Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

Preparazione e taglio con vibratomo. Sono necessari tre blocchi di agar per stabilizzare il cervello durante la procedura di taglio. Per evitare contaminazioni, utilizzare un set di strumenti sterilizzati in autoclave.

Rimuovere l'agar. Deve essere asciugato sulla carta da filtro prima di essere incollato sulla piastra metallica con colla medica a base di cianoacrilato. Mediante una spatola, rimuovere il cervello e posizionarlo con cura nella capsula di Petri riempita con il mezzo di preparazione.

Successivamente, asciugare brevemente il cervello sulla carta filtrante. Coprire la piastra metallica con colla medica a base di cianoacrilato. Utilizzare le pinzette e la spatola per posizionare il cervello sul supporto del campione.

Utilizzare i due pezzi di agarosio preparati in precedenza per garantire stabilità meccanica da entrambi i lati. A questo punto, il cervello deve essere posizionato accanto al blocco di agarosio e stabilizzato con altri due blocchi per prevenire danni durante il taglio. Posizionare la piastra metallica nel vibratomo e coprire il tessuto con mezzo di preparazione freddo.

In seguito, dissezionare orizzontalmente il tessuto in fette di OHSC spesse 350 micrometri utilizzando un vibratomo a slitta. Trasferire le fette nella piastra di Petri, utilizzando la parte posteriore di una pipetta Pasteur rotta per raccogliere le fette. Mantenere le fette cerebrali in mezzo di preparazione freddo.

Valutare le sezioni otticamente con un microscopio binoculare. Separare la regione ippocampale e l'entorinale mediante un bisturi con lama rotonda di dimensione 15. È importante prelevare solo le sezioni con citarchitettura intatta, isolate dalla parte media dell'ippocampo compresa tra l'ippocampo dorsale e quello ventrale.

Gli OHSC di bassa qualità devono essere scartati immediatamente. Trasferire due o tre delle fette ottenute in un inserto per coltura cellulare con una dimensione dei pori di 0,4 micrometri. Aspirare un mezzo di preparazione dalla parte superiore dell'inserto per coltura cellulare utilizzando una pipetta di Pasteur.

Posizionare l'inserto in una piastra da coltura a sei pozzetti contenente un millimetro di mezzo di coltura per pozzetto. Incubare le piastre a sei pozzetti a 35 gradi Celsius in atmosfera completamente umidificata con 5%CO2 e cambiare il mezzo di coltura cellulare ogni due giorni. Dopo sei giorni di coltura per tessuto di ratto, o 14 giorni per tessuto murino, le reazioni infiammatorie associate alla procedura di taglio sono scomparse.

Ora possono essere condotti esperimenti. Risultati rappresentativi per studi di neuroprotezione. L'immagine parte A mostra OHSC non lesi mantenuti in mezzo di coltura per nove giorni in vitro senza alcun trattamento, funzionanti come fette di controllo.

Come confermato dalla microscopia confocale a scansione laser, gli OHSC di controllo hanno mostrato una buona conservazione neuronale. Le cellule microgliali positive per l'isolectina B4 erano principalmente localizzate negli strati molecolare e plessiforme ed esprimevano un fenotipo ramificato. Nello strato granulare del giro dentato, sono state trovate solo pochissime cellule microgliali positive per l'isolectina B4 e praticamente nessun nucleo positivo per il propidio ioduro.

Un altro set di OHSC, mostrato nella parte dell'immagine B, è stato mantenuto in mezzo di coltura per sei giorni, lesionato con NMDA 50 micromolare per quattro ore e successivamente mantenuto in mezzo di coltura per altri tre giorni. Dopo la lesione da NMDA, si è osservata un'ampia accumulazione di cellule microgliali attivate, positive per l'isolectina B4, aderenti al sito del danno neuronale, in tutti gli strati del giro dentato.

L'analisi quantitativa ha rivelato che nello strato cellulare granulare del giro dentato, il numero di microglia positiva per l'isolettina B4 era maggiore negli OHSC lesi rispetto alle condizioni di controllo. In modo analogo, il numero di neuroni in degenerazione positivi per l'ioduro di propidio era fortemente aumentato nello strato cellulare granulare delle fette lesionate con NMDA. Risultati campione per gli studi sull'invasione tumorale.

Tutte le immagini mostrano i risultati dell'invasione tumorale SS utilizzando OHSC, acquisite con un microscopio confocale a scansione laser. Il colore rosso evidenzia la citarchitettura di OHSC e le cellule tumorali in verde. L'immagine A mostra un tipico modello di invasione per cellule di glioblastoma U138 lasciate invadere per quattro giorni.

Possono essere osservati tumori chiari, sferici e ben definiti e la struttura dell'OHSC sembra essere intatta, con un giro dentato e una Cornu Ammonis chiaramente visibili. L'immagine B mostra un diverso modello di invasione, generato dalle cellule di glioblastoma LN229 dopo quattro giorni. In questo caso, i singoli tumori non possono essere chiaramente distinti a causa della rete formata che ricopre gran parte dell'OHSC, anche se la citotecnica rimane intatta con un giro dentato e una Cornu Ammonis non deformati.

Si può inoltre concludere che le cellule LN229 sono più invasive rispetto alle cellule U138. Le immagini C e D mostrano lo stesso risultato di invasione tumorale per le cellule LN229 dopo quattro giorni di invasione. Sul lato sinistro, si può osservare che la massa tumorale copre quasi tutto il campo visivo.

L'immagine D mostra la corrispondente colorazione con ioduro di propidio. In questa sezione, la citotessitura non è più integra poiché l'ippocampo non è più visibile e il giro dentato risulta anch'esso distorto. Una possibile spiegazione di questo risultato potrebbe essere un OHSC non completamente integro all'inizio dell'esperimento, un numero eccessivo di cellule tumorali applicate o un tempo di invasione troppo lungo, che ha portato alla perdita di struttura osservata.

Pertanto, questo tipo di risultati di invasione devono essere scartati. Le colture organotipiche di fette ippocampali rappresentano un ottimo modello in vitro che riflette la fisiologia del cervello con connessioni neuronali integre. Poiché da un singolo modello è possibile ottenere diverse colture di fette, è possibile testare molteplici condizioni su tessuti provenienti da un unico animale e i risultati sono altamente riproducibili.

Per il loro elevato grado di accessibilità, le colture organotipiche di tessuto ippocampale sono particolarmente adatte per una molteplicità di tipi sperimentali. Questi includono studi elettrofisiologici e di neurogenesi, ma anche esperimenti sul neuroprotezione, sull'invasione tumorale e sulle interazioni tra cellule tumorali e tessuto cerebrale sano.