Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

L'obiettivo generale di questo esperimento microfluidico è quello di misurare simultaneamente la deposizione di piastrine nella formazione di fibrina su una superficie reattiva in condizioni di flusso utilizzando la microscopia video in tempo reale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina trasfusionale sugli effetti della preparazione di concentrati piastrinici sulla natura procoagulante del sangue trasfuso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita l'analisi simultanea della funzione piastrinica e della coagulazione nel flusso, consentendo di esaminare l'interazione tra i due processi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla procoagulazione piastrinica indotta dalla via di contatto, può anche essere applicato allo studio della via estrinseca mediante rivestimento con fattore tissutale lipidico. A dimostrare la procedura sarà Rosalie Devloo, un tecnico del laboratorio. Iniziare la configurazione della camera di flusso microfluidica pipettando 0,8 microlitri di collagene appena ricostituito in cinque sesti della lunghezza di ciascun canale su un'estremità di un nuovo biochip microfluidico monouso con otto canali paralleli diritti ed etichettando questa estremità del microchip come uscita.

Incubare il biochip a quattro gradi Celsius per almeno quattro ore in un contenitore umidificato e sigillato. Al termine dell'incubazione, riempire i canali codificati in un numero uguale di canali a forma di Y in un biochip di miscelazione con tampone bloccante. Rimetti il microchip nel contenitore per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, posizionare uno spillo in un'estremità di due, otto centimetri di lunghezza e uno, due centimetri di lunghezza di tubi e in entrambe le estremità di uno, 46 centimetri di lunghezza pezzo di tubo per ogni canale in uso. Quindi, utilizzare il software Nanopump per sciacquare tutti i fluidici della pompa nel tubo collegato con acqua distillata e una siringa nel pin del connettore della siringa per riempire tutti gli altri tubi con il tampone di blocco. Quindi, fissare il biochip codificato sul tavolino del microscopio automatizzato utilizzando un martinetto a forbice da laboratorio per fissare il biochip di miscelazione alla stessa altezza del tavolino del microscopio.

Utilizzare i perni nei tubi da otto centimetri per fissare questi pezzi di tubo all'ingresso del biochip di miscelazione e mettere l'estremità libera di ciascun tubo in una fiala di soluzione salina tamponata HEPES. Ora, collega il biochip codificato al biochip di miscelazione con il pezzo di tubo di 46 centimetri in una linea flessibile, ma diritta. Collegare un pin del connettore della siringa al tubo compatibile con il luer della pompa di risciacquo.

Quindi, collegare il perno all'estremità libera del pezzo di tubo di due centimetri e fissare l'altra estremità del tubo all'uscita del biochip codificato. Quindi, sciacquare tutti i tubi e i canali con un millilitro di HBS. Per preparare le pompe di perfusione, aprire il software Microfluidic Perfusion Pump Driver e fare doppio clic sull'icona delle siringhe per inizializzare le pompe.

Selezionare il tipo di siringa che verrà utilizzata e scollegare la pompa di risciacquo e il tubo da due centimetri ad essa collegato. Collegare il tubo di due centimetri scollegato con il pin del connettore della siringa al luer lock di un pezzo di tubo di scarico a pareti spesse e utilizzare una siringa per riempire il tubo a pareti spesse con una soluzione standard di pepsina. Quindi, fissare l'estremità aperta del tubo a pareti spesse con un morsetto Kocher.

Fissare il tubo all'uscita del biochip codificato. Scollegare insieme i due tubi dalla camera di flusso di miscelazione e gettare i contenitori di HBS. Dopo aver ottenuto il campione di sangue in contenitori di citrato di sodio evacuati, centrifugare le provette e trasferire il plasma ricco di piastrine in una nuova provetta da centrifugazione.

Centrifugare nuovamente i contenitori con plasma ricco di piastrine. Quindi, trasferire il plasma povero di piastrine surnatante in un'altra provetta da centrifuga. Quindi, utilizzare un ago da 21 gauge per perforare il fondo dei contenitori di citrato di sodio per consentire ai globuli rossi impacchettati di gocciolare in una nuova provetta conica.

Quando tutti i globuli rossi impaccati sono stati raccolti, ricostituire delicatamente il sangue combinando i globuli rossi concentrati separati con il plasma povero di piastrine e aggiungere le piastrine della banca del sangue preparate per la trasfusione per ottenere campioni con una concentrazione di ematocrito del 40% e da 2,5 volte 10 alla quinta piastrina per microlitro a un volume finale di 2,5 millilitri e ottenere un emocromo completo. Quindi, aggiungere 13 microlitri di fibrinogeno marcato con fluoroforo a un tubo conico di polistirene. Seguito da un millilitro di sangue ricostituito.

Mescolare un altro millilitro di sangue con due microlitri di colorante piastrinico fluorescente e aggiungere insieme i campioni di sangue etichettati. Quindi, capovolgere delicatamente i campioni di sangue misto e incubare le cellule per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Prima di iniziare il test di perfusione, focalizzare l'ottica del microscopio sulle fibre di collagene che aderiscono alla parte inferiore del primo canale.

Utilizzando il software di acquisizione, definire una regione di interesse nel canale selezionato. Caricare un millilitro di tampone di coagulazione preriscaldato in una siringa da un millilitro e montare la siringa sulla pompa di perfusione. Dopo una seconda leggera inversione, caricare il sangue in una siringa da due millilitri e montare la siringa sulla pompa di perfusione.

Quindi, utilizzare un pin del connettore della siringa per collegare entrambe le siringhe a un pezzo di tubo da otto centimetri e adescare i connettori e i tubi a 400 microlitri al minuto. Quando tutto il tubo è riempito con il tampone di coagulazione o con il sangue, fissare l'altra estremità di entrambi i tubi alle gambe divise del canale a forma di Y nel biochip di miscelazione. Quindi, rimuovere la pinza Kocher all'uscita della provetta di scarto e avviare la perfusione a 4,4 microlitri al minuto per il tampone di coagulazione e 44 microlitri al minuto per il sangue ricostituito.

Registra immagini ogni 10 secondi per 30 minuti in tempo reale, terminando le pompe e l'acquisizione delle immagini dopo 30 minuti o quando il segnale diventa saturo. Quindi, gettare tutti i tubi e le siringhe come rifiuti a rischio biologico. Questo video fornisce un eccellente esempio dell'accumulo di trombi piastrinici e deposizione di fibrina.

All'inizio della perfusione, le piastrine hanno aderito alla superficie reattiva, determinando un aumento costante della fluorescenza verde registrata. Durante questa fase di adesione, c'è poca fluorescenza viola che indica che la fibrina si è formata solo marginalmente. All'inizio della coagulazione, la violenta fluorescenza della fibrina si deposita rapidamente con la fluorescenza verde piastrinica che si accumula all'incirca alla stessa velocità.

Un momento di insorgenza della coagulazione può quindi essere estrapolato come determinante del potenziale procoagulante piastrinico. L'aggiunta di inibitore della tripsina di mais al sangue ricostituito non influisce sull'adesione piastrinica ma la coagulazione non inizia per tutta la durata dell'esperimento di perfusione. Aumentando il numero di piastrine in un campione ricostituito, il tasso di adesione, accumulo e coagulazione aumenta linearmente.

Il momento di insorgenza è significativamente accorciato aumentando la concentrazione piastrinica, suggerendo che è necessario un numero soglia di piastrine depositate attivate per innescare la coagulazione. Inoltre, in un'analisi accoppiata di canali rivestiti solo con collagene, o in combinazione con fattore tissutale lipidico ricombinante, l'insorgenza della coagulazione è significativamente più veloce, sebbene né la velocità complessiva della coagulazione, né l'accumulo di piastrine, siano diversi tra le condizioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento in camera di flusso microfluidico con sangue ricostituito a doppia marcatura per l'analisi simultanea della funzione piastrinica e della coagulazione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina trasfusionale per esplorare le interazioni tra piastrine e coagulazione sotto flusso. In questo video, ci siamo concentrati sulla dimostrazione di un esperimento standardizzato. Ma i cambiamenti nel rivestimento superficiale, nelle sollecitazioni dello scudo o nella concentrazione di calcio possono essere introdotti per rispondere a specifiche domande di ricerca di interesse.