Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

L'obiettivo generale di questo protocollo di coltura cellulare post-mortem rapido è quello di generare colture cellulari durevoli derivate da pazienti di glioma pontino intrinseco diffuso per facilitare gli esperimenti necessari per comprendere e, in ultima analisi, sviluppare terapie efficaci per il DIPG. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla biologia fondamentale e sulle strategie terapeutiche per il glioma pontino intrinseco diffuso, ad esempio se alcuni farmaci funzionano in diverse colture derivate da pazienti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette lo studio diretto della biologia delle cellule derivate dai pazienti.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per la DIPG, perché consente di testare diverse strategie terapeutiche in diversi sottotipi genetici della malattia. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul DIPG, può essere applicato anche ad altre malattie, come altri gliomi pediatrici di alto grado, glioblastomi adulti o altri tumori del sistema nervoso centrale. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà, perché è difficile procurarsi ed elaborare rapidamente i campioni dell'autopsia in modo efficiente.

Prima della preparazione del campione, sterilizzare la cappa di coltura tissutale, insieme alle lame di rasoio, agli emostatici curvi e ad altri strumenti non sterili sotto la luce UV per un'ora ed eseguire tutti i passaggi seguenti in condizioni sterili. Quindi, trasferire il tessuto in una piastra di coltura cellulare a parete alta di 100 millimetri per 20 millimetri. Rimuovere il terreno rimasto dalla spedizione e sostituirlo con 10-15 millilitri di terreno di coltura a freddo.

Quindi, usando gli emostatici curvi per afferrare una lama di rasoio, tritare finemente il tessuto rimuovendo i vasi sanguigni o le meningi. I frammenti di tessuto finali dovrebbero essere più piccoli di un millimetro. Successivamente, trasferisci il fazzoletto in un tubo conico pulito da 50 millilitri.

Lavare la piastra di coltura cellulare con altri cinque millilitri di terreno di coltura freddo e trasferire il campione nella provetta conica. Ripetere questa fase di lavaggio se necessario per trasferire il fazzoletto rimanente. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, triturare delicatamente il campione per quattro o cinque volte.

Lasciare che i frammenti di tessuto più grandi si depositino sul fondo del tubo. Se necessario, centrifugare brevemente il campione per un minuto. Per raccogliere la frazione dissociata, rimuovere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro da 100 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri etichettato come Dissociazione Meccanica.

Capovolgere il filtro sulla provetta conica originale e lavarla con terreni di coltura per recuperare i frammenti di tessuto. Successivamente, centrifugare la frazione di dissociazione meccanica per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il surnatante dalla frazione di dissociazione meccanica pellettata e risospendere il tessuto in terreni di coltura freddi.

Se ci sono più di cinque millilitri di tessuto nel tubo conico di dissociazione meccanica, dividere il tessuto in altri tubi conici da 50 millilitri in modo tale che nessun tubo abbia più di cinque millilitri di tessuto. Quindi, conservare la frazione dissociata meccanicamente su ghiaccio fino alla fase di centrifugazione in gradiente di saccarosio. In questa procedura, centrifugare la provetta conica contenente i frammenti di tessuto rimanenti per cinque minuti.

Successivamente, rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione di digestione enzimatica preriscaldata, in modo tale che ci siano cinque millilitri di soluzione di digestione per ogni millilitro di tessuto. Quindi, sigillare il coperchio della provetta conica con pellicola da laboratorio e incubare la reazione su un rotatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, triturare delicatamente i campioni.

Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, pipettare il campione su e giù per sei-otto volte ed evitare di generare bolle d'aria eccessive. Quindi, aggiungere un puntale per pipetta da 1.000 microlitri all'estremità della pipetta e triturare il campione per altre sei-otto volte. Lasciare che i pezzi rimanenti si depositino sul fondo del tubo.

Quindi, rimuovere e filtrare il surnatante con le cellule ancora sospese attraverso un filtro da 100 micron in una nuova provetta conica da 50 millilitri etichettata come dissociazione enzimatica e conservarla sul ghiaccio. Successivamente, centrifugare la provetta di dissociazione enzimatica per cinque minuti e continuare con la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Se il campione è ancora sospeso in soluzione, centrifugarlo per cinque minuti.

Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere il tessuto in 20 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio. Quindi, portare il volume fino a 25 millilitri con HBSS freddo. Aggiungere lentamente 25 millilitri di soluzione di saccarosio 1,8 molare e capovolgere il tubo per mescolare.

Ciò si traduce in un gradiente di saccarosio molare di 0,9 molari. Successivamente, centrifugare il campione senza interruzioni per 10 minuti. Aspirare con cura i detriti di mielina in quanta più soluzione possibile di saccarosio e saccarosio.

Quindi, lavare il campione aggiungendo 30 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio e mescolando delicatamente. Dopodiché, centrifugare per cinque minuti. In questa procedura, rimuovere il surnatante di lavaggio.

Aggiungere cinque millilitri di tampone di lisi ACK e risospendere delicatamente il pellet cellulare, facendo roteare il tubo per un minuto a temperatura ambiente. Quindi, spegnere la lisi aggiungendo 30 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio. Successivamente, centrifugarlo per cinque minuti.

Risospendere il pellet cellulare finale in 10-15 millilitri di TSM completo caldo con fattori di crescita e quantificare la densità cellulare vitale su un emocitometro, utilizzando l'esclusione del blu di tripano. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare finale in un nuovo pallone di coltura T75. Aggiungere ulteriori fattori di crescita a giorni alterni per mantenere i livelli complessivi dei fattori di crescita e monitorare lo sviluppo delle neurosfere delle cellule tumorali.

Ecco vari esempi di come i campioni possono apparire dalle prime fasi della coltura a una coltura duratura. Inizialmente, le colture piastrate e precoci spesso non sembrano contenere molte cellule sopravvissute. Inoltre, i primi cluster cellulari spesso non mostrano il grado di contrasto tipicamente associato alle neurosfere.

Tuttavia, il passaggio iniziale di questi gruppi di cellule, combinato con il filtraggio inverso dei gruppi di cellule, può isolare cellule tumorali sane che sono in grado di formare sfere. Il filtrato contiene tipicamente detriti residui. Questi campioni derivati dal paziente possono quindi essere mantenuti in coltura per più passaggi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che il campione sia mantenuto a temperatura fredda in ogni fase, ad eccezione della dissociazione enzimatica, e ridurre al minimo la manipolazione traumatica del campione. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori studi, come lo screening farmacologico in vitro o lo xenotrapianto ortotopico, per rispondere alle domande successive sulla patobiologia DIPG.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica di coltura ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuro oncologia pediatrica per esplorare nuove strade terapeutiche per i bambini con DIPG. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come eseguire rapidi protocolli di coltura cellulare post-mortem su campioni di tumore cerebrale. Non dimenticare che lavorare con i tessuti umani può essere pericoloso e che dovrebbero essere sempre utilizzate precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale e tecniche sterili.