i ratti sono cresciuti come adulti, vengono esaminati per la disfunzione dell'ippocampo utilizzando il condizionamento classico del battito di ciglia.

Questa è una forma di apprendimento associativo di alto livello che si basa sull'integrità dell'ippocampo. Durante i giorni post-parto dal quarto al nove, i cuccioli di ratto vengono pesati ogni mattina e il loro peso viene registrato. I volumi di alimentazione vengono poi ottenuti da una tabella prestampata in base al peso corporeo.

Una soluzione alcolica all'11,9% in volume di volume viene somministrata ai cuccioli di ratto in due poppate separate da due ore. La dose giornaliera totale di alcol è di 5,25 grammi per chilogrammo al giorno. Questo paradigma di esposizione incontrollata fornisce 0278 mil di alcol per grammo di peso corporeo per poppata in soluzione di latte.

Estrarre il latte contenente alcol utilizzando una siringa sterile da un millilitro. Quindi spingere fuori la soluzione in eccesso per ottenere la quantità esatta necessaria. Immergere la punta del tubo PE-10 in olio di mais fresco.

Questo facilita l'inserimento. Misura la lunghezza del tubo PE-10 dalla bocca del cucciolo al suo stomaco. Se necessario, regolare il fermo PE-50 in modo che funga da guida visiva per il punto di arresto.

Inserire con cautela il tubo PE-10 nella bocca del cucciolo. In genere incontrerai una certa resistenza quando la punta incontra la gola. Manovrare il tubo fino a quando la punta non si piega all'ingresso dell'esofago.

Cerca di non far scivolare il tubo all'indietro, poiché potrebbe essere scivoloso con l'olio. Procedi lungo il suo esofago e quando la punta supera lo sfintere gastroesofageo, entrerà nel suo stomaco. Fermarsi a questo punto, stabilizzare la pompa ed erogare la soluzione.

Questo dovrebbe essere fatto a un ritmo lento. Rimuovere con cautela il tubo PE-10 ed esaminare il cucciolo per verificare la presenza di controlavaggio di soluzione, sangue o lesioni fisiche. Sostituisci il cucciolo con i suoi compagni di cucciolata se va bene.

Fare riferimento al protocollo scritto e all'elenco dei materiali per gli strumenti specifici utilizzati nella procedura di chirurgia delle palpebre. Sterilizzare il campo chirurgico con un disinfettante approvato e sterilizzare in autoclave in anticipo tutti gli strumenti e le forniture chirurgiche. Dopo aver indotto un'adeguata anestesia nel ratto con isoflurano, radergli la testa utilizzando un tagliacapelli, esponendo una quantità sufficiente di pelle per il sito di incisione e la palpebra sinistra.

La sua pelle viene sterilizzata eseguendo tre scrub alternati che coinvolgono alcool isopropilico al 70% e iodio povidone. Seguire la procedura standard per fissare il ratto al dispositivo stereotassico con le barre auricolari. Procedere con l'intervento chirurgico quando il ratto mostra un piano anestetico adeguato.

Usa la lama del bisturi per praticare un'incisione anteriore posteriore sulla linea mediana. Questa incisione dovrebbe esporre una superficie sufficiente anteriormente agli occhi e leggermente posteriore alla linea lambda sutoorale. Usa la lama del bisturi per raschiare via il periostio sopra il cranio, con attenzione, per non causare sanguinamento eccessivo.

Rimuovere il tessuto connettivo in eccesso e il sangue con un batuffolo di cotone e risciacquare l'area con soluzione fisiologica sterile tra i graffi. Praticare un foro che inizia direttamente dietro la sutura coronale su un osso parietale. Rimuovere eventuali detriti di sangue e ossa con un batuffolo di cotone.

Usa una pinza per schegge per afferrare una vite 0 80. Usa un cacciavite da gioielliere per fissare la vite al foro, stringi la vite quel tanto che basta senza danneggiare il tessuto cerebrale corticale, di solito tre o quattro giri completi. Seguire la stessa procedura per fissare le viti rimanenti.

Dovrebbero esserci due viti fissate bilateralmente dietro la sutura coronale e una sull'osso parietale destro, anteriormente alla sutura lambda. Afferrare la parte superiore della pelle nel sito di incisione dell'occhio sinistro con la pinza da medicazione da quattro pollici e dirigere la pinza da medicazione da tre pollici verso l'angolo di questo occhio. Prendi un ago da 26 gauge da 3/8 di pollice e inseriscilo nell'angolo della palpebra.

Ruotare l'ago in modo che il lato smussato sia rivolto verso l'alto. Inserire il secondo ago al centro della palpebra. Usa una pinza sottile per afferrare un filo 3T e inserirlo in uno degli aghi.

Non è necessario inserirlo completamente. Seguire la stessa procedura per il secondo filo 3T. Afferrare entrambi gli aghi con una mano mentre si afferra la piastra della testa con l'altra mano.

Con un movimento continuo, allontanare gli aghi dalla palpebra mentre si guida il tavolino della testa nella stessa direzione. Tenendo lo stadio della testa EMG con una mano, utilizzare le pinze da tre pollici con l'altra mano per avvolgere il filo 10T attorno a una o entrambe le viti sul lato destro. Riporre questo filo in modo che non sporga dalle viti.

Lo stadio di testa EMG deve essere centrato prima di passare alla fase successiva. Usa le pinze da medicazione da quattro pollici per creare una piccola tasca separando la pelle, cioè la fascia superficiale dal muscolo temporale. Con la tasca creata, usa le forbici dell'iride per tagliare via più tessuto connettivo, lavorando verso l'angolo dell'occhio sinistro.

Fare attenzione a non entrare troppo in profondità o tagliare i vasi sanguigni. Prendi un elettrodo bipolare e modella il cavo del filo in modo che possa essere montato lungo la curvatura del muscolo temporale. I due rebbi saranno situati posteriormente all'occhio sinistro e l'estremità inferiore dell'elettrodo bipolare sarà situata direttamente sopra il cranio.

Miscelare la polvere Ortho Jet nei componenti liquidi per ottenere una consistenza liquida. Applicare la pasta con una micro spatola tutto intorno al sito di incisione. Fai attenzione a non far cadere la pasta sugli occhi del topo e tienila contenuta.

Lasciare che l'Ortho Jet raggiunga uno stato semi-asciutto, quindi utilizzare la pinza per schegge per rimuovere l'acrilico in eccesso sullo stadio della testa EMG. E le filettature dell'elettrodo bipolare. Taglia via il filo 3T in eccesso, lasciando qualche centimetro con cui lavorare.

Rimuovere con cautela la schermatura in PTFE da ciascun filo 3T utilizzando la pinza per microdissezione. Ciò consente loro di entrare in contatto con il muscolo orbicolare dell'occhio. Utilizzare le pinze per microdissezione per creare ganci su ciascuna estremità dei fili 3T.

Taglia via il filo in eccesso, facendo attenzione a non tagliare così tanto che il filo rimanente si ritrae nella palpebra. Il cablaggio è realizzato internamente. La spina bipolare bianca viene collegata per prima e ciò consente l'erogazione dello stimolo ecografico di shock.

La spina arancione dello stadio principale EMG viene collegata successivamente. Registra l'attività elettromiografica mentre il ratto sbatte le palpebre. Entrambe le spine portano a un commutatore rotondo nella parte superiore del braccio che mantiene la continuità del segnale mentre il ratto si muove liberamente.

L'isolatore dello stimolo viene acceso e vengono effettuati i controlli hardware finali. Ciò include la regolazione della linea di base EMG a un livello visibile sullo schermo del computer. Nella prima sessione, l'intensità dell'urto viene inizialmente impostata a 4 milliampere e verrà aumentata in unità di 4 mil ampere ogni due prove.

Questa procedura di phasing in demand consente a un ratto di acclimatarsi allo stimolo d'urto. Entro l'ottava prova, l'intensità dello shock viene mantenuta a 1,6 milli ampere per tutta questa sessione e per tutte le sessioni successive. Un computer separato esegue un oscilloscopio digitale a quattro canali che ci consente di eseguire la diagnostica del segnale in tempo reale.

Nota il battito di ciglia che è stato emesso dal ratto nella scatola uno. L'oscilloscopio indica anche che il segnale EMG di base è relativamente pulito con basso rumore. Le webcam ci permettono anche di monitorare ogni ratto.

Questo è uno screenshot della versione 4.0 del software blink che mostra un'epoca di prova della durata di 1400 millisecondi. Nei primi 280 millisecondi, non vengono presentati stimoli per ottenere una misura dell'attività EMG di base. La linea gialla indica la linea di soglia in cui qualsiasi risposta EMG che superi i 4 volt al di sopra del valore basale medio pre-CS sarà ammissibile come risposta al battito di ciglia.

Lo stimolo della condizione di tono di 85 decibel viene erogato al punto temporale di 280 millisecondi. Il tono rimane attivo per 380 millisecondi, che corrispondono al punto temporale di 660 millisecondi. Dopo che si è spento, c'è un intervallo di 500 millisecondi in cui non vengono presentati stimoli. Questo è chiamato periodo di traccia in cui il ratto deve risolvere l'offset del tono CS con l'inizio dello shock US, ancora da erogare al segno di 1160 millisecondi.

Lo shock US dura 100 millisecondi. Naturalmente, l'ecografia shock suscita una risposta difensiva nota come risposta incondizionata, o UR, che viene misurata in una finestra temporale di 140 millisecondi. Una sessione di allenamento consiste in 100 prove.

Ci sono 90 prove in cui il CS e gli Stati Uniti sono accoppiati e ogni decimo prova viene consegnato solo il CS. Ci sono 10 prove solo CS per sessione. Questi studi ci permettono di sondare se si viene a conoscenza o meno dell'associazione CS US.

Sotto forma di risposte alle condizioni, o CR viene espresso quando l'ecografia shock non è presente. L'intervallo tra le prove è calcolato in media in 30 secondi, in modo che l'inizio di ogni prova non sia prevedibile. In una determinata prova, un ratto può lampeggiare in qualsiasi momento e il suo EMG verrà registrato dal software.

Qualsiasi battito di ciglia discreto che supera la linea di soglia sarà considerato una risposta in una delle quattro categorie in base a quando si verifica e all'epoca del processo. Se il ratto sbatte le palpebre durante i primi 80 millisecondi dopo l'inizio del tono CS, la risposta è considerata una risposta di trasalimento o SR. Questa è una risposta non associativa che è indicativa delle prestazioni motorie sensoriali, ma non dell'apprendimento dell'associazione CS US di per sé. Se lampeggia dopo il periodo SR ma prima che venga erogata la scossa US, allora ha emesso una risposta condizionata.

Come accennato in precedenza, la CR è la misura primaria dell'apprendimento associativo. Non ci si aspetta che la CR si sviluppi durante le prime fasi dell'allenamento, ma man mano che l'allenamento progredisce nel corso di molte prove e sessioni, questi tipi di risposte diventano più frequenti, più ampi e possono essere più tempestivi. Partizioniamo i CR in due tipi, CR totali e CR adattivi.

I CR totali riflettono la capacità di apprendimento generale, mentre i CR adattivi riflettono la capacità dell'animale di cronometrare bene il suo battito di ciglia. Immediatamente prima dell'inizio dello shock, come modo per prepararsi, il periodo di CR adattivo è di 200 millisecondi prima dell'insorgenza dello shock ecografico. Nei mammiferi con un ippocampo intatto, l'espressione di CR adattivi riflette un coinvolgimento ippocampale di alto livello nel cronometrare correttamente il battito di ciglia in relazione alla consegna dei due stimoli.

Per sua stessa natura, il condizionamento classico trace eyeblink è molto più difficile da acquisire rispetto al condizionamento classico delay eyeblink in cui il tono CS e lo shock US si sovrappongono nel tempo. Sebbene l'espressione delle CR possa variare da soggetto a soggetto e possa essere gravemente influenzata da sfide ai circuiti cerebrali discreti, si prevede che l'UR venga emessa durante ogni studio CS US accoppiato. In quanto tale, questa misura riflette le prestazioni motorie sensoriali e, come le risposte di trasalimento, non sono indicative dell'apprendimento dell'associazione CS US di per sé.

Nella seguente serie di videoclip, vedrai la configurazione del software e l'inizio dell'allenamento eyeblink. Il software blink viene attivato e vengono reclutati i due file pertinenti. Un file rat contenente i dati del soggetto e il file di condizionamento della traccia eyeblink

Il programma è impostato fino all'inizio della formazione. All'inizio dell'allenamento, nota che c'è un timer nella parte inferiore destra dello schermo che esegue il conto alla rovescia per la prova successiva. Ecco una registrazione video dal vivo della prima sessione, prova 15, in cui viene emesso un UR ma non si sono ancora sviluppati CR.

Ecco un replay a un terzo della velocità. Nella seguente serie di clip, vedrai gli screenshot dello stesso ratto di controllo non intubato mentre progredisce attraverso sei sessioni di allenamento. Alla fine emette sia CR totali che CR adattivi.

Ecco un video clip dal vivo della sesta sessione, prova 96, in cui vengono emessi due battiti di ciglia, uno un CR adattivo e l'altro un UR. Ecco un replay a un terzo della velocità. In questa clip finale, vedrai un video dal vivo di un ratto intubato dall'alcol nella sua ultima prova della sesta sessione, una prova solo CS, anche dopo 600 prove di allenamento, non emette una CR adattiva in modo affidabile. Dopo che i dati sono stati raccolti, vengono sottoposti a screening per prove errate, costituite da artefatti ad alto rumore e insolita attività EMG di base pre-CS utilizzando un algoritmo di errore integrato per rilevare i valori anomali.

Le buone prove conservate vengono ulteriormente analizzate per SR, UR, CR totali e CR adattive rispetto alla percentuale di risposte, all'ampiezza, alla latenza e ad altre misure critiche. In questa prima serie di risultati vengono mostrati i CR adattivi medi in sei sessioni di allenamento. Sia la percentuale che le misure di ampiezza erano statisticamente significative tra il gruppo intubato da alcol e i due gruppi di controllo dalla seconda alla sesta sessione.

Ciò indica che la frequenza e la forza delle CR adattive erano compromesse nei ratti esposti all'alcol durante lo sviluppo precoce. Le risposte medie incondizionate sono mostrate in questa seconda serie di risultati. Sia le misure di frequenza che quelle di ampiezza non erano statisticamente diverse tra i gruppi.

Questi risultati indicano che l'esposizione precoce all'alcol non ha compromesso la capacità dei ratti di sbattere le palpebre allo stimolo incondizionato, ma che la compromissione che hanno mostrato era dovuta a un fallimento nell'associare correttamente CS e US durante l'acquisizione. In questo esperimento, abbiamo esaminato la relazione comportamentale cerebrale determinando se l'esposizione all'alcol durante lo sviluppo che viene somministrata in modo simile a un'abbuffata influisce o meno sull'ippocampo come riflesso nei deficit e nel condizionamento classico del battito delle palpebre. Infatti, il condizionamento classico è uno strumento utile per valutare le conseguenze neurocomportamentali associate all'esposizione all'alcol durante lo sviluppo del cervello.

È molto versatile in quanto, modificando i parametri dello stimolo o i requisiti di apprendimento associativo, è possibile valutare anche l'integrità funzionale di diversi sistemi cerebrali al di fuori dell'ippocampo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione delle complessità coinvolte nella somministrazione di alcol ai cuccioli di ratto neonatale, nell'impianto di elettrodi e nell'esecuzione della procedura di test del battito di ciglia. Vi ringraziamo per aver guardato questo video.