Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

L'obiettivo generale di questa tecnica microchirurgica è iniettare cellule tumorali del colon-retto nella parete cecale per indurre tumori del colon-retto riproducibili e metastatici nei topi. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule tumorali circolanti, i suoi principali vantaggi sono i tumori altamente riproducibili e uniformi, che consentono una previsione affidabile dello stadio e la previsione delle cellule tumorali circolanti. Inizia usando una pinza atraumatica per esteriorizzare attentamente il cieco di un topo immunocompromesso di sei-otto settimane.

Posizionare l'estremità cieca del cieco sull'addome in modo che la sacca punti cranialmente. Per l'iniezione intra-cecale, montare una siringa standard da un millilitro dotata di canella calibro 30 e caricarla con le cellule tumorali su una micro pompa di iniezione montata su un micro manipolatore. Quindi, usa la pinza atraumatica per afferrare con cura la punta del cieco e usa una seconda pinza, inumidita con soluzione fisiologica calda per levigare delicatamente il cieco con movimenti verso il basso.

Ora muovi l'animale sotto un microscopio chirurgico binoculare e con la canella direttamente parallela e sopra il cieco, usa due pinze atraumatiche per allungare con cura il tessuto ad entrambe le estremità dell'estremità esteriorizzata del cieco. Tirare lentamente il cieco sopra la canella, facendo attenzione a non perforare l'intera fascia di parete o la sierosa oltre il punto iniziale di penetrazione e posizionare la canella sopra i vasi sanguigni e sotto la sottile membrana traslucida all'interno della cintura di parete. Quando la canella è in posizione, utilizzare un interruttore a pedale per iniettare 20 microlitri di cellule in un periodo di 20 secondi.

Tra il sottile rivestimento di sierosa traslucido, sopra i vasi sanguigni intramurali e i muscoli. Quando tutte le cellule sono state iniettate, rimuovere con cura la canella e posizionare un cervo asciutto sotto il cieco. Per prevenire la disseminazione peritoneale artificiale, lisare le cellule fuoriuscite con un accurato risciacquo con acqua distillata e riportare delicatamente il cieco nella cavità addominale.

Chiudere la parete addominale con punti di sutura da corsa a rapido assorbimento, nella pelle con clip per ferite chirurgiche. Quindi posizionare il mouse su un tappetino riscaldante impostato a 38 gradi Celsius con monitoraggio fino alla completa decubito. Per isolare le cellule tumorali circolanti, al punto finale sperimentale appropriato, riempire provette coniche da 15 millilitri con cinque millilitri di terreno di gradiente di densità per provetta e trasferire con cura i campioni di sangue intero raccolti da animali portatori di tumore sugli strati di gradiente di densità.

Separare le cellule mediante centrifugazione e recuperare con cura l'interfaccia contenente le celle mononucleate. Pipettare le cellule mononucleate in una nuova provetta da 15 millilitri per una seconda centrifugazione. Seguito da lavaggi in tubo in PBS.

Dopo il secondo lavaggio, risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS, integrati con EDTA e aggiungere quattro microlitri di anticorpi anti amp camp a ciascun campione, per un'incubazione di 20 minuti su ghiaccio al buio. Successivamente, utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio di circa un centimetro in una capsula di Petri sterile di sei centimetri per campione e aggiungere 700 microlitri di tampone di prelievo a ciascun cerchio, seguiti da 50 microlitri di sospensione cellulare. Utilizzare un microscopio per controllare la densità delle cellule e lasciare che i campioni si depositino per circa cinque minuti.

Quindi esaminare la goccia di cellule per la positività del campo AMP e utilizzare il micromanipolatore per trasferire le cellule di interesse in 15 microlitri del tampone appropriato per la successiva analisi a valle prevista. L'uso di cellule colorettali in questo modello, si traduce in modo affidabile in più topi abbondanti entro 35 giorni dall'iniezione di cellule tumorali, con i tumori primari che misurano circa 10 millimetri di dimensione, e con metastasi epatiche, polmonari e cellule tumorali circolanti, quasi invariabilmente presenti. Inoltre, le cellule tumorali circolanti possono essere facilmente isolate per l'analisi a valle.

Una volta padroneggiata e se eseguita correttamente, questa tecnica può essere eseguita entro 10 minuti, facilitando la formazione di tumori uniformi e metastatici che possono essere utilizzati sia per studi terapeutici che molecolari. I limiti del modello includono la sua dipendenza dalla lisi cellulare, che ha i suoi limiti, così come l'immunodeficienza dei topi, entrambi i quali, possono essere superati con l'uso di cellule tumorali del colon-retto mutanti. Grazie alla sua semplicità, questo modello può essere un valido addendum ai modelli attualmente disponibili di cancro del colon-retto.