Metodo dell'agitatore magnetico per la rilevazione di

L'obiettivo generale di questo metodo diagnostico è identificare carne o prodotti a base di carne infestati dal parassita zoonosico Trichinella, veicolato dagli alimenti. Questo metodo rappresenta lo standard di riferimento per il rilevamento diretto delle larve di Trichinella nella carne. Il principale vantaggio della tecnica è la sua semplicità esecutiva e il fatto che non richieda attrezzature specializzate.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché non è possibile utilizzare controlli interni e deve essere applicata una rigorosa gestione della qualità durante tutto il test. La procedura sarà dimostrata da Nora Thaben, una tecnica del mio laboratorio. Salve! Per preparare un campione di muscolo per la digestione, inserire 100 grammi del campione in un frullatore o macinatore.

Aggiungere due millilitri di acqua preriscaldata per facilitare la miscelazione. Frullare alla velocità massima per due o tre secondi. Prima del secondo frullamento, aprire il frullatore e trasferire qualsiasi campione muscolare presente sul bordo superiore del recipiente verso il fondo.

Ripetere l'omogeneizzazione e continuare a omogeneizzare con impulsi di due o tre secondi fino a quando non rimangono pezzi visibili di carne. Prima di iniziare questa procedura, preparare il fluido di digestione in un becher da tre litri come descritto nel protocollo testuale. Trasferire un litro del fluido di digestione preriscaldato in un matraccio.

Trasferire la carne macinata nel becher. Utilizzare un cucchiaio o una forchetta per disperdere la carne nel fluido di digestione. Risciacquare accuratamente il recipiente del frullatore, il coperchio, le lame e la forchetta con il fluido di digestione rimanente.

Posizionare il becher su un piastrino riscaldante per mantenere una temperatura costante di 44-46 gradi Celsius, monitorando con un termometro. Quindi coprire il becher con della pellicola di alluminio. Mescolare il liquido di digestione per 30 minuti, creando un vortice profondo senza schizzi, finché le particelle di carne non scompaiono.

Dopo la digestione del campione muscolare, il fluido di digestione deve essere filtrato e la quantità di tessuto non digerito deve essere determinata. Azzerare la bilancia, pesare un setaccio pulito da 180 micrometri e annotarne il peso. Verificare che il beccuccio separatore sia in posizione verticale.

Per consentire un buon sedimentamento delle larve, la larghezza del becher di separazione in vetro non deve superare il 55% della sua lunghezza. Versare con attenzione il liquido di digestione attraverso il setaccio nel becher di separazione in vetro, evitando qualsiasi trabocco. Per evitare una perdita di sensibilità, risciacquare accuratamente il becher di vetro e il setaccio con circa 200 millilitri di acqua di rubinetto.

Trasferire l'acqua di risciacquo nel becher separatore. Sollevare il setaccio e risciacquare accuratamente la zona al di sotto del setaccio utilizzando una bottiglia con beccuccio. Anche l'acqua di risciacquo deve essere raccolta in un becher separatore.

Lasciare il setaccio sul imbuto di separazione per l'essiccazione durante tutta la procedura di sedimentazione. Per iniziare la procedura di sedimentazione, mantenere il liquido digerito filtrato in un imbuto di separazione per 30 minuti, in modo che le larve di Trichinella si depositino sul fondo dell'imbuto. Al termine della sedimentazione, aprire completamente il rubinetto dell'imbuto di separazione per far defluire rapidamente almeno 20 millilitri del liquido di digestione in un cilindro graduato.

Quindi, aprire completamente il rubinetto in senso opposto per far passare 10 millilitri di fluido di digestione. Infine, aprire il rubinetto in senso opposto per far passare altri 10 millilitri nel cilindro graduato. Lasciare i 40 millilitri di fluido di digestione nel cilindro per 10 minuti, consentendo ai larve di sedimentare.

Procedere a determinare la quantità di tessuti non digeriti. Sollevare il setaccio dal imbuto di sedimentazione e asciugare il setaccio con un tovagliolo di carta. Sottrarre il peso del setaccio prima della filtrazione dal peso del setaccio con i tessuti non digeriti.

Il processo di digestione è considerato soddisfacente se non rimane più del 5% del peso iniziale del campione sul setaccio. Se la quantità di tessuto non digerito supera il 5%, ripetere la digestione utilizzando campioni freschi di muscolo. Se i campioni freschi non sono disponibili, digerire nuovamente il materiale rimanente.

Dopo che il fluido di digestione è rimasto nel cilindro per 10 minuti, rimuovere 30 millilitri di soprannatante aspirando con una pipetta senza disturbare il sedimento di 10 millilitri. Per ridurre la quantità di fibre tessutali nel campione, aggiungere 30 millilitri di acqua di rubinetto al sedimento e lasciare a riposo per altri 10 minuti. Ripetere questo lavaggio fino a quando il liquido non diventa limpido.

Una volta che il liquido è limpido, rimuovere il soprannatante e trasferire i 10 millilitri di sedimento lavato in una capsula di Petri con griglia. Risciacquare il cilindro con 10 millilitri di acqua di rubinetto e aggiungere l'acqua al sedimento lavato. Immediatamente dopo i passaggi di lavaggio, esaminare i campioni utilizzando un trichinoscopio o un microscopio stereoscopico, con una sorgente di luce trasmessa sotto il piano regolabile in intensità.

Utilizzando un ingrandimento da 15 a 20x, esaminare sistematicamente la piastra di Petri, griglia per griglia. Se non vengono trovate strutture sospette, muovere delicatamente il liquido nella piastra con movimento circolare per consentire ai larve di Trichinella, potenzialmente non individuate, di accumularsi al centro della piastra. Ripetere l'esame.

Se si trova una struttura sospetta, aumentare l'ingrandimento da 40 a 100x. Rimuovere i larve di Trichinella dalla piastra con una pipetta e raccoglierle in un contenitore. Dopo aver esaminato l'intera piastra, ripetere la procedura di esame microscopico, a partire dall'agitazione delicata della piastra.

Ripetere la procedura almeno tre volte o fino a quando non si trovano più larve. Determinare il numero di larve per grammo di tessuto muscolare.

Se nel liquido di digestione sono presenti troppi larve per determinarne con precisione il numero, restituire il liquido contenente le larve nel cilindro graduato. Risciacquare la capsula con acqua di rubinetto da una bottiglia con beccuccio e lasciare sedimentare le larve sul fondo. Dopo un tempo di sedimentazione di 10 minuti, ridurre il liquido di digestione a un volume definito trasferendo le larve dal fondo del cilindro graduato in incrementi di un millilitro in un nuovo cilindro.

Sospendere omogeneamente le larve nei 10 millilitri mediante agitazione vigorosa. Durante l'agitazione, pipettare 12 gocce di 20 microlitri di sospensione larvale su una piastra di Petri. Esaminare ciascuna goccia di 20 microlitri al microscopio e calcolare il numero totale di larve come descritto nel protocollo del testo.

Prima dell'esame microscopico delle larve di Trichinella, è importante lavare adeguatamente ogni campione per rimuovere i detriti che potrebbero impedire l'identificazione delle larve. Le larve di Trichinella sono lunghe da 0,7 a 1,5 millimetri e hanno una larghezza di circa 0,3 millimetri. L'esofago è stretto, con un'estremità leggermente arrotondata.

Lo stichosoma è una struttura situata nella metà anteriore della cavità corporea, costituita da un lungo tubo sottile circondato da una fila di 45-55 grandi cellule. Anche il retto è arrotondato, senza proiezioni o appendici. Dopo la digestione, la forma delle larve muscolari infettive può variare, rendendo l'identificazione più difficile.

Le forme tipiche includono larve in movimento fortemente arrotolate e leggermente arrotolate, a forma di C o completamente srotolate. Dopo la digestione muscolare possono essere trovate altre strutture oltre alle larve di Trichinella. Esempi di reperti occasionali nel cinghiale selvatico comprendono un pelo simile a una setola di lombrico, il trematode Alaria alata, una fibra muscolare, un nematode del genere Metastrongylus, fibra vegetale e larve del nematode Toxocara.

Una volta padroneggiata, la tecnica può essere eseguita in circa due ore, se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come rilevare le larve di Trichinella nella carne mediante il metodo del miscelatore magnetico, tenendo conto dei punti critici di controllo più importanti.