I neuroni di imaging all'interno di sezioni di cervello spesse Uso del metodo di Golgi-Cox

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare il trattamento efficace sulla morfologia dei neuroni all'interno del cervello dei roditori. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come la morfologia normale e manipolata sperimentalmente dei neuroni all'interno di varie regioni del cervello dei roditori. Questa tecnica ha il vantaggio principale di aumentare la probabilità di identificare e visualizzare neuroni marcati che sono completamente contenuti all'interno di singoli campioni istologici.

Iniziare la colorazione di Golgi-Cox inserendo un cervello di topo fresco in una fiala di vetro scintillante da 20 millilitri contenente 17 millilitri di soluzione di Golgi-Cox. Proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 25 giorni. Una volta trascorso il periodo di incubazione, Cryo protegge il cervello inserendolo in 40 millilitri di saccarosio crioprotettore e incuba al buio a 4 gradi Celsius per 24 ore.

Dopo l'incubazione nel saccarosio, il cervello può essere congelato per la conservazione a lungo termine o immediatamente bloccato per il sezionamento, come mostrato nella sezione successiva del video. In caso di congelamento, immergere l'intero cervello in 200 millilitri di isopentano che è stato preraffreddato su ghiaccio secco. Quindi posizionare il cervello congelato in un tubo conico da 50 millilitri e conservarlo al buio a meno 80 gradi Celsius.

Per iniziare, rimuovi il cervello dal saccarosio. E usa una lama di rasoio per bloccarlo per il sezionamento tagliando il cervelletto, lasciando un bordo piatto all'estremità caudale rimanente del cervello. Il cervello deve essere bloccato con un angolo preciso per garantire che i neuroni di interesse siano completamente contenuti all'interno delle sezioni risultanti.

Ad esempio, utilizziamo un piano coronale perfettamente perpendicolare all'asse caudale rostrale per i neuroni piramidali della corteccia cerebrale. Quindi, scaldare l'agar fino a quando non si sarà sciolto. E lascialo raffreddare fino a quando non sarà leggermente al di sopra del suo punto di fusione.

Quindi metti il cervello in un piccolo piatto usa e getta con l'estremità caudale rivolta verso il basso. Aggiungi l'agar fuso per coprire il cervello. Una volta che l'agar si è solidificato, taglia l'eccesso lasciando circa due o quattro millilitri intorno al cervello.

Quindi usa una piccola quantità di cianoacrilato di etile per incollare il cervello allo stadio di un vibratomo con l'estremità caudale rivolta verso il basso. Riempi l'area del palco del vibratomo con abbastanza saccarosio crioprotettore da coprire il cervello. Quindi sezionare il cervello con uno spessore della fetta da 400 a 500 micron a seconda della regione del cervello da esaminare.

Utilizzando un piccolo pennello, posizionare le sezioni cerebrali nei pozzetti di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti contenente inserti inferiori in rete e preriempita con tampone fosfato M saccarosio. Proteggere dalla luce durante il sezionamento. Al termine del sezionamento, incubare le sezioni al buio a quattro gradi Celsius durante la notte.

Utilizzando gli inserti inferiori in rete, trasferire le sezioni cerebrali in un nuovo pozzetto contenente cinque millilitri di paraformaldeide in tampone fosfato. Incubare su un bilanciere muovendosi a bassa velocità a temperatura ambiente al buio per 15 minuti. Lavare due volte le sezioni trasferendole in nuovi pozzetti contenenti cinque millilitri d'acqua.

Proteggere dalla luce e lavare a velocità moderata a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, trasferire le sezioni in un nuovo pozzetto contenente cinque millilitri di idrossido di ammonio. Oscilla lentamente al buio a temperatura ambiente per 15 minuti.

Lavare due volte le sezioni trasferendole in nuovi pozzetti contenenti cinque millilitri d'acqua. Lavare su un bilanciere muovendosi a velocità moderata al buio a temperatura ambiente per cinque minuti. Trasferire le sezioni in un nuovo pozzetto contenente cinque millilitri di fissativo A.Incubare su un bilanciere muovendosi a bassa velocità al buio a temperatura ambiente per 25 minuti.

Lavare le sezioni in acqua due volte come prima. Usa un piccolo pennello per posizionare le sezioni su un vetrino da microscopio, quindi usa una pinzetta e un piccolo fazzoletto per rimuovere l'acqua e l'agar in eccesso. Assicurarsi che tutto l'agar sia stato rimosso prima di procedere con le fasi di disidratazione.

Lasciare asciugare le sezioni all'aria a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Il tempo di essiccazione appropriato è fondamentale e deve essere determinato per ogni laboratorio. Un tempo troppo breve può causare la caduta di sezioni dai vetrini durante le fasi di disidratazione e un tempo troppo lungo può causare la rottura di sezioni.

Dopo l'asciugatura, immergere prima i vetrini nell'agente di pulizia per cinque minuti. Posizionare i vetrini in etanolo al 100% per cinque minuti. Quindi passare attraverso una serie di concentrazioni decrescenti di etanolo per due minuti ciascuna.

Dopo la serie alcolica, mettere i vetrini in acqua per cinque minuti. Quindi colorare in violetta cresil allo 0,5% in acqua per sette minuti. Dopo la colorazione viola cresillabe, immergere i vetrini in acqua per due minuti.

Quindi disidratare le sezioni attraverso una serie di concentrazioni alcoliche crescenti per due minuti ciascuna. Quindi due lavaggi in etanolo al 100% per cinque minuti. Mettere in agente di compensazione per cinque minuti.

Infine, aggiungere un mezzo di montaggio anidro e posizionare un vetrino coprioggetti sulle sezioni. Lasciare asciugare i vetrini orizzontalmente al buio a temperatura ambiente per almeno cinque giorni. Per acquisire pile di immagini ad alta risoluzione dell'area contenente il neurone di interesse, selezionare prima un obiettivo a immersione in olio di silicone 30X 1,05 NA sul microscopio.

Quindi applicare tre o quattro gocce di olio da immersione siliconico sul vetrino. Posizionare l'obiettivo sopra il vetrino, assicurandosi che sia a contatto tra l'obiettivo e l'olio. Metti a fuoco l'immagine e regola le impostazioni della fotocamera, inclusa l'esposizione e il bilanciamento del bianco, nel software di imaging.

Quindi, imposta i limiti superiore e inferiore per la pila di immagini posizionando lo stato attivo sulla parte superiore della sezione, quindi selezionando Imposta accanto alla parte superiore della pila all'interno della finestra di acquisizione delle immagini. Quindi concentrati sulla parte inferiore della sezione e seleziona Imposta accanto alla parte inferiore della pila. Impostare la distanza del passo su un micron inserendo un micron accanto alla distanza tra le immagini all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine.

Infine, acquisisci la pila di immagini selezionando acquisisci pila di immagini all'interno della finestra di acquisizione delle immagini. Ripeti i passaggi precedenti per catturare l'intera area di interesse, assicurandoti che tutte le pile di immagini si sovrappongano di almeno il 10% sugli assi X e Y. Questa immagine della corteccia cerebrale è una proiezione Z unita di pile di immagini acquisite da una sezione spessa 500 micron utilizzando un obiettivo 10X.

Il tessuto in questa immagine è stato elaborato utilizzando il protocollo principale all fresh. L'area indicata dal quadrato rosso è stata ripresa utilizzando un obiettivo a immersione in olio di silicio 30X ed è stata acquisita una pila di immagini di proiezione Z unita a risoluzione più elevata. La freccia rossa mostra la proiezione Z bidimensionale di un neurone che è stato tracciato dalla pila di immagini 30X ad alta risoluzione.

Qui è stata utilizzata la variante del protocollo fresco con colorazione con violetto cresilico. Questa immagine a risoluzione più alta mostra la sezione colorata di viola cresile. E questo è il tracciamento dei neuroni ottenuto.

Infine, questo tessuto è stato processato utilizzando la variante del protocollo in cui i cervelli vengono congelati dopo l'impregnazione di Golgi-Cox. Qui il tessuto precedentemente congelato è visibile a una risoluzione più elevata. E ancora una volta si ottiene una proiezione Z bidimensionale di alta qualità del tracciamento dei neuroni.

Questa tecnica può essere completata entro un mese e le fasi di elaborazione e imaging possono essere completate entro l'ultima settimana. In alternativa, i cervelli possono essere congelati dopo l'impregnazione di Golgi-Cox, consentendo di completare l'elaborazione e l'imaging in un secondo momento. Seguendo questa procedura, i neuroscienziati possono utilizzare le immagini catturate per eseguire analisi morfologiche dettagliate come la complessità dei dendriti o la densità della colonna vertebrale al fine di determinare come una manipolazione sperimentale possa alterare la struttura dei neuroni all'interno del cervello.