Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

Preparazione e affettatura con vibratomo. Sono necessari tre blocchi di agar per stabilizzare il cervello durante la procedura di affettatura. Per evitare la contaminazione, utilizzare un set di strumenti per autoclave.

Togliete l'agar. Deve essere asciugato sulla carta da filtro prima di incollarla sulla piastra metallica con colla cianoacrilica medica. Per mezzo di una spatola, rimuovere il cervello e metterlo con cura nella capsula di Petri riempita con il terreno di preparazione.

Quindi, asciugare brevemente il cervello sulla carta da filtro. Coprire la piastra metallica con colla cianoacrilica medicale. Usa le pinzette e la spatola per posizionare il cervello sul portacampioni.

Utilizzare i due pezzi di agar precedentemente preparati per garantire la stabilità meccanica da entrambi i lati. A questo punto, il cervello deve essere posizionato accanto al blocco di agar e stabilizzato con altri due blocchi per evitare danni durante l'affettatura. Posizionare la piastra metallica nel vibratomo e coprire il fazzoletto con un terreno di preparazione freddo.

Successivamente, sezionare il tessuto orizzontalmente in OHSC di 350 micrometri di spessore utilizzando un vibratomo scorrevole. Trasferire le fette nella capsula di Petri, utilizzando il retro di una pipetta Pasteur rotta per raccogliere le fette. Conservare le fette di cervello in un mezzo di preparazione freddo.

Valutare otticamente le fette con un microscopio binoculare. Separa la regione ippocampale ed entra nella corteccia interna usando un bisturi con una lama rotonda di misura 15. È importante prendere solo quelle fette all'interno della citoarchitettura intatta isolate dalla parte centrale dell'ippocampo tra l'ippocampo dorsale e quello ventrale.

Le OHSC di bassa qualità devono essere scartate immediatamente. Trasferire due o tre delle fette ottenute in un inserto di coltura cellulare con una dimensione dei pori di 0,4 micrometri. Aspirare un terreno di preparazione dalla parte superiore dell'inserto di coltura cellulare utilizzando una pipetta Pasteur.

Posizionare l'inserto in un piatto di coltura a sei pozzetti contenente un millimetro di terreno di coltura per pozzetto. Incubare le piastre a sei pozzetti a 35 gradi Celsius in atmosfera completamente umidificata con il 5% di CO2 e cambiare il terreno di coltura cellulare ogni due giorni. Dopo sei giorni di coltura per il tessuto di ratto, o 14 giorni per il tessuto murino, le reazioni infiammatorie associate alla procedura di affettamento sono scomparse.

Ora è possibile condurre esperimenti. Risultati rappresentativi per studi di neuroprotezione. La parte A dell'immagine mostra OHSC non lesionato conservato in terreno di coltura per nove giorni in vitro senza alcun trattamento che funga da fette di controllo.

Come confermato dalla microscopia a scansione laser confocale, l'OHSC di controllo ha mostrato una buona conservazione neuronale. Le cellule microgliali positive all'isolectina B4 erano localizzate principalmente negli strati molecolari e plessiformi e mostravano un fenotipo ramificato. Nello strato cellulare granulare del giro dentato, sono state trovate solo pochissime cellule microgliali positive all'isolectina B4 e praticamente nessun nucleo positivo allo ioduro di propidio.

Un altro set di OHSC, mostrato nell'immagine parte B, è stato tenuto in terreno di coltura per sei giorni, lesionato con 50 NMDA micromolare per quattro ore. E conservato in terreno di coltura per altri tre giorni. Dopo la lesione NMDA, un massiccio accumulo di cellule microgliali attivate positive all'isolectina B4 ha aderito al sito del danno neuronale, in tutti gli strati del giro dentato.

L'analisi quantitativa ha rivelato che nello strato di cellule granulari del giro dentato, il numero di cellule microgliali positive all'isolectina B4 era più alto nell'OHSC lesionato rispetto alle condizioni di controllo. In modo simile, il numero di neuroni degenerativi positivi allo ioduro di propidio era fortemente aumentato nello strato cellulare granulare delle fette lesionate NMDA. Risultati di esempio per studi sull'invasione tumorale.

Tutte le immagini mostrano i risultati dell'invasione tumorale SS utilizzando OHSC che sono stati ripresi con un microscopio a scansione laser confocale. Il colore rosso evidenzia la citoarchitettura delle cellule tumorali OHSC e il verde. L'immagine A mostra un tipico modello di invasione per le cellule di glioblastoma U138 che sono state lasciate invadere per quattro giorni.

Si possono osservare tumori chiari, sferici e distinti e la struttura OHSC sembra essere intatta con un giro dentato chiaramente visibile e Cornu Ammonis. L'immagine B mostra un diverso pattern di invasione, generato dalle cellule di glioblastoma LN229 dopo quattro giorni. In questo caso, i singoli tumori non possono essere chiaramente distinti a causa della rete formata che copre la maggior parte dell'OHSC, anche se la citoarchitettura rimane intatta con un giro dentato non deformato e Cornu Ammonis.

Si può inoltre concludere che le cellule LN229 sono più invasive delle cellule U138. Le immagini C e D mostrano lo stesso risultato di invasione tumorale per le cellule LN229 dopo quattro giorni di invasione. Sul lato sinistro, si può osservare che la massa tumorale copre quasi tutto il campo visivo.

L'immagine D mostra la corrispondente tintura allo ioduro di propidio. In questo vetrino, la citoarchitettura non è più intatta in quanto l'ammonide di Cornu non è più visibile e anche il giro dentato è distorto. Una possibile ragione per un tale risultato potrebbe essere un OHSC che non era completamente intatto all'inizio di quell'esperimento, un numero troppo elevato di cellule tumorali applicate o un tempo di invasione troppo lungo che ha provocato la perdita di struttura osservata.

Pertanto, questo tipo di risultati di invasione dovrebbe essere scartato. Le colture organotipiche di fette ippocampali rappresentano un ottimo modello in vitro che riflette la fisiologia del cervello con connessioni neuronali intatte. A partire da un modello, è possibile ottenere diverse colture di fette, consente di testare più condizioni nei tessuti di un animale e i risultati sono altamente riproducibili.

Grazie all'elevato grado di accessibilità, le colture organotipiche di fette ippocampali sono particolarmente adatte per una moltitudine di tipi sperimentali. Ciò include studi elettrofisiologici e di neurogenesi, ma anche esperimenti sulla neuroprotezione, l'invasione tumorale e le interazioni delle cellule tumorali con il tessuto cerebrale sano.