Name: Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Impara a misurare la deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale con un modello microfluidico. Questo metodo consente di analizzare simultaneamente la funzione piastrinica e la coagulazione in condizioni di flusso.

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Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione per la ricerca e sviluppo del servizio Blood Red Cross-Flanders belga. Noi riconosciamo il sostegno finanziario fornito da &quot;Bijzonder onderzoeksfond&quot; (BOF - Fondo di ricerca speciale) presso l&#39;Università di Ghent concesso al progetto con numero di contratto BOF30290744.

Questo protocollo segue le linee guida etiche istituzionali per la ricerca su campioni umani, e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori coinvolti. L&#39;approvazione per gli esperimenti descritti qui è stato ottenuto dal Comitato Etico del Policlinico Universitario di Anversa (numero di riconoscimento 16/10/120). NOTA: le indicazioni di temperatura sono sempre a temperatura ambiente, se non diversamente specificato. Impostazione 1. microfluidica <ol><li> Preparare i canali microfluidica camera di flusso, tubi e perni di collegamento <ol><li> Risospendere il flaconcino collagene stock di vortex e poi diluita nella soluzione di glucosio isotonica fornito dal produttore ad una concentrazione finale di 50 mg / mL. NOTA: L&#39;uso di collagene equino tendine, fatta principalmente di tipo I fibrille. Il equina collagene di tipo I è spesso definito come &quot;Horm&quot; collagene ed è il gold standard per questo tipo di analisi, sia per la storica eragioni biologiche. collagene umano di tipo III può anche essere usato, ma queste fibrille coat meno, e la risposta piastrinica non è forte. Altre superfici rivestimento possono anche essere utilizzati, come fattore di von Willebrand, fibrinogeno, fibronectina, laminina, vitronectina, thrombospondin-1, o combinazioni di questi 3. </li><li> Prendere un nuovo, biochip microfluidica monouso con otto, canali e dimensioni parallele rettilinee, in mm, di 0,4 W x H x 0,1 20 L. Dispensare 0,8 ml di collagene nel canale (s) del biochip su un&#39;estremità e etichettare questo come l&#39;uscita. Riempire solo 5/6 della lunghezza di canale in modo che le fibrille di collagene non sono rivestite in ingresso del canale, poiché questo può causare intasamento, che ostacola un perfusione efficiente. </li><li> Incubare il biochip a 4 ° C per almeno 4 ore in un contenitore umidificato e sigillato. </li><li> Per studiare il fattore tissutale (estrinseco) coagulazione mediata in combinazione con il percorso di contatto (intrinseci), cappotto i canali con collaGen e fattore tissutale ricombinante umano (rhTF). <ol><li> Diluire rhTF in 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) -buffered salina (HBS, 0,9% (w / v) di NaCl, pH 7,4, 1: 3.000, concentrazione stock: 4.5 nM). </li><li> Rimuovere la soluzione di collagene di rivestimento attraverso l&#39;uscita. Pipettare 0,8 ml di rhTF in HBS (diluizione 1/500 della concentrazione magazzino, concentrazione finale: 9 PM) nella presa del canale, riempiendo 5/6 della lunghezza di canale, simile alla strategia collagene-coating. </li><li> Incubare il biochip per altri 30 min in un contenitore umidificato e sigillato. </li></ol></li><li> Riempire i canali rivestiti con tampone di bloccaggio (1.0% (w / v) di albumina di siero bovino e 0,1% (w / v) di glucosio in HBS), a partire dalla estremità (etichettata come ingresso). Riempire un numero uguale di canali a Y con lo stesso tampone bloccante in un biochip miscelazione. <ol><li> Assicurarsi che tutti i canali e le braccia canale sono completamente riempito di tampone di bloccaggio. Incubare entrambi biochips per almeno 1 h in un contenitore umidificato e sigillato. </li></ol></li><li> Per ciascun canale in uso, preparare due tubi di 8 cm lunghissimi una 2 cm e uno 46 centimetri di lunghezza. Inserire un perno in una estremità dei tre tubi di piccolo e in entrambe le estremità del tubo più lungo. </li></ol></li><li> Preparare la pompa di risciacquo <ol><li> Risciacquare tutti fluidica pompa e il tubo collegato con acqua distillata. </li><li> Sgrassare fusione del biochip con una precisione senza polvere pulire e alcool denaturato per rimuovere le stampe e polvere. </li><li> Riempire tutti i tubi con tampone di arresto prima di collegarli ai biochip. </li><li> Fissare il biochip rivestito sul palco microscopio automatizzato. Fissare il biochip miscelazione alla stessa altezza come la fase microscopio utilizzando un jack di laboratorio forbice. </li><li> Collegare il biochip rivestito con il biochip miscelazione utilizzando il tubo più lungo, lungo 46 cm. Assicurarsi che entrambi biochip sono ad una distanza tale che il tubo forma una linea flessibile, ma diritta. </li&gt; <li> Collegare un pin connettore siringa nel tubo compatibile Luer della pompa di risciacquo. Collegate alla estremità libera del 2-cm tubi e fissare l&#39;altra estremità all&#39;uscita del biochip rivestito. </li><li> Fissare i due tubi da 8 cm verso l&#39;ingresso del biochip miscelazione con i piedini. Mettere l&#39;estremità libera di ciascun tubo in un flaconcino di HBS. Risciacquare tutti i tubi e tutti i canali con 1 ml HBS. NOTA: HBS fluisce dal flacone attraverso il tubo 8 cm al chip miscelazione e attraverso la 46-cm tubi al chip rivestito (scorre dal rivestimento per la parte rivestita) a causa della forza di trazione della pompa di risciacquo. Questo passaggio rimuove il buffer di blocco e collagene poco aderito (o rhTF in biochip doppio rivestimento). </li></ol></li><li> Preparare le pompe di perfusione <ol><li> Aprire il software del driver delle pompe di perfusione. Inizializzare le pompe facendo doppio clic sull&#39;icona di siringhe nel software. </li><li> Selezionare il tipo di siringa che verrà utilizzato: 1 siringhe ml per la coagulazione BUffer e 2 siringhe ml per il sangue ricostituito. </li></ol></li><li> Collegare le siringhe alla costruzione biochip <ol><li> Scollegare la pompa di risciacquo e tutti i tubi, tranne quello che collega le due biochip. Il tubo scollegato viene riutilizzato nei seguenti passi. </li><li> Collegare il tubo di 2 cm con il suo pin del connettore della siringa al blocco Luer di un tubo di scarico a parete spessa. Riempire il tubo a pareti spesse con soluzione di pepsina standard utilizzando una siringa. NOTA: L&#39;aggiunta di pepsina alle inibisce il tubo di scarico e lisa post-perfusione coagulazione e quindi impedisce l&#39;intasamento del sistema alla fine posteriore. </li><li> Fissare l&#39;estremità aperta del tubo a pareti spesse con un morsetto Kocher. Collocare un contenitore per rifiuti adeguato con candeggina sotto per raccogliere il flow-through. </li><li> Fissare il tubo con il perno alla presa del biochip rivestito. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di campioni di sangue <ol><li>Raccogliere il sangue da un volontario sano e separare i suoi componenti 4 <ol><li> Raccogliere il sangue in un contenitore di acido etilendiammina-tetraacetico evacuati (EDTA). Utilizzare questo esempio solo per l&#39;esecuzione di un esame emocromocitometrico completo (CBC) utilizzando un analizzatore ematologico automatico. </li><li> Raccogliere il sangue in contenitori di citrato di sodio evacuati. 5 ml di sangue è necessaria per canale. </li><li> Mettere il campione (s) su una ricostituzione del sangue rotatore orizzontale in attesa. NOTA: Il test dovrebbe essere completata entro 3 h di salasso. campioni di concentrato piastrinico e di sangue intero sono ABO / RhD gruppo sanguigno abbinato. </li><li> Centrifugare per 13 min a 250 xg per preparare plasma ricco di piastrine (PRP). Non utilizzare il freno della centrifuga per evitare disturbi del pellet poco compresso. </li><li> Trasferire il PRP per un tubo di centrifugazione conica fresco. Centrifugare per 10 minuti a 4.500 g (con freno) per far sedimentare le piastrine e preparare il plasma povero di piastrine (PPP). Eliminare il platpellet elet. Incubare il PPP in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Trasferire i globuli rossi concentrati in una nuova provetta conica perforando il fondo quella originale con un ago 21 G. NOTA: La conta piastrinica residua nella frazione di cellule rossi concentrati è di 11 ± 4 x 10 3 per ml (media ± DS, n = 10). </li></ol></li><li> ricostituire il sangue <ol><li> Determinare l&#39;ematocrito dei globuli rossi concentrati previste al punto 2.1.6 utilizzando un analizzatore ematologico automatico. </li><li> Determinare la concentrazione piastrinica del concentrato piastrinico che verrà utilizzato per l&#39;analisi con un analizzatore ematologico automatizzato. </li><li> Calcolare il volume delle cellule imballati globuli rossi, concentrato piastrinico, e PPP che produrrà un ematocrito 40% e 250 x 10 3 piastrine / ml in un volume finale 2,5 mL. Mescolare questi per preparare il sangue ricostituito ed eseguire un CBC. NOTA: Altri titoli bersaglio di cellule può essere utilizzato, a seconda thdomanda di ricerca e. </li><li> Preparare un campione di controllo &quot;vuoto&quot;, in cui il volume di concentrato piastrinico viene sostituito dallo stesso volume di soluzione fisiologica per determinare la concentrazione di piastrine &quot;endogeni&quot; (cioè non-sangue piastrine bancari). </li></ol></li><li> Etichettare il sangue ricostituito per piastrine e fibrinogeno <ol><li> Pipettare 13 ml di 10,7 mg / ml soluzione di fibrinogeno Alexa Fluor 405-marcato (70 mg / ml concentrazione finale) in una provetta e aggiungere 1 ml di sangue ricostituito. NOTA: Il fibrinogeno è stato etichettato con un kit disponibile in commercio in base al manuale del costruttore. </li><li> Mescolare un altro 1 ml di sangue ricostituita in una provetta contenente 2 ml di 1 mm DiOC 6 (1 micron concentrazione finale) o contenenti 2 ml di 5 mm calceina AM (5 micron concentrazione finale). Aggiungere questo al tubo contenente il sangue con fibrinogeno, dando un volume finale di 2 ml di dalle piastrine e fibrinogeno-sil sangue nuto. NOTA: La scelta di colorante può dipendere dalla domanda di ricerca o la preferenza del ricercatore 5. Essere consapevoli del fatto che l&#39;eccitazione di qualsiasi colorante può causare artefatti fotochimici. </li><li> Mescolare delicatamente invertendo. Incubare il campione per 10 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Preparare il tampone di coagulazione <ol><li> Preparare tampone di coagulazione contenente 10 mM CaCl 2 e 3,75 mM MgCl 2 in HBS. Preparare 1 ml di tampone di coagulazione per un canale. </li><li> Filtrare sterilizzare il buffer di coagulazione attraverso un filtro da 0,2 micron. Pre-caldo di questo a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 3. perfusione Assay <ol><li> Focalizzare l&#39;ottica del microscopio alle fibre di collagene aderito al fondo del canale. Utilizzare contrasto di fase o il contrasto di interferenza differenziale (DIC). Selezionare &quot;Z corrente impostata per le regioni di piastrelle selezionate&quot; nel software esperimento per risolvere in modo digitale la messa a fuoco selezionata. </li><li> Definire una regione di interesse (ROI) nel canale selezionato utilizzando il software di acquisizione del microscopio. NOTA: Il ROI può essere qualsiasi superficie arbitrariamente scelto all&#39;interno di un canale di perfusione. Si consiglia non analizzare formazione di trombi e generazione di fibrina vicino alla entrata e uscita per evitare l&#39;acquisizione di immagini di trombi uniformemente distribuito. La superficie ROI deve contenere un numero significativo di trombi per consentire il livellamento della variabilità del segnale da singole piastrine. La posizione della ROI nel piano xy del canale è sempre fisso e determinato prima perfusione. Se necessario, la parte non rivestita del canale può essere incluso nell&#39;analisi per determinare se le piastrine si legano non specifico alla plastica biochip. </li><li> Preparare i campioni per la perfusione <ol><li> Montare una siringa da 1 ml contenente 1 ml di tampone di coagulazione pre-riscaldato nella pompa di perfusione. </li><li> Mescolare il sangue pre-riscaldato ricostituito capovolgendo delicatamente e carico 2 mL in un mL siringa 2. </li><li> Assicurarsi che tutta l&#39;aria viene rimosso da entrambe le siringhe e collegare ciascuna ad un tubo da 8 cm con un pin del connettore siringa. </li><li> Prime connettori e tubi di entrambe le siringhe ad alta velocità (400 ml / min) e fermarsi quando tutto è riempita con tampone di coagulazione del sangue o. NOTA: innesco del tubo, il buffer di coagulazione del sangue e ricostituito saranno immediatamente miscelati nel canale a forma di Y del biochip miscelazione quando iniziare l&#39;esperimento, evitando l&#39;introduzione di aria alle camere di perfusione. </li></ol></li><li> Utilizzando perni, fissare l&#39;altra estremità del tubo sia alle gambe di divisione del canale a forma di Y nella biochip miscelazione. La gamba inferiore è utilizzata per perfusione tampone coagulazione e la coscia di sangue ricostituito. </li><li> Inizia l&#39;esperimento avviando perfusione a 4,4 ml / min per buffer di coagulazione e 44 ml / min per il sangue ricostituito. Rimuovere la pinza Kocher all&#39;uscita del tubo di scarico per permettere perfusione. NOTA: portata può essere modificata a seconda della domanda di ricerca. Avviare un cronometro per determinare il tempo tra l&#39;inizio dell&#39;esperimento e l&#39;inizio di acquisizione delle immagini in tempo reale. </li><li> Registrazione di immagini ogni 10 s per 30 min in tempo reale utilizzando il software di acquisizione e l&#39;esperimento del microscopio. Avviare la registrazione quando il mix di sangue ricostituito e buffer di coagulazione entra nel biochip rivestito montato sul palco microscopio. NOTA: Altre Serie tempo può essere utilizzato a seconda del setup sperimentale. Utilizzare un ingrandimento 100X (obiettivo 10X e 10X lenti). </li></ol> 4. terminazione Experiment <ol><li> Terminate le pompe e acquisizione delle immagini dopo 30 min o prima, se il segnale è saturo. Staccare tutti i tubi e siringhe e gettarli come rifiuti a rischio biologico. </li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Determinare la crescita trombo (fluorescenza verde) e la formazione di fibrina (viola fluorescence) cinetiche con il software di analisi di immagine. I seguenti comandi sono specifici per il software utilizzato qui: <ol><li> Aprire la lavorazione dei plugin: cuciture per unire le immagini side-by-side per ogni punto del tempo. </li><li> Aprire il plug-in di analisi dell&#39;immagine per determinare la copertura della superficie delle piastrine. </li><li> Aprire la Misura plugin. Definire il ROI disegnando un rettangolo di regione tra cui tutte le fibre trombi e di fibrina; in questo protocollo, il ROI è un rettangolo di 637 millimetri 2. Selezionare la scheda Tutte Vista per includere tutti i punti di tempo registrati. </li><li> Usare Creare tabelle per generare automaticamente un foglio di calcolo che conterrà il valore di intensità di fluorescenza media della regione rettangolo selezionato di ogni punto di tempo. </li><li> Salvare i fogli di calcolo in formato XML. </li></ol></li><li> Aprire un foglio di calcolo in un foglio di calcolo per ulteriori calcoli. <ol><li> Sottrarre l&#39;iniziale (backgrouND) il valore di tutti i dati. </li><li> Tracciare il segnale fluorescente in funzione del tempo di perfusione sia verde (piastrine) ei viola coloranti (fibrina). NOTA: Prendere in considerazione il tempo che intercorre tra l&#39;inizializzazione della pompa e il punto di partenza effettiva di acquisizione delle immagini. La formazione del trombo è generalmente un processo in due fasi in questo modello: (1) &quot;lento&quot; adesione piastrinica (cioè, adesione) al collagene immobilizzato seguito da (2) crescita trombo coagulazione-guidato con un aumento &quot;rapida&quot; sia vincolante piastrinica ( cioè, accumulo) e la deposizione di fibrina (cioè, coagulazione) (Figura 1). </li><li> Calcolare la pendenza della adesione piastrinica e l&#39;accumulo mediante regressione lineare; questo versante produce piastrine cinetica di crescita trombo in ogni fase della sua formazione. </li><li> Calcolare la pendenza della fibrina coagulazione ed estrapolare questa linea di intercettare l&#39;asse X, determinare il momento di insorgenza. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La trasfusione di concentrati piastrinici è prescritto per il paziente trombocitopenica per prevenire o fermare l&#39;emorragia. Il suo impatto clinico è stato recentemente evidenziato in una rassegna storica di leucemia acuta 12, ricordando che un aumento dei tassi di sopravvivenza dei pazienti pediatrici negli anni sessanta e settanta sono stati in gran parte attribuibile al miglioramento (piastrine) medicina trasfusionale. concentrati piastrinici sono utilizzati anche per arginare sanguinamento nel trauma acuto o durante l&#39;intervento chirurgico. In queste condizioni, le piastrine con eccellenti proprietà procoagulanti che avviare rapidamente emostasi sono preferiti, ma concentrati piastrinici sono preparati da donazioni di donatori volontari e, a differenza farmaco farmacologico, standardizzati per la preparazione solo, non per la composizione (chimica). Pertanto, molte domande nel settore bancario sangue sono risposta, compresi quelli sulle modalità ottimali di donazione, condizioni di conservazione, e le pratiche trasfusionali. Nel campo della platelet (trasfusione) biologia, molte domande sulla clearance delle cellule dalla circolazione, il contributo delle piastrine trasfuse per emostasi, o la loro immunologia anche rimanere senza risposta. Numerose tecniche di laboratorio per l&#39;analisi della funzione piastrinica sono disponibili, ma questi lo più affrontare un aspetto singolare della funzione piastrinica, come aggregazione o degranulazione 13. Per valutare in generale piastrine e concentrati piastrinici, modelli completi di emostasi sono indispensabili, e queste devono includere idrodinamica. Reologia del sangue è essenziale per interpretare correttamente il comportamento delle piastrine durante emostasi 14, 15 o trombosi 16, anche se l&#39;anticoagulazione impedisce Ca 2+ e / o trombina di partecipare in presenza di citrato o eparina, rispettivamente, 2. Per studiare l&#39;interazione tra coagulazione e la funzione delle piastrine in condizioni di flusso 17, È necessario 18, normale produzione di trombina, e quindi senza Ca 2+ pure. La configurazione sperimentale per studiare l&#39;emostasi in queste condizioni è complesso, perché le misure di prevenzione &quot;manufatto&quot; o l&#39;attivazione incontrollata della coagulazione dovrebbe essere presa il più possibile. Inoltre, molti gruppi di ricerca specializzati utilizzano misura dell&#39;hardware 19, 20, che causa notevole variabilità inter-laboratorio 5. Limiti tipici di questo approccio sono l&#39;uso di recipienti di forma rettangolare, profili di flusso non pulsatile, e non umani rivestimenti superficiali 5. Il test che descriviamo qui utilizza strumenti disponibili in commercio e può quindi essere adatto per la standardizzazione. Poiché la reazione cascata della coagulazione è facilmente attivabile volta sangue non è contenuto all&#39;interno del corpo umano, ricalcificazione controllato è un passo fondamentale. To raggiungere questo obiettivo, l&#39;aggiunta di Ca 2+ deve essere rinviata a poco prima della perfusione sulla superficie collagene reattiva, perché quando il buffer di 2+ Ca viene fornito sfuso al sangue statica, la coagulazione avviene inevitabilmente luogo, alla fine intasamento della tubazione e polarizzazione dei dati interpretazione (dati non mostrati). La soluzione a questo problema è di pompare il buffer Ca 2+ e il sangue separatamente, consentendo la miscelazione da forze convettivi e diffusivi durante la perfusione nel suo cammino verso la camera di analisi. miscelazione completa è raggiunto in un segmento di 46 cm di tubo fra le camere di miscelazione e di analisi. Questa lunghezza è stata calcolata per il tempo di permanenza ottimale dei reagenti per mescolare basato sulle leggi fondamentali della massa e il trasporto convettivo 21 durante la perfusione alla portata utilizzato (1.000 s -1). Questo approccio si è dimostrato controllabile e riproducibile. Contatto attivazione della coagulazione è a volte visto come un artefatto di sempliceprelievo di sangue e da evitare quando si interpretano i tempi di coagulazione. Pertanto, abbiamo dimostrato che, in assenza di inibitori della coagulazione contatto indotta dalle ore 16.7 min (± 3,7 min) della perfusione. In presenza di CTI di inibire l&#39;attivazione contatto FXIIa-mediata, coagulazione non è iniziata durante il corso arbitrariamente definito dell&#39;esperimento (30 min). Questa finestra di sperimentazione è sufficientemente lungo per discernere i campioni che sono pro o antitrombotica. Anche se la coagulazione dall&#39;attivazione contatto può essere una conseguenza indesiderata di sangue contatto con superfici artificiali, i nostri dati dimostrano un chiaro effetto dose biologica delle piastrine. Questo può essere importante per la medicina trasfusionale, perché recenti scoperte su FXII, piastrine polifosfati 10, la distribuzione fosfatidilserina 22, e microparticelle piastrine 23 sono in realtà rivalutato contatto via coagulazione come un importante contributo alla emostasi, especialmente nel contesto di trombosi 24. Per esempio, la resa variabile trasfusioni di piastrine nei pazienti o espressione fosfatidilserina variabile piastrine paraboliche possono quindi indurre variabilità dell&#39;effetto terapeutico se coagulazione successo è mostrato a dipendere da questi fattori. In co-immobilizzare lipidated rhTF con il collagene, il percorso di coagulazione estrinseca, o pathway TF, viene attivata durante la deposizione delle piastrine sul collagene. Questo si estende il saggio al suo modo più completo, come un modello per le lesioni che portano il sangue a contatto con le cellule TF-cuscinetto e tessuto. I nostri dati mostrano che co-immobilizzazione di collagene e TF diminuisce il momento della coagulazione insorgenza ma non modifica la velocità di coagulazione. Da notare, la quantità di rhTF immobilizzato sulla superficie è una variabile importante in questo modello 25, 26 e deve essere standardizzato entro un dato studio. Nel presence della CTI, il percorso TF può essere studiato esclusivamente (non mostrato) per l&#39;attivazione contatto viene impedito. In conclusione, il nostro apparato sperimentale combina un modello di trasfusioni per la ricostituzione del sangue trombocitopenica con le piastrine paraboliche e un modello di emostasi dalla deposizione delle piastrine calcio-dipendente e la formazione di fibrina sotto flusso idrodinamico. Questo test sarà utilizzato per rispondere a domande sulla natura procoagulante delle piastrine paraboliche e le tecniche di preparazione concentrato effetti piastrine avere su questo.

emostasi primaria e secondaria sono stati originariamente concepita come due processi biochimici relativamente separabili. emostasi primaria è stato visto come un importante contributo in condizioni di flusso arterioso, con un ruolo chiave per le piastrine, mentre emostasi secondaria è stato visto a dominare la coagulazione sotto il flusso di sangue venoso, permettendo la cascata della proteasi per formare fibrina insolubile. Gli ultimi decenni hanno rimodellato questa visione tradizionale sostanzialmente, riconoscendo che l&#39;attivazione piastrinica e la coagulazione sono interdipendenti e sono ugualmente importanti processi durante l&#39;emostasi fisiologica e patologica in tutti i (non estremi) ambienti idrodinamici. Questo punto di vista è stato tradotto in clinica, dove sono sempre più utilizzati test ideati per misurare completo coagulazione del sangue intero, anche se con molte domande restanti rilevanza, l&#39;applicabilità e l&#39;utilità 1. Abbiamo recentemente pubblicato una analisi funzionale di piastrineconcentrati usando camere di flusso microfluidica rivestite con collagene fibrillare in un modello in vitro di trasfusioni 2, con campioni contenenti livelli normali di globuli rossi, plasma e piastrine. Questo metodo utilizza l&#39;eparina o irudina sangue anticoagulante, che non implica alcun o coinvolgimento limitato di emostasi secondaria, che dipende dalla produzione di trombina e calcio ionizzato (Ca 2+). Per sostenere la formazione di trombina e, quindi, per includere tutti gli aspetti della emostasi sotto flusso microfluidica, abbiamo sviluppato un metodo complementare sulla stessa piattaforma tecnica, tra cui la connessione ora Ca 2+. In questo modo, la deposizione piastrinica e la formazione di fibrina possono essere studiate, di nuovo in un modello di trasfusione di piastrine, di valutare la qualità concentrato piastrinico. In questo metodo, le piastrine e fibrinogeno sono etichettati con fluorofori che sono completamente separati spettri di emissione. a due colori, il video microscopia in tempo reale quindi permette l&#39;analisi diadesione piastrinica primario, nonché l&#39;iniziazione coagulazione e deposizione di fibrina. Una variabile importante in questo tipo di saggio è ricalcificazione, perché l&#39;aggiunta di Ca 2+ al sangue statico, prima perfusione, provoca inevitabilmente coagulazione contatto avviato nel contenitore. Questa iniziazione sarà pregiudizi la lettura a causa di intasamento dei tubi e biochip insenature prima di perfusione. Pertanto, nel nostro metodo, citrato sangue anticoagulato e un buffer -contenente Ca 2+ vengono pompati separatamente attraverso le cosce di una camera di ingresso a Y. I componenti sono miscelati durante la perfusione prima di entrare in camera di analisi rivestito con solo o in combinazione con il fattore tissutale umano ricombinante (rhTF) collagene. Adattando le velocità di flusso delle pompe separate e la concentrazione di Ca 2+ nel buffer, una diluizione 10% del campione di sangue finale avviene. Usando questo protocollo esteso, dimostriamo il contributo di coagulifattore di XII (FXII) e la concentrazione delle piastrine di contattare via coagulazione iniziazione sotto flusso. I nostri dati mostrano anche che rivestendo rhTF fianco collagene, il fattore tissutale percorso può essere misurata in concomitanza.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD</td><td>A00434</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 2 ml</td><td>BD</td><td>307727</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>A30100</td><td>È stato seguito il manuale del produttore per l'etichettatura del fibrinogeno</td></tr><tr><td>BD vacutainer Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>Ago per prelievo sangue con supporto premontato</td></tr><tr><td>Tubo vacutainer BD con EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>provetta vacutainer BD con citrato di sodio</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Tampone bloccante</td><td>nella preparazione della casa</td><td>nella preparazione della casa</td><td>1,0% (p/v) di albumina sierica bovina e 0,1% (p/v) di glucosio nella</td></tr><tr><td>sonde molecolari</td> HBS<td>Calcein AM</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di coagulazione</td><td>nella preparazione della casa</td><td>preparazione in casa</td><td>10 mM CaCl2 e 3,75&nbsp; mM MgCl2 in provetta conica HBS</td></tr><tr><td>15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>provetta conica 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di mais (CTI)</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>CTI</td><td></td></tr><tr><td>Alcool denaturato</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td>3,3&prime;-Dioxilossacarbocianina ioduro - 1 mM soluzione in</td></tr><tr><td>DMSO Pompa microfluidica Exigo</td><td>Cellix</td><td>EXIGO-PC-FS7.0-MF</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3879</td><td>Marcato internamente con AF 405 - concentrazione stock 10,7&nbsp; mg/mL</td></tr><tr><td>Analizzatore ematologico</td><td>Sysmex</td><td>pocH-100i</td><td></td></tr><tr><td>HEPES soluzione salina tamponata (HBS)</td> <td>in preparazione in casa</td> preparazione <td>in casa</td><td>10 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanesolfonico acido (HEPES) soluzione salina tamponata (0,9% (p/v) NaCl), pH 7,4</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Collagene nativo del tendine equino (tipo I) La soluzione isotonica di glucosio per diluire il collagene è integrato</td></tr><tr><td>Scatola umidificata</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Incubazione bagnomaria</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>dotato di colibri-LED e telecamera CCD ad alta risoluzione</td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>con pipetta Multiflow8</td></tr><tr><td></td><td>Marca</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette 100-1000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale per concentrato piastrinico</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Salviette di precisione</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di pepsina&nbsp;</td><td>Strumento Hanna</td><td>HI7073L&nbsp;</td><td>2 g di pepsina per 75 mL di soluzione, Soluzione di pulizia delle proteine con pepsina</td></tr><tr><td>Fattore tissutale umano ricombinante Innovin</td><td>Dade Berhing</td><td>B4212-40</td><td>rhTF con fosfolipidi</td></tr><tr><td>sintetici Microscopio software&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>Dispositivo di aggancio sterile</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Rullo per tubi</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Sigillante per tubi</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 pin connettore siringa</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Biochip rivestito</td></tr><tr><td>Vena8 Aghi</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td></td></tr><tr><td>Tubi Vena8</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td></td></tr><tr><td>VenaDelta Y1 Biochips</td><td>Cellix</td><td>VDY1-400-100-01-02</td><td>Miscelatore</td></tr><tr><td>a vortice</td> per biochip <td>di miscelazione VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>ZEN2012 software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un microfluidic flusso camera modello per la trasfusione di piastrine e emostasi misure deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

modelli microfluidica di emostasi valutare la funzione piastrinica in condizioni di taglio idrodinamica, ma in presenza di anticoagulanti, questa analisi è limitata al solo deposizione delle piastrine. Il rapporto intricato tra Ca 2+ funzione di coagulazione e delle piastrine-dipendente richiede un attento e controllato ricalcificazione di sangue prima dell&#39;analisi. Il nostro programma di installazione utilizza un canale di miscelazione a forma di Y, che fornisce concentrato / Mg 2+ buffer di Ca 2+ al sangue che scorre appena prima di perfusione, consentendo una rapida ricalcificazione senza stasi campione. A differenza di dieci volte della velocità di flusso tra i due serbatoi minimizza diluizione. Il sangue ricalcificato viene perfuso in una camera di analisi collageno-rivestito ed etichettatura differenziale permette imaging in tempo reale sia deposizione di piastrine e di fibrina mediante fluorescenza microscopia video. Il sistema utilizza solo strumenti disponibili in commercio, aumentando le possibilità di standardizzazione. Ricostituzione di throsangue mbocytopenic con piastrine da sopraelevata si concentra, inoltre, modelli di una trasfusione di piastrine, dimostrando il suo impiego in questo settore di ricerca. dati esemplificativi dimostrato che la coagulazione insorgenza e deposizione di fibrina sono linearmente dipendente dalla concentrazione piastrinica, confermando il rapporto tra emostasi primaria e secondaria nel nostro modello. In un lasso di tempo di 16 min perfusione, attivazione contatto non ha avuto luogo, nonostante ricalcificazione alla normalità Ca 2+ e livelli di Mg 2+. Quando fattore di coagulazione XIIa stata inibita da inibitore della tripsina di mais, questo lasso di tempo era anche di più, indicando una gamma dinamica considerevole in cui le variazioni di natura procoagulante delle piastrine possono essere valutati. Co-immobilizzazione del fattore tissutale con il collagene ha ridotto significativamente il tempo di insorgenza della coagulazione, ma non il suo tasso. L&#39;opzione per studiare il fattore tissutale e / o il percorso di contatto aumenta la versatilità e l&#39;utilità del saggio.

L&#39;analisi dei dati in tempo reale grezzo viene descritto in Figura 1. Innanzitutto, le piastrine aderiscono alla superficie reattiva, con un conseguente aumento costante fluorescenza verde registrata (figura 1A, i), chiamati adesione. Durante questa fase, c&#39;è poco fluorescenza viola, indicando che la fibrina non è o è solo marginalmente formato (Figura 1B). All&#39;inizio della coagulazione, viola-fluorescenti depositi di fibrina rapidamente (iii), e durante quel tempo, piastrine verde fluorescenza aumenta a circa lo stesso tasso, designati qui come accumulo di piastrine (ii). Un singolo esperimento torna così tre tassi di aumento di fluorescenza (i, ii, e iii) come marker surrogato per la velocità con cui piastrine e fibrina deposizione avviene in questo modello. Inoltre, un momento di insorgenza della coagulazione (momento-di-insorgenza (iv)) viene estrapolato, che è un determinante di piastrinepotenziale procoagulante. In assenza di TF, coagulazione iniziazione è lento e primariamente attraversa il percorso di contatto dove il complesso tenase intrinseca attiva FX mediante attivazione diretta FIX 6 da FXI e / o FXII. Per dimostrare la dipendenza FXII, 4 micron di inibitore della tripsina mais (CTI) è stato aggiunto per inibire FXII attivato (FXIIa) 7. Questa inibizione non ha influenzato l&#39;adesione delle piastrine (Figura 2A), ma la coagulazione non è stato avviato per la durata totale arbitrariamente definito dell&#39;esperimento perfusione (Figura 2B e supplementare Video 1). In vitro, il percorso contatto può essere avviata da materiali estranei come il vetro, o in saggi clinici utilizzando un materiale minerale, come il caolino. In vivo, piastrine attivate forniscono la carica negativa 8 &lt;/ sup&gt; attraverso l&#39;esposizione di membrana di fosfolipidi acidi 9, come fosfatidilserina, e / o attraverso il rilascio di polifosfati (polipo) 10, 11. I nostri microfluidici imita test in tempo reale il secondo perché, in un intervallo di concentrazioni di piastrine, la reazione emostatico dipendeva dalla conta piastrinica (Figura 3). Aumentando il numero di piastrine nel campione ricostituito, il tasso di aderenza (Figura 3A), di accumulo (Figura 3B, verde), e la coagulazione (Figura 3B, viola) aumentato linearmente. Il momento-di-insorgenza significativamente ridotto (Figura 3C) aumentando la concentrazione di piastrine, suggerendo che è richiesto un numero soglia (attivato) depositato piastrine per innescare la coagulazione. Al momento danni ai tessuti in vivo, tuttavia, le cellule TF-cuscinetto Avrònitiate la coagulazione del sangue attraverso il FVIIa-TF complesso tenase estrinseca in presenza di Ca 2+. Questo è imitato nel nostro setup sperimentale per post-rivestimento delle camere di perfusione collagene che contiene con lipidated rhTF. In un&#39;analisi accoppiato di canali rivestiti con solo o in combinazione con rhTF collagene, coagulazione insorgenza era significativamente più veloce (Figura 4A). Il tasso di adesione piastrinica non era lineare, quindi non regressione lineare potrebbe essere eseguita (dati non mostrati). Sia il tasso di coagulazione e l&#39;accumulo di piastrine non erano differenti tra le condizioni (Figura 4B-4C, supplementare Video 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55351/55351fig1.jpg" /> Figura 1: L&#39;analisi di regressione di adesione piastrinica e la coagulazione in camere di perfusione microfluidica. Questa figura chiarisce i parametri derivati ​​da tempo reale di fluorescenza dati grezzi<html> acquisite durante il flusso di sangue ricalcificato su una superficie reattiva. (A) Media intensità della fluorescenza verde mostra deposizione piastrinica in funzione del tempo di perfusione. La curva descrive un processo bimodale che inizia con (i) aumentando lentamente adesione piastrinica lineare seguita da (ii) in rapida crescita accumulo lineare. Entrambe le parti lineari della curva sono regrediti e la pendenza di queste descrive due aliquote di formazione di trombi per fluorescenza piastrinica; (I) adesione e (ii) di accumulo. (B) Significa intensità della fluorescenza viola mostra la deposizione di fibrina in funzione del tempo. Durante adesione piastrinica, fluorescenza viola è essenzialmente assente, mentre sviluppa rapidamente seguente inizio della coagulazione. L&#39;(iv) momento-del-insorgenza è definita come l&#39;intercetta con l&#39;asse x della regressione lineare estrapolata di (iii) la seconda fase di formazione di trombi per fluorescenza fibrina designato qui come coagulazione.ef = target &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55351/55351fig2.jpg" /> Figura 2: In assenza di TF, coagulazione in camere a flusso perfusione collagene rivestite dipende FXIIa. Perfusione microfluidica di sangue ricostituito contenente CTI o buffer di controllo (CONTROL) è stata effettuata ad una velocità di taglio di 1000 s -1 per un totale di 30 min. (A) Il tasso di adesione piastrinica (s -1) non era dipendente da CTI. (B) Il momento-di-insorgenza per campioni CTI trattati era oltre il limite 30 min dell&#39;esperimento (mostrato come una linea tratteggiata), dimostrando la dipendenza FXIIa di questo parametro. Bar e punti sono valori medi, i baffi sono deviazione standard. L&#39;analisi statistica è stata da paired t-test. (NS = non significativo, n ≥3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55351/55351fig3.jpg" /> Figura 3: Coagulazione sotto flusso dipende dal numero delle piastrine. Esperimenti perfusione microfluidica sono stati eseguiti nelle camere di collagene rivestite di sangue ricostituita in presenza di Ca 2+ e concentrazioni piastriniche variabili (n ≥3). (A) Tasso di adesione piastrinica (B) tasso di accumulazione piastrinica (verde) e coagulazione (viola), e (C) momento-di-insorgenza sono mostrati come funzioni delle concentrazioni di piastrine nel sangue ricostituito. Dots sono valori medi, i baffi sono deviazioni standard. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un Versi più grandi</a>su questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55351/55351fig4.jpg" /> Figura 4: Attivazione di entrambi TF e contatto della coagulazione riduce significativamente il momento-di-insorgenza della coagulazione. Ricostituita di sangue, in presenza di Ca 2+, è stato perfuso con camere rivestite con solo o con collagene e rhTF studiare il pathway contatto solo o una combinazione delle vie di contatto e TF collagene. (A) Il momento-di-insorgenza della coagulazione è significativamente ridotta in camere di flusso TF contenenti. (B) Il tasso di accumulo di piastrine durante la coagulazione e (C) il tasso della coagulazione non sono significativamente diversi tra collagene solo o camere di flusso collagen- e rhTF-rivestite. Bar e punti sono valori medi; baffi sono deviazioni standard. L&#39;analisi statistica è stata da paired t-test. (Ns = non significativo, * p &lt;<html> 0.05, n ≥3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55351/55351vid1.jpg" /> Video complementare 1: In assenza di TF, coagulazione in camere a flusso perfusione collagene rivestite dipende FXIIa. Il ruolo della via di contatto è determinato in camere di flusso perfusione collagene rivestite. (A) Sovrapposto sequenza di immagini di fluorescenza di piastrine (verde) e di fibrina (ogen) (viola) deposizione in assenza di CTI. (B) stessa sequenza come riquadro A ma con il canale verde spento. (C) Sovrapposto sequenza di immagini di fluorescenza di piastrine (verde) e di fibrina (ogen) (viola) deposizione in presenza di CTI. (D) stessa sequenza come il pannello C ma con il canale verde spento.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per scaricare questo video. <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55351/55351vid2.jpg" /> Supplementare Video 2: L&#39;attivazione di entrambi TF e il percorso contatto riduce in modo significativo la coagulazione momento-di-insorgenza. Per studiare il ruolo di TF, sono stati usati camere a flusso rivestiti con solo o con collagene e rhTF collagene. (A) Sovrapposto sequenza di immagini di fluorescenza di piastrine (verde) e di fibrina (ogen) (viola) deposizione in camere di flusso rivestito solo con il collagene. (B) stessa sequenza come riquadro A ma con il canale verde spento. (C) Sovrapposto sequenza di immagini di fluorescenza di piastrine (verde) e di fibrina (ogen) (viola) deposizione in camere di flusso rivestiti con collagene e rhTF. (D) stessa sequenza come il pannello C ma con la switc canale verdehed off. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_2.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>

Questo articolo descrive un modello sperimentale di emostasi che misura contemporaneamente la funzione piastrinica e la coagulazione. Piastrine e di fibrina fluorescenza viene misurata in tempo reale, e il tasso di piastrine di adesione, il tasso di coagulazione, e l&#39;inizio della coagulazione sono determinati. Il modello viene utilizzato per determinare le proprietà delle piastrine procoagulanti sotto flusso nei concentrati di trasfusione.

Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

L'obiettivo generale di questo esperimento microfluidico è misurare simultaneamente il deposito delle piastrine e la formazione di fibrina su una superficie reattiva in condizioni di flusso, utilizzando la microscopia video in tempo reale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina trasfusionale riguardo agli effetti della preparazione del concentrato piastrinico sulla natura procoagulante del sangue trasfuso. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi simultanea della funzione piastrinica e della coagulazione in condizioni di flusso, permettendo di esaminare l'interazione tra questi due processi.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla procoagulazione piastrinica indotta dalla via di contatto, può essere applicato anche allo studio della via estrinseca rivestendo con fattore tessutale lipidato. La procedura sarà dimostrata da Rosalie Devloo, tecnica del laboratorio. Iniziare l'allestimento della camera di flusso microfluidica pipettando 0,8 microlitri di collagene appena ricostituito in cinque sesti della lunghezza di ogni canale su un'estremità di un nuovo biochip microfluidico monouso dotato di otto canali paralleli rettilinei, etichettando questa estremità del biochip come uscita.Incubare il biochip a quattro gradi Celsius per almeno quattro ore in un contenitore umidificato e sigillato. Al termine dell'incubazione, riempire i canali codificati con un numero uguale di canali a forma di Y in un biochip miscelatore con buffer bloccante. Rimettere il microchip nel contenitore per un'ora a temperatura ambiente.Quindi, inserire un perno in un'estremità di due pezzi di tubo lunghi otto centimetri e in un'estremità di un pezzo lungo due centimetri, nonché in entrambe le estremità di un pezzo lungo 46 centimetri di tubo per ogni canale utilizzato. Successivamente, utilizzare il software della nanopompa per risciacquare tutte le fluidiche della pompa nei tubi collegati con acqua distillata e una siringa nel perno del connettore della siringa, al fine di riempire tutti gli altri tubi con buffer bloccante. Poi, fissare il biochip codificato sullo stadio del microscopio automatizzato utilizzando un sollevatore a forbice da laboratorio per posizionare il biochip di miscelazione alla stessa altezza dello stadio del microscopio.Utilizzare i perni nei tubi di otto centimetri per fissare questi pezzi di tubo all'ingresso del biochip miscelatore e immergere l'estremità libera di ciascun tubo in una provetta contenente soluzione salina tamponata con HEPES. A questo punto, collegare il biochip codificato al biochip miscelatore mediante il pezzo di tubo di 46 centimetri, in una linea flessibile ma dritta. Fissare un perno connettore per siringa al tubo compatibile con luer della pompa di risciacquo.Quindi, collegare il perno all'estremità libera del pezzo di tubo lungo due centimetri e fissare l'altra estremità del tubo all'uscita del biochip codificato. Successivamente, risciacquare tutto il tubo e i canali con un millilitro di HBS. Per preparare le pompe di perfusione, aprire il software Microfluidic Perfusion Pump Driver e fare doppio clic sull'icona delle siringhe per inizializzare le pompe.Selezionare il tipo di siringa da utilizzare e scollegare la pompa di risciacquo e il tubicino di due centimetri collegato ad essa. Collegare il tubicino di due centimetri scollegato, con il suo perno connettore per siringa, al blocco luer di un pezzo di tubo spesso per rifiuti e utilizzare una siringa per riempire il tubo spesso con la soluzione standard di pepsina. Successivamente, fissare l'estremità aperta del tubo spesso con una pinza di Kocher.Fissare il tubo all'uscita del biochip codificato. Scollegare insieme i due tubi dalla camera di miscelazione e scartare i contenitori di HBS. Dopo aver ottenuto il campione di sangue in contenitori vuoti contenenti citrato di sodio, centrifugare i tubi e trasferire il plasma ricco di piastrine in un nuovo tubo da centrifuga.Centrifugare nuovamente i contenitori con il plasma ricco di piastrine. Quindi, trasferire il plasma povero di piastrine, ovvero il surnatante, in un tubo da centrifuga diverso. Successivamente, utilizzare un ago da 21 gauge per perforare il fondo dei contenitori contenenti citrato di sodio, in modo da permettere ai globuli rossi concentrati di gocciolare in un nuovo tubo conico.Una volta raccolti tutti i globuli rossi concentrati, ricostituire delicatamente il sangue combinando i globuli rossi concentrati separati con il plasma povero di piastrine e aggiungere piastrine da banca del sangue preparate per la trasfusione, ottenendo campioni con un ematocrito del 40% e una concentrazione di 2,5 volte 10 alla quinta piastrine per microlitro, per un volume finale di 2,5 millilitri, quindi eseguire un emocromo completo. Successivamente, aggiungere 13 microlitri di fibrinogeno marcato con fluorocromo in un tubo conico in polistirene, seguiti da un millilitro di sangue ricostituito.Mescolare un altro millilitro di sangue con due microlitri di colorante fluorescente per piastrine e aggiungere i campioni di sangue marcati insieme. Successivamente, capovolgere delicatamente i campioni di sangue mescolati e incubare le cellule per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Prima di iniziare il saggio di perfusione, mettere a fuoco l'obiettivo del microscopio sulle fibre di collagene aderenti al fondo del primo canale.Utilizzando il software di acquisizione, definire una regione di interesse nel canale selezionato. Caricare un millilitro di tampone di coagulazione preriscaldato in una siringa da un millilitro e montare la siringa sulla pompa di perfusione. Dopo un secondo leggero rovesciamento, caricare il sangue in una siringa da due millilitri e montare la siringa sulla pompa di perfusione.Quindi, utilizzare un ago per connettore per collegare entrambe le siringhe a un pezzo di tubo lungo otto centimetri ed eseguire la messa a punto dei connettori e dei tubi a 400 microlitri al minuto. Quando tutti i tubi sono riempiti con tampone di coagulazione o sangue, fissare l'altra estremità di entrambi i tubi alle diramazioni del canale a forma di Y nel biochip di miscelazione. Successivamente, rimuovere la pinza di Kocher all'uscita del tubo di scarto e avviare la perfusione a 4,4 microlitri al minuto per il tampone di coagulazione e a 44 microlitri al minuto per il sangue ricostituito.Registrare le immagini ogni 10 secondi per 30 minuti in tempo reale, interrompendo le pompe e l'acquisizione delle immagini dopo 30 minuti o quando il segnale diventa saturo. Successivamente, scartare tutti i tubi e le siringhe come rifiuti biologici pericolosi. Questo video fornisce un ottimo esempio dell'accumulo di trombi piastrinici e del deposito di fibrina.All'inizio della perfusione, le piastrine aderivano alla superficie reattiva, determinando un costante aumento della fluorescenza verde registrata. Durante questa fase di adesione, la fluorescenza violetta era scarsa, indicando che la fibrina veniva formata solo in misura marginale. Al momento dell'avvio della coagulazione, i depositi di fibrina fluorescenti si accumulavano rapidamente, con la fluorescenza verde delle piastrine che aumentava pressoché allo stesso ritmo.Un momento di inizio della coagulazione può quindi essere estrapolato come determinante del potenziale procoagulante delle piastrine. L'aggiunta di inibitore del tripsinogeno del mais al sangue ricostituito non influenza l'adesione piastrinica, ma la coagulazione non inizia per tutta la durata dell'esperimento di perfusione. Aumentando il numero di piastrine in un campione ricostituito, la velocità di adesione, accumulo e coagulazione aumenta linearmente.Il momento dell'insorgenza si riduce significativamente all'aumentare della concentrazione delle piastrine, suggerendo che sia necessario un numero soglia di piastrine depositate e attivate per innescare la coagulazione. Inoltre, in un'analisi accoppiata di canali rivestiti solo con collagene oppure in combinazione con fattore tessutale lipidato ricombinante, l'insorgenza della coagulazione è significativamente più rapida, sebbene né la velocità complessiva del processo di coagulazione né l'accumulo piastrinico differiscano tra le condizioni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento con camera a flusso microfluidica utilizzando sangue ricostituito con doppia marcatura per l'analisi simultanea della funzione piastrinica e della coagulazione.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina trasfusionale per esplorare le interazioni tra piastrine e coagulazione in condizioni di flusso. In questo video, ci siamo concentrati sulla dimostrazione di un esperimento standardizzato. Tuttavia, possono essere introdotte variazioni nel rivestimento della superficie, nelle sollecitazioni dello scudo o nella concentrazione di calcio per rispondere a specifiche domande di ricerca di interesse.

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L&#39;adesione e aggregazione piastrinica in condizioni di flusso utilizzando celle di flusso Microfluidic

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Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

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Impara a misurare la deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale con un modello microfluidico. Questo metodo consente di analizzare simultaneamente la funzione piastrinica e la coagulazione in condizioni di flusso.

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