Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti
2 marzo 2017
Il metodo presentato qui descrive una soluzione scalabile e buone pratiche di fabbricazione (GMP) sistema di differenziazione -ready per generare cellule epatociti-come l'essere umano da cellule staminali pluripotenti. Serve come un sistema economico e standardizzato per generare cellule epatociti-come l'essere umano per la ricerca di base e applicata fegato umano.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di produrre cellule umane simili agli epatociti da cellule staminali pluripotenti utilizzando matrici di laminina ricombinanti in condizioni definite. Questo metodo consente all'utente di personalizzare gli epatociti umani funzionali per studiare la biologia del fegato nel piatto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la sua natura definita consente la produzione di massa di epatociti con un alto grado di riproducibilità sperimentale. Per iniziare l'esperimento, scongelare 100 microgrammi per millilitro di laminina-521 ricombinante, o LN-521, a quattro gradi Celsius.Diluire l'LN-521 scongelato in 1xDBPS ghiacciato con calcio magnesio per ottenere una soluzione di cinque microgrammi per millilitro. Aggiungere un millilitro della soluzione di LN-521 da cinque microgrammi per millilitro per rivestire un pozzetto di una piastra a sei pozzetti e agitare la piastra per distribuirla uniformemente nel pozzetto. Successivamente, incubare le piastre in un incubatore per colture cellulari al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius per almeno due ore per un uso urgente. Portare la piastra rivestita dall'incubatore alla cappa di coltura tissutale. Aspirare con cura la soluzione di rivestimento LN-521 senza danneggiare la superficie rivestita. Quindi aggiungere immediatamente un millilitro di mTeSR preriscaldato
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per generare cellule simili agli epatociti umani a partire da cellule staminali pluripotenti utilizzando matrici di laminina ricombinante. Fornisce un sistema scalabile e pronto per la produzione secondo le buone pratiche di fabbricazione (GMP) di epatociti funzionali per la ricerca epatica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Differenziamento cellulare
- Biologia delle cellule staminali
- Ricerca epatica
Sfondo
- Le cellule epatocitari umane sono fondamentali per lo studio della biologia epatica.
- Le cellule staminali pluripotenti possono differenziarsi in vari tipi cellulari.
- Le matrici di laminina ricombinante favoriscono l'adesione e la crescita cellulare.
- Metodi standardizzati migliorano la riproducibilità nella ricerca.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo economico per produrre cellule simili agli epatociti.
- Permettere la produzione su larga scala di epatociti funzionali.
- Facilitare la ricerca in biologia del fegato e modellizzazione delle malattie.
Metodi Utilizzati
- Scongelamento e diluizione della laminina ricombinante-521.
- Rivestimento delle piastre per coltura cellulare con soluzione di laminina.
- Incubazione delle piastre per favorire l'adesione cellulare.
- Aggiunta di mTeSR preriscaldato per la coltura cellulare.
Risultati principali
- Generazione con successo di cellule simili agli epatociti umani.
- Alta riproducibilità nella produzione delle cellule.
- Caratteristiche funzionali delle cellule simili agli epatociti confermate.
- Sistema scalabile adatto a diverse applicazioni di ricerca.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio affidabile alla produzione di epatociti.
- Supporta sia la ricerca epatologica di base che quella applicata.
- Studi futuri potranno sfruttare questo sistema per test farmacologici e modellizzazione delle malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I sistemi di differenziazione definiti riducono la variabilità tra i lotti nella produzione di cellule epatocitari, migliorando la riproducibilità dei modelli epatici preclinici. Processi scalabili e compatibili con le norme GMP garantiscono un approvvigionamento costante per i test di metabolismo e tossicità dei farmaci. Ciò risolve un collo di bottiglia fondamentale nel traslare gli epatociti derivati da cellule staminali verso applicazioni industriali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi epatici utilizzando modelli cellulari scalabili e fisiologicamente rilevanti.
- Valore operativo: Matrici definite di laminina riducono la variabilità, migliorando la coerenza del saggio tra diversi esperimenti.
- Valore predittivo: L'elevata riproducibilità supporta studi affidabili sull'interazione con il bersaglio e sul meccanismo d'azione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce cellule simili agli epatociti con funzione metabolica stabile per lo screening di composti.
- Valore operativo: Condizioni definite e senza siero consentono la standardizzazione tra laboratori e siti di produzione.
- Scalabilità: Compatibile con linee di cellule staminali pluripotenti umane per la ricerca e per uso in grado GMP, al fine di garantire un approvvigionamento scalabile di cellule.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Le cellule esprimono un fenotipo e una funzione simili a quelle degli epatociti primari, migliorando la fedeltà del modello di malattia.
- Valore operativo: Un sistema definito riduce la variabilità tra diversi lotti, favorendo studi abilitanti alla richiesta di autorizzazione all’immissione in commercio (IND).
- Continuità traslazionale: Collega la differenziazione delle cellule staminali alla validazione preclinica di terapie mirate al fegato.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo una fonte scalabile di epatociti funzionali per applicazioni successive.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi in ambito della biologia del fegato mediante una differenziazione definita e riproducibile.
- Screening: Permette la produzione standardizzata di cellule epatocitari simili per una valutazione costante dei composti.
- Analisi: Genera output funzionali quantificabili (ad esempio, albumina, urea) per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità dalla differenziazione ai modelli preclinici di malattia epatica e di risposta ai farmaci.
- Riutilizzo aziendale: Una piattaforma definita e scalabile favorisce il riutilizzo tra progetti e sedi, riducendo il carico di riottimizzazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Una previsione affidabile della funzione degli epatociti riduce l'ambiguità meccanicistica nei saggi legati al fegato.
- Valore operativo: Componenti definiti e processo privo di siero migliorano la riproducibilità e la scalabilità.
- Valore strategico: Consente decisioni più accurate su avanzamento/cessazione riducendo la variabilità biologica nei dati preclinici.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta rispetto ai rischi dei candidati mirati al fegato grazie a sistemi modellistici affidabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze nei protocolli di coltura e differenziamento delle cellule staminali.
- Accesso a matrici di laminina ricombinante e a mezzi di differenziamento definiti.
- Standardizzazione delle procedure di rivestimento e incubazione tra i diversi gruppi di lavoro.
- Considerazioni sull'adattamento a diverse linee di cellule staminali pluripotenti umane e a formati di scala superiore.
- Le limitazioni includono la maturazione funzionale rispetto agli epatociti primari, come indicato nella fonte.
