Name: Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Scopri una tecnica microchirurgica per isolare cellule tumorali circolanti in un modello ortotopico di cancro colorettale nel topo. Questo metodo riproducibile consente di studiare la metastasi e la progressione tumorale in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione della ricerca tedesca (WE 3548 / 4-1) e Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Gli esperimenti animali presentati qui sono stati riesaminati e consentiti in maniera indipendente da un comitato istituzionale e governativo per la cura degli animali e sono stati condotti secondo le linee guida dell&#39;Associazione federale delle scienze animali animali (FELASA). Tutte le misure possibili sono state prese per ridurre al minimo la sofferenza, inclusa l&#39;anestesia e l&#39;analgesia o, se necessario, l&#39;eutanasia precoce. 1. Preparazione delle cellule e degli organoidi NOTA: utilizzare un volume di 20 μL con 100.000 celle per ogni iniezione. Utilizzare la matrice della membrana basamento (BMM) per evitare perdite e assicurare l&#39;iniezione standardizzata. Al fine di garantire risultati riproducibili, eseguire test di autenticazione delle linee cellulari ( ad esempio , tramite profilatura STR) a intervalli regolari. <ol><li> Preparazione di sospensioni cellulari primarie da tessuti freschi NOTA: lavorare sempre in condizioni sterili. Trasferimento immediato del frescoIl tessuto resecato dalla sala operatoria al laboratorio sul ghiaccio è necessario per garantire un&#39;elevata vitalità delle cellule. Il benessere del paziente e il trattamento ottimale devono sempre essere la prima priorità. Pertanto, i campioni di tessuto per la ricerca devono essere ottenuti in modo da non interferire con il successivo processo di formazione patologica e la messa a punto del tumore resecato. Nella maggior parte dei casi è pertanto ragionevole avere i campioni per la ricerca ottenuta da un patologo addestrato al fine di garantire la non interferenza con la diagnosi patologica. <ol><li> Immediatamente dopo la rimozione sterile dal campione resecato (idealmente ~ 1 cm 3 ), posizionare il campione di tessuto in un tubo da 50 ml pre-riempito con 20-30 ml di soluzione salina fosfato-tamponata (PBS). Conservare il tubo sul ghiaccio e trasferirlo immediatamente nel laboratorio. </li><li> Mettere il tessuto in un piatto di Petri e lavare due volte con abbondante PBS per rimuovere il sangue rimanente. </li><li> Tagliare il tessuto in piccoli pezzi (~ 2-4 mm) con uno scaLpel ( ad esempio , con una lama # 20 o # 36). </li><li> Utilizzare il dissociatore secondo le istruzioni del produttore allo scopo di dissociare ulteriormente il tessuto tumorale a una sospensione a singola cellula. In alternativa, utilizzare altri protocolli di digestione tumorale enzimatica. </li><li> Conte le cellule della sospensione a singola cellula risultante ( ad es . In un contatore di coulter o un emocitometro). </li><li> Centrifugare (5 min a 1.500 xg) e lavare due volte la cellula con PBS. </li><li> Resuspendere le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e tenerle sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparazione delle linee cellulari per iniezione <ol><li> Crescere tutte le linee cellulari del cancro colorettale in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ) e prepararle al giorno della chirurgia. </li><li> Raccogliere le cellule secondo protocolli standard della coltura cellulare, contare le cellule ( ad es . In un contatore di coulter o un emocitometro) e calcolare il reqPer tutte le iniezioni a seconda del numero di animali da iniettare. </li><li> Preparare 3-5 volte il volume effettivamente necessario per tenere conto delle perdite e del volume morto della siringa d&#39;iniezione. </li><li> Centrifugare (5 minuti a 1.500 g) e lavare due volte la cellula con PBS. </li><li> Resuspendere le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e tenerle sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparazione dell&#39;organoide NOTA: Tutte le colture organoide 3D sono coltivate in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ). I protocolli dettagliati per la cultura organoide sono stati pubblicati prima. 18 , 19 , 20 Simile alle linee cellulari convenzionali, si consiglia un volume di 20 μL BMM con 100.000 cellule per iniezione. Gli organoidi vengono preparati al giorno della chirurgia come segue: <ol><li> Preparare il seguente supporto (nel seguito riportatoA DMEM / F12 +++): Medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamina (200 mM) + 1% Penicillina / Streptomicina. </li><li> Pre-riempire i tubi da 15 mL con 1 mL di DMEM / F12 +++. </li><li> Aspirare con cura gli organoidi dalla superficie della piastra di coltura e trasferire il contenuto di 3 a 5 pozzetti in un tubo da 15 ml. </li><li> Coltivare con cura gli organoidi in pezzi più piccoli pipettandoli su e giù con una pipetta di vetro estesa. </li><li> Aggiungere 5 mL DMEM / F12 +++ al tubo, seguita da centrifugazione a 1000 xg per 5 min. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 600 μl di tampone enzimatico di dissociazione e trasferire la sospensione in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. </li><li> Incubare a 37 ° C per 1-5 minuti e poi pipettare con cura la sospensione in modo da sciogliere gli organoidi. NOTA: Verificare la digestione tramite microscopio; È completo quando tutti i cluster di cellule sono stati dissociatiD alle singole celle. </li><li> Al termine della digestione, aggiungere 1.4 mL di DMEM / F12 +++ per fermare la digestione. Quindi trasferire tutti i pozzetti degli organoidi digeriti in un tubo da 50 ml. </li><li> Conte le celle e calcolare l&#39;importo richiesto per tutte le iniezioni. </li><li> Preparare 3 - 5x del volume effettivamente necessario per tenere conto delle perdite di pipettazione e del volume morto della siringa d&#39;iniezione </li><li> Centrifugare (5 min a 1.500 xg) e lavare due volte la cellula con PBS. </li><li> Resuspendevano le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e li mantengono in ghiaccio. </li></ol></li></ol> 2. Modello ortotopico del mouse <ol><li> Preparazione degli animali destinatari per la chirurgia NOTA: utilizzare i topi 6-8 settimanali NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) come destinatari. 21 NSG sono tra i topi più immunocompromessi, privi di mature cellule B, T e NK insieme a molte altre proteine ​​immunitariefetti. 21 Essi aumentano in modo affidabile i tumori anche se vengono iniettati numeri di cellule basse e sono altamente inclini a metastasi distanti. I topi NSG sono erbivori eccellenti e possono essere conservati in unità convenzionali non specifiche per agenti patogeni (SPF). <ol><li> Prima della prima incisione, iniettare 0.05 mg / kg di buprenorfina sottocutanea. </li><li> Utilizzare sevoflurano a 3-3,5 vol% per l&#39;anestesia generale. Una perdita del riflesso del pizzico del piede indica un&#39;anestesia sufficiente. </li><li> Coprire gli occhi dei topi anestetizzati con unguento ophtalmico per evitare l&#39;essiccazione della cornea. </li><li> Restringere i topi in posizione supina su un piccolo tavolo. </li><li> Rasare l&#39;addome con un rasoio elettrico (la crema depilatoria può essere utilizzata alternativamente) e disinfettare con almeno 3 volte la cloressina / iodio e l&#39;alcool del 70% in alternativa. </li><li> Coprire il campo chirurgico con tende sterili. NOTA: l&#39;uso di antibiotici perioperatori è facoltativo e soggetto a linee guida istituzionali. </li></ol></li><li> Laparotomia midline e esposizione del cecum <ol><li> Usare forbici (bisturi possono essere usati alternativamente) per effettuare una piccola incisione mediana (3 - 5 mm) della pelle sull&#39;addome inferiore. Prendete la muscolatura della parete addominale con le pinze e accuratamente incise con forbici, aprendo così la cavità addominale. </li><li> Identificare e attentamente esternalizzare il cecum con pinze atraumatiche. Posizionare la cassa cieca del cecum sull&#39;addome che punta cranialmente. </li><li> Una volta esteriorizzato, mantenere il cecum umido utilizzando tamponi salini caldi in ogni momento. </li></ol></li><li> Iniezione ortotopica, chiusura dell&#39;addome e recupero postoperatorio <ol><li> Per l&#39;iniezione intracecale, utilizzare una siringa standard da 1 ml con una cannula da 30 G. Montare questa siringa su una pompa di microinjection, che viene a sua volta montata su un micromanipulator. </li><li> Cogliere con cautela la punta del cecum con le pinze atraumatiche e lisciandola delicatamente accarezzandola in discesaD con un secondo set di pinze inumidito con salina calda. </li><li> Posizionare la cannula direttamente sopra il cecum. </li><li> Eseguire le seguenti operazioni sotto controllo visivo con un microscopio chirurgico binoculare. </li><li> Afferrare con cautela il cecum con due pinze atraumatiche ad entrambe le estremità della parte esterna del cecum, leggermente allungare e poi lentamente tirarlo sopra la cannula posta in posizione parallela e direttamente sopra. È fondamentale non perforare l&#39;intera parete intestinale (iniettando le cellule nel lumen) e non perforare la serosa oltre il punto iniziale di penetrazione, in quanto ciò porterebbe alla perdita e alla diffusione peritoneale. <ol><li> Spostare l&#39;intestino verso la cannula, non la cannula verso l&#39;intestino. Tenere e allungare l&#39;intestino tra due pinze. Le mani del chirurgo devono poggiare su una superficie per ridurre il tremito. </li></ol></li><li> Iniettare le cellule tra la serosa (considerata come sottile strato traslucido sopra il thE vasi sanguigni intramurali) e la muscularis. La cannula deve quindi essere visivamente posta sopra i vasi sanguigni e sotto la sottile membrana traslucida. </li><li> Utilizzare un interruttore a pedale per avviare l&#39;iniezione per ridurre il tremito mentre la cannula è all&#39;interno della parete intestinale. </li><li> Una volta che la cannula è in posizione, avviare l&#39;iniezione. Utilizzare una durata di 20 s, con conseguente impostazione di 1 μL / s sull&#39;unità di controllo della pompa. NOTA: L&#39;iniezione in o in prossimità di un vascello sanguigno danneggiato porta ad una diffusione intravascolare diretta e a metastasi distanti e pertanto deve essere evitata. </li><li> Dopo aver completato l&#39;iniezione, rimuovere attentamente la cannula tirandola indietro. </li><li> Posizionare un tampone asciutto sotto il cecum e poi sciacquare accuratamente il cecum con acqua distillata per liscivare le cellule perdute e quindi evitare la diffusione peritoneale artificiale. </li></ol></li><li> Chiusura dell&#39;addome e recupero postoperatorio <ol><li> Dopo rInserire, riportare delicatamente il cecum alla cavità addominale. </li><li> Chiudere la parete addominale con suture da 6-0 rapidamente assorbibili. </li><li> Chiudere la pelle con le ferite chirurgiche. </li><li> Posizionare il mouse su una mappa di riscaldamento impostata a 38 ° C finché non sia stata completamente recuperata dall&#39;anestesia. </li><li> Osserva attentamente la condizione postoperatoria dei topi per i prossimi 48 h. In caso di disturbi, trattare con 0,05 mg / kg di buprenorfina ogni 12 ore. </li><li> Monitorare i topi almeno una volta al giorno per segni di sofferenza a causa della crescita del tumore. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento delle cellule tumorali circolanti da campioni di sangue intero NOTA: Ottenere il sangue mediante puntura cardiaca transcutanea su topi anestetizzati, seguita da eutanasia. Idealmente, 1.000 μL di sangue vengono prelevati in una siringa pre-riempita con 100 μL di un anticoagulante (acido etilendiammetraceico (EDTA) o eparina). Utilizzare una EpCAM anti-umana (adesione delle cellule epitelialiMolecola) per identificare i CTC. Questo funziona molto bene se le linee cellulari epiteliali umane vengono utilizzate nel modello del mouse. Per altri apparecchi potrebbero essere necessari diversi anticorpi. <ol><li> Arricchimento CTC: <ol><li> Pre-riempire i tubi da 15 mL con un campione di gradiente di densità di 5 mL e trasferire con cura il sangue nel tubo da 15 mL. </li><li> Centrifugare (30 min a 300 xg senza freno) e rimuovere con cura il supernatante superiore. </li><li> Versare il resto in un nuovo tubo da 15 ml e centrifugare (15 min, 300 xg con freno). </li><li> Recuperare l&#39;interfaas contenente le cellule mononucleari (scartare il resto) e lavare le cellule due volte con PBS. </li><li> Resuspendere il pellet in 200 μl PBS / 1% EDTA e aggiungere 4 μL di anticorpo EpCAM. Incubare 20 minuti sul ghiaccio al buio. </li></ol></li><li> Screening e raccolta <ol><li> Preparare il seguente buffer (in seguito denominato buffer picking): PBS + 10% siero di vitello fetale (FCS) + 1% Penicillina / STreptomicina (1%) + 0,8% EDTA. </li><li> Utilizzare una penna PAP per disegnare un cerchio di ~ 1 cm in un piatto di Petri sterile da 6 cm (impedisce la dispersione del liquido nel piatto) e pipetta 700 μL di tampone raccoglitore in questo cerchio. </li><li> Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare al tampone di raccolta di 700 μl all&#39;interno del cerchio. Controllare la densità delle cellule con il microscopio. Distribuire il campione in piatti diversi se è troppo denso. </li><li> Attendere che le cellule si stabiliscano (~ 5 min). </li><li> Schermate la goccia di sospensione cellulare per le cellule colorate (= EpCAM). </li><li> Una volta trovata una cellula, raccogliere la cellula con il micromanipolatore e metterla in un buffer di 50 μL a seconda dell&#39;analisi a valle ( ad es. , Tampone di estrazione RNA o campione di coltura). </li><li> A seconda delle analisi a valle previste, isolare le cellule e / o il mezzo negativo di EpCAM come controlli negativi. </li><li> Procedere con analisi a valle ( ad esempio , cultura cellulare, PCR). </li></ol></li></ol>

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<li>Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inducible%2C+Large-Intestine-Specific+Transgenic+Mouse+Model+for+Colitis+and+Colitis-Induced+Colon+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research.</a> Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).</li>
<li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nonostante la loro attività preclinica dimostrata nei modelli del topo sottocutaneo, la grande maggioranza dei nuovi composti non riesca a sperimentare cliniche e non raggiunge mai la clinica. 11 Questa evidente insufficienza dei modelli del topo sottocutaneo per simulare accuratamente i modelli di biologia e crescita dei tumori ha portato allo sviluppo di modelli ortotopici a base di iniezione di cellule tumorali direttamente nell&#39;organo originale. I modelli di t...

Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle cause più comuni della morte del cancro nei paesi occidentali. 1 Mentre il tumore primario può spesso essere ripreso, il verificarsi di metastasi distanti peggiora drasticamente la prognosi e spesso porta alla morte. 2 , 3 Il correlato biologico della metastasi è la circolazione delle cellule tumorali (CTC), che si staccano dal tumore, sopravvivono in circolazione, si attaccano all&#39;epitelio nell&#39;organo bersaglio, invadono l&#39;organo e, in ultima analisi, superano le nuove lesioni. 4 Anche se i CTC sono noti per essere di rilevanza prognostica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 la loro biologia è solo in parte capita a causa della loro estrema rarità nel CRC. 10 I modelli del mouse sono un potente tOol per studiare vari aspetti della biologia del cancro. I modelli classici tumorali sottocutanei vengono prodotti mediante iniezione sottocutanea di cellule tumorali in topi riceventi, che possono essere immunocompetenti (se vengono utilizzate cellule tumorali murine singeniche) o immunodeficienti. I modelli tumorali sottocutanei sono poco costosi e producono dati veloci; La loro crescita del tumore a punto finale può essere facilmente misurata e non invasiva. Tuttavia, l&#39;88% dei nuovi composti che hanno dimostrato un&#39;attività antitumorale in tali modelli non riescono a studi clinici. 11 Ciò è in parte dovuto alle differenze tra le specie umane e topi; Tuttavia, gran parte di questo fallimento è dovuto al basso valore predittivo dei modelli del topo sottocutaneo. I modelli di topo ortotopico, in cui le cellule tumorali vengono iniettate nell&#39;organo d&#39;origine e quindi crescono nel loro microambiente originale, sono quindi sempre più utilizzate nella ricerca sul cancro. 11 , 12 , </sUp&gt; 13 , 14 I modelli ortotopici non solo simulano le condizioni di crescita tumorale locale; Come risultato del sito anatomicamente corretto della crescita tumorale, i modelli ortotopici del mouse permettono anche una simulazione realistica di metastasi e sono quindi utilizzati per studiare la biologia CTC 8 , 15 , 16 o la loro risposta a diversi trattamenti in CRC. 13 , 17 Uno svantaggio maggiore dei modelli di topi ortotopici è la loro complessità tecnica. A seconda dell&#39;organo in cui le cellule devono essere iniettate, la curva di apprendimento finché lo sperimentatore non è in grado di indurre tumori riproducibili è piuttosto lunga. Ciò vale in particolare per i modelli del cancro del colon-retto, in quanto le cellule tumorali devono essere iniettate nella parete intestinale, che spesso provoca perforazioni, perdite di cellule tumorali o perdita cellulare tumorale endoluminale. Questo unL&#39;obiettivo è quello di descrivere il metodo di preparazione cellulare dai campioni di tessuto primario, dalle linee cellulari 2D e dalla cultura organoidea 3D e dalla loro iniezione nel cecum dei topi. La tecnica qui descritta porta a tumori altamente uniformi e, a seconda della biologia tumorale della linea cellulare utilizzata per l&#39;iniezione, la riproducibile formazione di metastasi distinte e CTC nei topi riceventi. 15

<table><tbody><tr><td>Terreni e componenti per colture cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Glutamax-I Supplement (200 mM)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++</td></tr><tr><td>medium Penicillina/ Streptomicina (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>terreno di base di linee cellulari 2D (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>terreno di base di linee cellulari 2D (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>TrypLE Express tampone di dissociazione enzimatica</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matrice di membrana basale Matrigel (BMM, senza rosso fenolo)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 6/48 pozzetti con coperchio</td><td>Pallone per colture cellulari CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2;, 250 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>pallone per colture cellulari 150 cm&sup2;, 600 mL</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf provette 1,5 mL / 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 mL, 50 mL</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Vetrini di conteggio (per contatrice TC20)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur (vetro, 150 mm)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>estratte sottilmente con un bruciatore bunsen</td></tr><tr><td>delicatamenteDissociatore MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>per la preparazione del tessuto tumorale primario</td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>per la preparazione del tessuto tumorale primario</td></tr><tr><td>delicate MACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>per la preparazione del tessuto tumorale primario</td></tr><tr><td>Kit di dissociazione del tumore umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>per la preparazione</td></tr> <tr><td>del tessuto tumorale primarioFalcon 70 &micro; m Cell Strainer</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>352350</td><td>per la preparazione del tessuto tumorale primario</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Surgical Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Ossigeno</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>medicale</td><td>Air Liquide Medical</td> GmbH-Buprenorfina <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Temgesic-Bepanthen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- unguento oftalmico</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina normale 0,9% (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Braun</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml (senza volume morto) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>30G ago per iniezione</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>tamponi di cellulosa</td><td>Lohmann & Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forcipe</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbice dell'iride - ToughCut</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi Olsen-Hegar</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Kit</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgico sutura)</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per anestesia da tavolo per la ricerca con risciacquo O2 e vaporizzatore di sevoflurano</td><td>Pompa UltraMicro Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>con controller Micro4</td><td>World Precision Instruments</td> Attrezzatura <td>UMP3-4</td><td>per iniezione ortotopica altamente controllata</td></tr><tr><td>Interruttore a pedale per controller SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments</td><td>15867</td><td>attrezzatura per iniezione ortotopica ad alto controllo</td></tr><tr><td>Micromanipolatore manuale a tre assi</td><td>World Precision Instruments</td><td>Attrezzatura M325</td><td>per iniezione ortotopica ad alto controllo</td></tr><tr><td>Supporto magnetico per micromanipolatore</td><td>World Precision Instruments</td> Attrezzatura <td>M10</td><td>per iniezione ortotopica ad alto controllo</td></tr><tr><td>Piastra di base in acciaio per supporto magnetico M10</td><td>World Precision Instruments</td><td>5479</td><td>attrezzatura per iniezione ortotopica altamente controllata</td></tr><tr><td>Hot Plate 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Rasoio per capelli</td><td>AESCULAP - Braun-Microscopio</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>chirurgico binoculare</td><td>Parkland Scientific</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>CTC isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente di densità medio &ndash; Ficoll</td><td>StemCell - Lymphoprep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-umano CD326 (EpCAM) Clone di anticorpi 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-topo CD326 (EpCAM) Clone di anticorpi G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish, 60 x 15 mm, 21 cm&sup2;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per colture cellulari a fluorescenza</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r Micromanipolatore</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td><td>Pompa di aspirazione Eppendorf</td><td></td><td>collegata al micromanipolatore</td></tr><tr><td>Dmz Universal Microelectrode Puller</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>necessaria per la produzione di microcapillari per l'aspirazione di singole cellule</td></tr><tr><td>Capillari in vetro prismatico</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life</td><td>Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>tampone di prelievo</td></tr><tr><td>Fetale Siero di vitello (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>tampone di prelievo</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>tampone di prelievo</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>tampone di prelievo</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Immunoistochimica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clone di anticorpi CD326 (EpCAM) purificato 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM immunoistochimica (cfr, fig. 2C)</td></tr><tr><td>HRP coniglio anti-topo IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM immunoistochimica (cf, fig 2C)</td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Nonostante i vantaggi di una facile applicabilità e di un rapporto costo-efficacia, i modelli del topo sottocutaneo presentano gravi limitazioni e non simulano accuratamente la biologia tumorale e la diffusione delle cellule tumorali. I modelli di topo ortotopico sono stati introdotti per superare queste limitazioni; Tuttavia, tali modelli sono tecnicamente impegnativi, specialmente negli organi cavi come il grande intestino. Al fine di produrre tumori uniformi che crescono e metastasiano in modo affidabile, le tecniche standardizzate per la preparazione e l&#39;iniezione delle cellule tumorali sono critiche. Abbiamo sviluppato un modello di topo orthotopico del cancro del colon-retto (CRC) che sviluppa tumori altamente uniformi e può essere utilizzato per studi di biologia tumorale e studi terapeutici. Le cellule tumorali da tumori primari, linee cellulari 2D (2D) o organoidi tridimensionali (3D) vengono iniettati nel cecum e, a seconda del potenziale metastatico delle cellule tumorali iniettate, formano tumori altamente metastatici. Inoltre,I CTC possono essere trovati regolarmente. Qui descriviamo la tecnica della preparazione delle cellule tumorali da entrambe le linee cellulari 2D e dagli organoidi 3D, nonché dal tessuto tumorale primario, le tecniche chirurgiche e di iniezione, nonché l&#39;isolamento di CTC dai topi tumorali e suggerimenti per la risoluzione dei problemi.

La generazione di tumori colorettali di successo e riproducibile in questo modello dipende in maniera critica da un&#39;iniezione precisa delle cellule senza perdite o perdite. Se questo è stato raggiunto, questo modello è estremamente affidabile e molto raramente si traduce in una diffusione peritoneale artificiale. La cinetica di crescita dei tumori così come i loro modelli di disseminazione dipendono dalla biologia degli organoidi e delle cellule usate. 15 Ment...

Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l&#39;iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello.

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

L'obiettivo generale di questa tecnica microchirurgica è iniettare cellule tumorali del colon-retto nella parete cecale per indurre tumori del colon-retto riproducibili e metastatici nei topi. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule tumorali circolanti; i suoi principali vantaggi sono i tumori altamente riproducibili e uniformi, che permettono una previsione affidabile dello stadio tumorale e delle cellule tumorali circolanti. Iniziare utilizzando pinze atraumatiche per esteriorizzare con attenzione il cieco di un topo immunocompromesso di età compresa tra le sei e le otto settimane.Posizionare l'estremit&agrave; cieca del ceco sull'addome in modo che la sacca sia orientata in direzione craniale. Per l'iniezione intra-ciecale, montare una siringa standard da un millilitro dotata di un'ago da 30 gauge e caricarla con le cellule tumorali, quindi fissarla a una pompa per microiniezioni montata su un micromanipolatore. Successivamente, utilizzare pinze atraumatiche per afferrare con cura l'apice del ceco e usare una seconda pinza, inumidita con soluzione salina tiepida, per lisciare delicatamente il ceco con movimenti discendenti.Ora posizionare l'animale sotto un microscopio chirurgico binoculare e, con la cannula direttamente parallela e sopra il cieco, utilizzare due pinze atraumatiche per allungare con cura il tessuto alle due estremità dell'estremità del cieco esteriorizzata. Tirare lentamente il cieco sopra la cannula, avendo cura di non perforare l'intera parete o la sierosa oltre il punto iniziale di penetrazione, e posizionare la cannula al di sopra dei vasi sanguigni e al di sotto della sottile membrana traslucida all'interno della parete. Quando la cannula è in posizione, utilizzare un pedale per iniettare 20 microlitri di cellule nell'arco di 20 secondi.Tra la sottile tonaca sierosa traslucida, al di sopra dei vasi intramurali e della muscolare. Una volta che tutte le cellule sono state iniettate, rimuovere con cura la canula e posizionare un tampone asciutto sotto il cieco. Per prevenire una disseminazione peritoneale artificiale, lisare eventuali cellule fuoriuscite mediante un accurato risciacquo con acqua distillata e reinserire delicatamente il cieco nella cavità addominale.Chiudere la parete addominale con suture continue a rapido assorbimento e la cute con clip chirurgiche per ferite. Successivamente, posizionare il topo su un tappetino riscaldante impostato a 38 gradi celsius, monitorandolo fino al completo recupero della posizione decubito. Per isolare le cellule tumorali circolanti, al termine sperimentale appropriato, riempire provette coniche da 15 millilitri con cinque millilitri di mezzo per gradiente di densità per ogni provetta e trasferire con attenzione i campioni di sangue intero prelevati da animali portatori di tumore sui livelli del gradiente di densità.Separare le cellule mediante centrifugazione ed estrarre con attenzione l'interfaccia contenente le cellule mononucleate. Pipettare le cellule mononucleate in un nuovo tubo da 15 millilitri per una seconda centrifugazione. Seguire con lavaggi del tubo in PBS.Dopo il secondo lavaggio, risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS, integrato con EDTA, e aggiungere quattro microlitri di anticorpo anti-amp cAMP a ciascun campione, quindi incubare per 20 minuti sul ghiaccio al buio. Successivamente, utilizzare una penna con barriera idrofoba per tracciare un cerchio di circa un centimetro in una piastra di Petri sterile da sei centimetri per ogni campione e aggiungere 700 microlitri di buffer di prelievo in ciascun cerchio, seguiti da 50 microlitri di sospensione cellulare. Utilizzare un microscopio per verificare la densità delle cellule e lasciare sedimentare i campioni per circa cinque minuti.Quindi, esaminare la goccia di cellule per la positività ad amp camp e utilizzare il micromanipolatore per trasferire le cellule di interesse in 15 microlitri del tampone appropriato per l'analisi successiva prevista. L'uso di cellule del colon-retto in questo modello determina in modo affidabile un numero maggiore di topi entro 35 giorni dall'iniezione delle cellule tumorali, con tumori primari che misurano circa 10 millimetri di dimensione e con metastasi epatiche e polmonari e cellule tumorali circolanti quasi sempre presenti. Inoltre, le cellule tumorali circolanti possono essere facilmente isolate per l'analisi successiva.Una volta padroneggiata e se eseguita correttamente, questa tecnica può essere completata entro 10 minuti, facilitando la formazione di tumori uniformi e metastatici che possono essere utilizzati sia per studi terapeutici che molecolari. I limiti del modello includono la sua dipendenza dalle cellule lisate, che presentano limitazioni proprie, nonché l'immunodeficienza dei topi, entrambi fattori che possono essere superati mediante l'uso di cellule di cancro del colon-retto mutate. Data la sua semplicità, questo modello potrebbe rappresentare un valido complemento ai modelli attualmente disponibili per il cancro del colon-retto.

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Ricerca sul cancro

Due tecniche possono essere usate per stabilire questo modello: l'iniezione di una sospensione di cellule tumorali nella parete del cieco o il trapianto di un pezzo di tumore sottocutaneo sul cieco. Questo modello è utile per studiare la naturale progressione del tumore del colon-retto e test nuovi agenti terapeutici contro il cancro del colon-retto.

Topo Modello ortotopico di cancro colorettale

Questo video descrive il protocollo per stabilire un modello murino di metastasi spontanee di xenotrapianti derivati da pazienti con cancro del colon-retto o PDX. Questi modelli di xenotrapianto imitano parzialmente le caratteristiche dei carcinomi umani e comprendono gli aspetti critici delle neoplasie maligne umane, tra cui l'invasione e le metastasi.

Modelli murini di metastasi spontanee: una piattaforma per studiare il potenziale metastatico delle cellule di cancro colorettale iniettate ortotopicamente

Questo video descrive il protocollo per la generazione di metastasi da parte degli organoidi CRC derivati da PDX marcati con lentivirus GFP nella milza di un topo immunodeficiente. Le micrometastasi tumorali che colonizzano altri organi possono essere rilevate utilizzando un microscopio a fluorescenza per valutare l'espressione di GFP.

Stabilire un modello murino sperimentale di metastasi: impianto di cellule organoidi CRC che esprimono GFP nel modello PDX per rilevare le micrometastasi

Il video descrive la tecnica per l'iniezione intracecale di cellule cancerose per sviluppare un modello murino ortotopico con tumori altamente uniformi. Pertanto, il modello murino ortotopico consente una simulazione realistica delle metastasi, fornendo uno strumento prezioso per studiare i cambiamenti fenotipici durante la crescita e la disseminazione del tumore.

Iniezione intracecale di cellule tumorali: una tecnica per fornire cellule tumorali per stabilire un modello murino di cancro colorettale ortotopico

Questo video descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule tumorali circolanti dal campione di sangue intero di un modello murino di tumore colorettale soppresso. Queste CTC isolate possono essere coltivate e utilizzate per l'analisi a valle prevista.

Isolamento CTC da un campione di sangue intero: un metodo per ottenere CTC da un modello di cancro colorettale murino

È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo importante nelle metastasi tumorali. Qui, viene descritto un metodo per l'isolamento e la propagazione di CTC dal sangue intero di un modello di tumore murino singenico di metastasi da carcinoma epatocellulare (HCC).

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Per consentire la rivelazione altamente sensibile del cancro colorettale umano diffondere cellule (CRC), colonizzando tessuti, mostriamo qui un protocollo per la trasduzione efficiente delle particelle lentivirali proteina fluorescente verde (GFP) in cellule di organoid PDX-derivato CRC prima del loro iniezione nel destinatari topi, con osservazione al microscopio stereo-fluorescenza.

Rilevamento ad alta sensibilità dei Micrometastases generati da GFP trasdotte Lentivirus Organoids coltivate da un tumore del Colon paziente-derivato

Questo protocollo descrive la generazione di modelli di xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente infondendo inmodo vesicalmente cellule carcinoma a cellule urotemaliali o cellule di cancro colorettale intra-rettale in diabete/grave non obesi immunodeficienza (NOD/SCID) per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l'influenza delle cellule stromali del linfonodo, che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane.

Modelli di Xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente per carcinoma a cellule uroteliali umane e crescita del tumore del tumore colorettale e metastasi spontanea

L'iniezione della vena porta di organoidi del cancro del colon-retto (CRC) genera metastasi epatiche ricche di stroma. Questo modello murino di metastasi epatiche CRC rappresenta uno strumento utile per studiare le interazioni tumore-stroma e sviluppare nuove terapie dirette dallo stroma come le terapie geniche mediate da virus adeno-associate.

Iniezione di vena porta di organoidi del cancro del colon-retto per studiare le metastasi epatiche Stroma

Questo protocollo descrive l'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nella parete cieca di topi immunodeficienti. Il modello ricapitola la malattia metastatica del carcinoma colorettale avanzato e consente la valutazione di nuovi farmaci terapeutici in uno scenario clinicamente rilevante di metastasi polmonari ed epatiche.

L'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nei topi ricapitola il cancro colorettale avanzato

Questo studio si concentra sull'induzione sottocutanea in vivo di cellule tumorali colorettali luminescenti in un modello murino e sulla successiva misurazione della luminescenza utilizzando un sistema di imaging. La procedura mira a stabilire un modello di crescita tumorale riproducibile per il monitoraggio in tempo reale e la valutazione terapeutica.

Iniezione sottocutanea di cellule tumorali del colon-retto umano in topi nudi atimici per valutare l'efficacia antitumorale

Scopri una tecnica microchirurgica per isolare cellule tumorali circolanti in un modello ortotopico di cancro colorettale nel topo. Questo metodo riproducibile consente di studiare la metastasi e la progressione tumorale in vivo.

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

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