Name: Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Impara un protocollo per la coltura cellulare post-mortem rapida di DIPG per studiare la biologia tumorale e testare strategie terapeutiche. Questo metodo consente di generare colture derivate dal paziente per ricerche oncologiche pediatriche.

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Gli autori ringraziano il sostegno della Fondazione Claire McKenna, Istituto Nazionale di Malattie Neurologiche e Stroke (NINDS K08NS070926 e R01NS092597), Dipartimento della Difesa (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 e RN3-06510), Limonata di Alex stand Foundation, The Cure Starts Now Foundation e DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Fondazione, Unravel Pediatric Cancer, Infanzia Brain Tumor Foundation, Matthew Larson Foundation, V Foundation, Fondo Famiglia Goffredo in memoria di Fiona Penelope, la DIPG Fondazione Wayland Villars, il Dylan Jewett , Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, e Jennifer Kranz Memorial fondi, N8 Foundation, Virginia e Fondo Ludwig DK per la ricerca sul Cancro, Bambino Health Research Institute presso la Stanford Anne T. e Robert M. Bass Dotati Facoltà Borsa di studio in Pediatric cancro e malattie del sangue.

Questo protocollo è stato eseguito con l&#39;approvazione dal nostro comitato istituzionale di revisione con adeguate de-identificazione di tutti i dati dei pazienti e in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Ottenere tutto appropriato istituzionale approvazione board review e il consenso informato da parte della famiglia del paziente prima di lavorare con questo protocollo. 1. Ottenere campioni di tessuto NOTA: Una componente fondamentale di questo protocollo richiede una corretta gestione della donazione di tessuti a partire immediatamente al momento della autopsia. La vitalità complessiva del campione dipende in modo significativo a ridurre al minimo l&#39;intervallo post mortem (PMI), immediatamente trasferire il tessuto nel mezzo freddo appropriata integrata con antibiotici / antimicotici, mantenendo il campione in ghiaccio durante il trasporto, e il mantenimento di una tecnica sterile in tutto il protocollo. <ol><li> Dopo la notificadi una donazione imminente, preparare un kit per la raccolta del campione. Utilizzando una scatola di spedizione con un contenitore isolato che può essere utilizzato direttamente per il trasporto di ritorno del campione di tessuto, comprendere i materiali seguenti: <ol><li> Includere materiali per la preparazione sterili, compresi i guanti sterili, tende, e bisturi. </li><li> Include 8 - 10 sterili 50 provette coniche ml contenente 30 mezzi di trasporto ml nel contenitore isolato con ghiaccio o impacchi freddi. NOTA: Durante qualsiasi supporto standard di coltura cellulare può funzionare, la migliore redditività del campione si ottiene con Hibernate-A integrato con antibiotico / antimicotico. </li><li> Includere eventuali ulteriori tubi di esempio per altre analisi (ad esempio, fissativi). </li><li> Se l&#39;autopsia non sarà eseguita presso la sede del sperimentatore, includere un documento che indichi chiaramente come raccogliere il campione di tumore. Questo include dettagli come il mantenimento della sterilità, mantenendo le provette dei campioni in ghiaccio, e compresi i campioni dal mesencefalo e midollo come tumor cellule spesso invadono queste regioni. </li></ol></li><li> Mantenere la sterilità durante l&#39;autopsia. Considerare il cervello sterile all&#39;interno del cranio, in modo da osservare una tecnica sterile (compresi i guanti spogliatoi) una volta che il cranio è aperto. Evitare la contaminazione con la pelle e dei capelli è fondamentale. </li><li> Sezionare il tumore dal lato ventrale (la &quot;pancia&quot; del ponte, vedi Supplemental Figura 1). Con un bisturi sterile, tagliare piccoli pezzi 1 cm dal tumore e trasferire immediatamente in mezzi di trasporto a freddo (vedi NOTA al punto 1.1.2) e mettere in ghiaccio bagnato. Mettere 10 mL di tessuto in ogni provetta, risultando in un volume finale di tessuto e media in ogni provetta di 40 mL. NOTA: Nel caso di DIPG, il tumore infiltra diffusamente il ponte e spesso il resto del tronco cerebrale. In quanto tale, raccogliere la maggior quantità di campione il più possibile, in genere di cui 3 - 4 tubi (30 - 40 ml di tessuto) dal ponte e 1 - 2 tubi (10 - 20 mL di tessuto) ciascuno da mesencefalo e midollo. </li><li> raccogliere samples dal mesencefalo e midollo giustapposta alle Pons, che spesso contengono molte cellule tumorali. </li><li> Dopo la raccolta del campione, spedire i campioni O / N sul ghiaccio bagnato nel contenitore isolato. Non spedire il campione in ghiaccio secco, come il congelamento uccidere le cellule. </li></ol> 2. Preparazione per l&#39;elaborazione del campione <ol><li> Prima di iniziare la preparazione del campione, sterilizzare cappe di coltura tissutale con lame di rasoio, emostatiche curve, e tutti gli altri strumenti non sterili sotto la luce UV per 1 ora. Eseguite tutte le seguenti operazioni in condizioni sterili per evitare la contaminazione delle culture. </li><li> Preparare e soluzioni di filtro sterili. <ol><li> Per preparare 1,8 M soluzione di saccarosio, sciogliere 308,07 g di saccarosio in 300 ml di acqua distillata. Aggiungere 50 ml 10x Hank&#39;s-Buffered Saline Solution (HBSS) senza calcio o magnesio e portare il volume totale a 500 ml con acqua distillata. Conservare a 4 ° C. </li><li> Per preparare la soluzione digestione enzimatica, prendere 50 mL HBSS con calcio e magnesio per ogni 10 ml di tessuto tritato e aggiungere 500 microlitri 5 mg / mL deossiribonucleasi I (concentrazione finale 50 mg / mL), 500 microlitri 2,5 mg / ml di collagenasi I / II e soluzione dispasi (concentrazione finale 25 ug / mL), e 500 microlitri di buffer 1 M HEPES. soluzione di digestione Preriscaldare a bagnomaria C 37 °. </li><li> Per preparare stelo supporto (TSM) di base del tumore, mescolare 250 mL Neurobasal-A, di 250 mL Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 mL 100x antibiotico-antimicotico, 5 ml 200 mm L-alanil-L glutammina dipeptide (Glutamax-A), 5 mL tampone HEPES, 5 mL 100 mM sodio piruvato, e 5 mL 100x MEM aminoacidi non essenziali. </li><li> Per preparare completa TSM con fattori di crescita, aggiungere i seguenti supplementi a base di TSM: 50x B27 Supplemento Minus vitamina A (1:50), fattore di crescita epidermico umano (H-EGF, 20 ng / mL), fattore di crescita fibroblasti umani (H- FGF, 20 ng / mL), fattore di crescita derivato dalle piastrine umane AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),umano piastrine-derivato fattore di crescita BB (H-PDGF-BB, 10 ng / mL), e la soluzione di eparina (2 mg / mL). </li></ol></li><li> Preraffreddamento una centrifuga da laboratorio dotato di un rotore oscillante benna a 4 ° C. </li></ol> 3. La dissociazione meccanica <ol><li> Trasferire il tessuto in un 100 millimetri piatto di coltura cellulare di alto pareti x 20 mm. Rimuovere avanzi di supporti da spedizione e sostituirli con 10 - 15 mL terreni di coltura freddo. </li><li> Utilizzando i hemostats curve di cogliere una lama di rasoio, tritare finemente il tessuto durante la rimozione dei vasi sanguigni evidenti o meningi. NOTA: I frammenti di tessuto finale dovrebbe essere inferiore a 1 mm (vedere Figura 1B). </li><li> Trasferire il tessuto in un tubo da 50 ml pulito. Lavare il piatto di coltura cellulare con l&#39;aggiunta di 5 ml di terreni di coltura freddo e trasferire al tubo conico. Ripetere questa fase di lavaggio se necessario per trasferire il tessuto rimanente. </li><li> Utilizzando una pipetta sierologica 10 mL, triturare delicatamente (4 - 5 volte). Consentire tiss più grandiframmenti ue di depositarsi sul fondo della provetta. Se necessario, centrifugare brevemente il campione per 1 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Raccogliere la frazione dissociato meccanicamente. <ol><li> Rimuovere il surnatante e filtrare attraverso un filtro 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml etichettata &quot;dissociazione meccanica.&quot; Invertire il filtro sul tubo conico originale e lavare con terreni di coltura per recuperare i frammenti di tessuto. </li><li> Centrifugare la frazione &quot;dissociazione meccanica&quot; per 5 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Rimuovere il surnatante dalla frazione pellet &quot;dissociazione meccanica&quot; e risospendere il tessuto in terreni di coltura freddo. Se vi è più di 5 mL di tessuto nel tubo conico &quot;dissociazione meccanica&quot;, dividere il tessuto in altri tubi 50 mL coniche tale che nessun tubo ha più di 5 mL di tessuto. </li></ol></li><li> Conservare la frazione meccanicamente dissociato in ghiaccio fino alla fase di centrifugazione gradiente di saccarosio (Step 5). In alternativa, la frazione meccanicamente dissociato può passare al punto 5 durante il periodo di incubazione di dissociazione enzimatica (Passo 4.4). </li></ol> 4. enzimatica dissociazione <ol><li> Se vi è più di 5 mL di tessuto nel tubo contenente i frammenti di tessuto grandi rimanenti, dividere il tessuto in altre nuove provette coniche da 50 ml tale che nessun tubo ha più di 5 mL di tessuto. </li><li> Centrifugare la provetta conica (s) contenente i frammenti di tessuto rimanenti per 5 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione preriscaldata digestione enzimatica, tale che vi sia soluzione di digestione 5 mL per ogni 1 mL di tessuto (ad esempio, 25 mL soluzione di digestione per 5 mL di tessuto). </li><li> Sigillare le palpebre tubo conico con parafilm e incubare la reazione su un rotatore a 37 ° C per 30 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, triturare i campioni delicatamente (vedi Figura 1C). <ol><li> Utilizzando una pipetta sierologica 10 mL,pipetta il campione su e giù per 6 - 8 volte. Evitare la generazione di bolle d&#39;aria eccessive. </li><li> Aggiungere una punta di pipetta 1000 microlitri alla fine della pipetta e triturare altri 6 - 8 volte. </li><li> Lasciare i restanti pezzi di depositarsi sul fondo della provetta. Rimuovere e filtrare il surnatante con le cellule ancora in sospensione attraverso un filtro 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml con l&#39;etichetta &quot;enzimatica dissociazione&quot; e memorizzare sul ghiaccio. </li><li> Se significativi frammenti di tessuto rimangono, aggiungere un ulteriore 10 mL HBSS con calcio e magnesio ai frammenti e ripetere i punti 3.5.1 e 3.5.2. Filtrare la soluzione finale attraverso un filtro 100 micron nel tubo &quot;enzimatica dissociazione&quot;. </li></ol></li><li> Centrifugare il tubo &quot;enzimatica dissociazione&quot; per 5 min (350 xg, 4 ° C) e proseguire al saccarosio centrifugazione in gradiente. </li></ol> 5. saccarosio centrifugazione in gradiente <ol><li> Se i campioni sono ancora sospese in soluzione, centrifuge per 5 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il tessuto in 20 mL HBSS freddo senza calcio e magnesio. Portare il volume fino a 25 mL totale con HBSS freddo. </li><li> Aggiungere lentamente 25 ml di 1,8 M soluzione di saccarosio e capovolgere il tubo per mescolare. Ciò si traduce in un gradiente di saccarosio 0,9 M. </li><li> Centrifugare senza freno per 10 min (800 xg, 4 ° C). Utilizzando un freno centrifugazione interromperà il gradiente e ridurre la resa (vedere Figura 1D per un esempio di un campione prima e dopo centrifugazione). </li><li> attenzione aspirare detriti mielina e tanto soluzione di saccarosio possibile. Lavare il campione aggiungendo 30 mL HBSS freddo senza calcio e magnesio e mescolando delicatamente. Centrifugare per 5 min (350 xg, 4 ° C). </li></ol> 6. ACK Globulo rosso Lysis <ol><li> Rimuovere il surnatante lavaggio. Aggiungere 5 ml di tampone di lisi ACK e risospendere delicatamente il pellet cellulare, agitando la provetta per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Placare la lYsis aggiungendo 30 mL HBSS freddo senza calcio e magnesio. </li><li> Centrifugare per 5 min (350 xg, 4 ° C). </li></ol> 7. Manutenzione Cultura iniziale <ol><li> Risospendere il pellet cellulare finale in 10 - 15 mL caldo completo TSM con fattori di crescita e quantificare la densità di cellule vitali su un emocitometro utilizzando trypan esclusione blu. NOTA: La gamma di cellule vitali varia ampiamente a seconda delle circostanze della donazione di tessuti, e la quantificazione può essere difficile in questa fase iniziale a causa di detriti cellulari avanzi. In un caso ideale, puntare ad avere un milione di cellule vive per campione. Nei casi in cui rimane detriti eccessivo la piastra ad una densità più bassa in un pallone T175. </li><li> Trasferire le sospensioni cellulari finali ad un nuovo pallone di coltura T75. Spike in fattori di crescita supplementari ogni altro giorno per mantenere i livelli complessivi di fattori di crescita, e monitorare lo sviluppo delle cellule tumorali neurosfere (vedi Figura 1E e Figura 2). </li><li>In alternativa, le cellule di processo enzimaticamente dissociate per ulteriori analisi, tra cui citometria a flusso e fluorescenza-attivato l&#39;ordinamento delle cellule. </li><li> Dopo lo sviluppo di neurosfere (che in media prende 3 - 4 settimane, ma varia da pochi giorni a finchè 2 mesi), il filtro di invertire il campione utilizzando un filtro a rete di nylon 100 micron per ridurre la quantità di detriti. NOTA: Il filtrato deve essere mantenuta in coltura nel caso in cui singole cellule vitali o piccole sfere sono presenti. </li><li> Garantire l&#39;integrità e la purezza della cultura eseguendo DNA fingerprinting mentre passaging, confrontando il campione iniziale del paziente. </li></ol>

<ol><li>Fisher, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinicopathologic+reappraisal+of+brain+stem+tumor+classification.+Identification+of+pilocystic+astrocytoma+and+fibrillary+astrocytoma+as+distinct+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities.</a> Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).</li>
<li>Johung, T. B., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma%3A+New+Pathophysiological+Insights+and+Emerging+Therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic.</a> Curr. Neuropharmacol. , (2016).</li>
<li>Cage, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility%2C+safety%2C+and+indications+for+surgical+biopsy+of+intrinsic+brainstem+tumors+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children.</a> Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).</li>
<li>Puget, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+in+a+series+of+130+pediatric+diffuse+intrinsic+Pontine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas.</a> Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).</li>
<li>Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+rethink+the+unthinkable%3A+Upfront+biopsy+of+children+with+newly+diagnosed+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+%28DIPG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Blood+Cancer%22%5BJournal%5D)">Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG).</a> Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).</li>
<li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paediatric+and+adult+glioblastoma%3A+multiform+%28epi%29genomic+culprits+emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge.</a> Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).</li>
<li>Jones, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+genetic+and+epigenetic+mechanisms+driving+paediatric+diffuse+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma.</a> Nat. Rev. Cancer. , (2014).</li>
<li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+landscape+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+and+pediatric+non-brainstem+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).</li>
<li>Fontebasso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+somatic+mutations+in+ACVR1+in+pediatric+midline+high-grade+astrocytoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).</li>
<li>Buczkowicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+diffuse+intrinsic+pontine+gliomas+identifies+three+molecular+subgroups+and+recurrent+activating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating.</a> Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).</li>
<li>Monje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-responsive+candidate+cell+of+origin+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+xenograft+mouse+model+of+diffuse+pontine+glioma+designed+for+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing.</a> J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).</li>
<li>Grasso, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+defined+therapeutic+targets+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Med. , 1-10 (2015).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Orthotopic+Transplantation+of+Fresh+Surgical+Specimen+Preserves+CD133+%2BTumor+Cells+in+Clinically+Relevant+Mouse+Models+of+Medulloblastoma+and+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma.</a> Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).</li>
<li>Becher, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+radiation+and+perifosine+in+a+genetically+and+histologically+accurate+model+of+brainstem+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma.</a> Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).</li>
<li>Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+embryonic+stem+cells+to+model+pediatric+gliomas+with+H3.3K27M+histone+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation.</a> Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo per il trattamento rapido di post-mortem donazioni tessuto tumorale sviluppare colture cellulari derivati da pazienti, che può essere utilizzato in una varietà di in vitro o in vivo. A causa della natura di lavorare con campioni autoptici, mantenendo campione redditività rappresenta una sfida significativa. Diversi fattori, tra cui l&#39;intervallo post-mortem ad autopsia o il tempo richiesto per il trasporto del tessuto, dovrebbe essere minimizzato il più possibile, ma spesso sono difficili da controllare. Nella nostra esperienza, un intervallo post-mortem di meno di 6 - 8 ore (dal momento della morte al tempo che il tessuto è messo in ghiaccio il trasporto freddo e mezzi di trasporto), ha dato le migliori possibilità di stabilire una coltura cellulare durevole. E &#39;meglio quindi ricevere il tessuto in laboratorio entro 24 ore, e di processo per la cultura immediatamente dopo il ricevimento. Poiché la posizione di questi casi rari varia ampiamente, ela qualità della fase di recupero tessuto influenza fortemente le possibilità di successo, la logistica di eseguire l&#39;autopsia può essere difficile. In molti casi, al fine di ottenere i tempi di 6-8 ore, non è possibile condurre la raccolta dei tessuti in un centro accademico. Invece, avere un servizio di recupero dei tessuti su chiamata per recuperare il tessuto tumorale alla camera ardente in un protocollo IRB approvato è spesso più conveniente per il recupero dei tessuti. Ottenere il consenso informato in anticipo della morte è raccomandato e facilita la pianificazione logistica. Si raccomanda vivamente la preparazione di kit autopsia indipendenti con istruzioni chiare e approfondite e forniture sterili per tessuti di recupero (guanti, tende, bisturi). Inoltre, stabilire punti di vantaggio della comunicazione tra l&#39;investigatore, patologo, e pompe funebri è critica. Ad esempio, il ricercatore deve discutere il protocollo con il patologo prima l&#39;autopsia ed evidenziare gli errori più comuni. Questi errori comprendono microcontaminazione BIAL (di solito lievito) durante il recupero dei tessuti, il mancato nave attraverso il trasporto e la mancata spedizione del campione sul sufficienti ghiaccio umido in un contenitore thermoinsulated notte / accelerato. Infine, si consiglia di utilizzare un servizio di corriere porta a porta per la spedizione dei campioni per ridurre al minimo i tempi di trasporto. Si deve anche essere presa durante la dissociazione dei tessuti per preservare la vitalità cellulare. Per esempio, l&#39;uso dei mezzi di comunicazione progettata per preservare la salute del tessuto neurale per il trasporto (Hibernate-A integrato con antibiotico / antimicotico) aumenterà la probabilità di generare una cultura di successo. E &#39;anche importante mantenere il campione ad una temperatura fredda per tutto il protocollo trasferendo sempre i campioni in ghiaccio. Raccolta entrambe le frazioni di dissociazione meccanica ed enzimatici insieme a minimizzare triturazione può migliorare il successo del protocollo, in quanto entrambi i passaggi sono traumatico per le cellule. Nella nostra esperienza, mentre la maggior parte delle culture di successo nascono da entrambe le frazioni, Abbiamo avuto casi in cui uno solo dei due preparazioni stabilita una cultura durevole, potenzialmente riflette la natura delicata di questi campioni. Un altro passo traumatico nel protocollo è triturazione; una strategia che può ridurre il grado di triturazione necessaria a garantire i campioni siano completamente macinate proprio all&#39;inizio della preparazione. Altri esempi di aspetti del protocollo progettato per migliorare la redditività del campione includono tamponi aggiunta (ad esempio, HEPES) in tutto il protocollo, che è particolarmente critico durante la dissociazione enzimatica. Una possibile variante di questo protocollo per aumentare ulteriormente la vitalità cellulare è la rimozione del sangue rosso fase di lisi cellulare ACK. Tuttavia, in questo caso, è spesso allora necessario eseguire un passaggio ACK lisi durante la prima settimana di coltura per rimuovere le cellule rosse del sangue. Un altro aspetto di questo protocollo che può essere modificato è l&#39;eliminazione della mielina e detriti cellulari utilizzando una densit di saccarosioy gradiente. Specificamente, altre strategie che sono stati segnalati per migliorare la vitalità cellulare delle cellule microgliali sono possibili anche in questo passaggio, come una discontinua Percoll gradiente di densità 18 o magnetici perline rimozione mielina. Infine, la durata tra dissociazione tissutale iniziale e la comparsa di neurosfere varia tra i campioni e può richiedere da una settimana ad un mese o più. Dal momento che le culture iniziali di solito contengono un grado significativo di cellule morte e detriti cellulari, può essere difficile determinare se le cellule vitali rimangono; la coltura deve essere mantenuta per almeno 4 - 8 settimane (Figura 2). Una strategia per isolare cellule in crescita dai detriti rimanere qui viene presentato (cioè invertire filtrare gruppi di cellule e ri-placcatura in mezzi freschi). La decisione sull&#39;opportunità di continuare a mantenere una cultura è in definitiva una decisione caso per caso, sulla base di fattori ° circostantie autopsia (ad esempio, un intervallo post-mortem prolungata, i problemi durante il trasporto dei tessuti), la dissociazione dei tessuti (ad esempio, il sangue eccessivo o detriti), e come il campione appare nella cultura. Una volta che una cultura è stabilito, l&#39;identità deve essere convalidato dal DNA fingerprinting utilizzando analisi tandem repeat breve o un metodo simile, confrontando la coltura ad un campione del tumore originale conservati per questo scopo. Si consiglia di routine la convalida culture DNA fingerprinting per garantire che sia avvenuta nessuna contaminazione da altre culture, ad esempio ogni 3 - 6 mesi. La generazione di queste culture DIPG derivati ​​da pazienti rappresenta un passo importante nello sviluppo di successo delle terapie efficaci. L&#39;espansione dei modelli derivati ​​da pazienti culture DIPG e xenotrapianto disposizione sarà fondamentale per individuare le strategie terapeutiche più efficaci e, infine, superare questa malattia devastante.

DIPG è un tumore maligno del sistema nervoso centrale aggressivo che si pone nel ponte ventrale, in genere durante l&#39;infanzia a metà 1, 2. Nonostante decenni di studi clinici, il trattamento corrente è limitata alla radioterapia, che fornisce temporaneo miglioramento o la stabilizzazione dei sintomi e si estende solo sopravvivenza mediana da una media di 3 mesi. Anche con la radioterapia, la sopravvivenza globale mediana è a soli 9 mesi con il 90% dei bambini che muoiono a causa della malattia entro 2 anni dalla diagnosi iniziale. A causa della natura infiltrante del tumore e le funzioni critiche del tronco cerebrale, la resezione chirurgica non è possibile. Inoltre, negli Stati Uniti, ottenendo biopsie chirurgiche per DIPG storicamente non è stata effettuata 3, come l&#39;analisi istopatologica non ha alcun ruolo attuale nel guidare trattamento clinico e la diagnosi in genere può essere fatto da neuroimaging solo. Pertanto, la disponibilità di tessuto tumorale fo lo studio è limitato, limitando gli sforzi per condurre una ricerca su molecole di droga candidati e la biologia del tumore sottostante. In particolare, i miglioramenti nelle tecniche di neuroimaging e stereotassica hanno permesso lo sviluppo di biopsie sicuri di DIPG negli ultimi anni 4, che, se combinati con i progressi della biologia molecolare, hanno trasformato la nostra comprensione della malattia. Attualmente, più studi clinici utilizzando la biopsia in anticipo e profilo molecolare di DIPG per l&#39;individualizzazione piani di trattamento sono in corso (NCT01182350, NCT02274987) 5. DIPG e altri gliomi ad alto grado pediatrici rappresentano malattie distinte dalle loro controparti adulto glioblastoma 6, 7, e modelli sperimentali in tal modo i fedeli di DIPG sono necessari per capire la sua fisiopatologia unico e scoprire le strategie terapeutiche efficaci. Negli ultimi anni, gli sforzi per ottenere DIPG tumore t focalizzataproblema per la ricerca, al momento dell&#39;autopsia o, meno frequentemente, la biopsia hanno rivoluzionato la nostra comprensione e capacità di studiare DIPG. Gli sforzi di sequenziamento di tutto il genoma ha rivelato una mutazione ricorrente nel H3 istone, 3A famiglia (H3F3A) e istone cluster 1, H3B (HIST1H3B), che rappresenta il primo esempio di malattia umana causata da mutazioni nel istone codifica proteine 8, 9, 10, 11 . Inoltre, un sottoinsieme di DIPGs esprime mutazioni nel gene ACVR1, che non sono stati precedentemente riportati in cancro, ma sono identiche a mutazioni trovate nel congenita infanzia dello sviluppo disturbo fibrodisplasia ossificante progressiva 8, 9, 10, 11. Come pure, le prime colture cellulari DIPG derivati ​​da pazienti e ortotopico mo xenotrapiantodels sono state ora stabilito 1, 2, 12, 13, 14, così come modelli murini stabilite attraverso la xenotrapianto diretto delle cellule tumorali in topi immunodeficienti per generare xenotrapianti seriali 3, 14, 15. I primi sforzi di screening di droga che utilizzano questi modelli derivati da pazienti hanno identificato nuovi agenti promettenti per la traduzione clinica 4, 14 e hanno gettato le basi per almeno uno studio clinico (NCT02717455). Questi primi passi verso il progresso sono solo l&#39;inizio, e saranno necessari numerosi campioni di tessuto derivati ​​da pazienti e modelli di coltura per definire sottotipi della malattia e sviluppare le strategie terapeutiche più efficaci. geneticamente motoremodelli murini strati sovrapposti di DIPG faciliteranno anche studi volti a promuovere la nostra comprensione di base della malattia. Gli sforzi fatti per generare modelli genetici per DIPG saranno aiutati dagli studi genomici fondamentali di cui sopra, ma attualmente un numero limitato di opzioni sono disponibili. Uno di questi modelli, che genera istologicamente simili alto grado gliomi del tronco encefalico, utilizza la RCA / tv-un sistema virale per guidare PDGF-B sovraespressione e la perdita Ink4a-ARF nelle cellule nestina-positivo nella fossa posteriore di topi neonati 5, 16. Un altro approccio prevede ricapitolando diversi grandi mutazioni DIPG-associato (istone H3.3 K27M mutazione, perdita di p53 e di attivazione PDGFRA) in cellule precursori neurali derivate da cellule staminali embrionali umane, che è sufficiente a rendere queste cellule tumorali 6, 7, 17. La combinazione di metodi genetici e paziente derivmodelli ED consentiranno test preclinici e favorire lo sviluppo di terapie efficaci. Per affrontare le sfide per la ricerca DIPG sopra indicato, questo protocollo autopsia rapida è stata sviluppata per generare colture di cellule derivati da pazienti per le indagini 8, 9, 10, 11, 12, 14. Il protocollo mira a tutelare la vitalità del tessuto e massimizzare la probabilità di generare culture durevoli, nonostante le sfide connesse con lunghi intervalli post mortem e tempi di trasporto. Quando generato con successo, queste culture DIPG possono essere utilizzati in vitro manipolazioni in successive e in esperimenti in vivo xenotrapianto, consentendo la valutazione dei potenziali molecole terapeutiche sul paziente cellule derivate.

<table><tbody><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS con calcio / magnesio</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH (Collagenasi / Dispasi)</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>Biochemical LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>antibiotico/antimicotico</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di B27 Meno Vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Umano PDGF-AA</td><td>Shenandoah Biotecnologia</td><td>100-16</td><td></td></tr><tr><td>Umano PDGF-BB</td><td>Shenandoah Biotecnologia</td><td>100-18</td><td></td></tr><tr><td>Umano EGF</td><td>Shenandoah Biotecnologia</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Umano FGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-146</td><td></td></tr><tr><td>Lame sterili per bisturi</td><td>Bard Paker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Emostatici curvi</td><td>Strumenti di scienza</td><td>fine 13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Lame di rasoio</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Pinze sterili</td><td>TWD Tradewinds</td><td>DF8988-5</td><td></td></tr><tr><td>Teli sterili</td><td>3M</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>Guanti sterili</td><td>Kimberly Clark</td><td>1182307</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a rete da 100 micron</td><td>Fisher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Fisher</td><td>1495949A</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo per rapid post-mortem delle cellule cultura della diffusa intrinseca pontine glioma (dipg)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse intrinseca Pontine glioma (DIPG) è un tumore del tronco cerebrale infantile che trasporta una prognosi universalmente fatale. Perché la resezione chirurgica non è una strategia di trattamento vitale e la biopsia non viene eseguita di routine, la disponibilità dei campioni dei pazienti per la ricerca è limitata. Di conseguenza, gli sforzi per studiare questa malattia sono state contestate da una scarsità di modelli di malattia fedeli. Per rispondere a questa esigenza, che descriviamo qui un protocollo per la rapida elaborazione dei campioni di tessuto autopsia post-mortem al fine di generare modelli di coltura cellulare derivati da pazienti resistenti che possono essere utilizzati in test in vitro o in vivo esperimenti di xenotrapianto ortotopico. Questi modelli possono essere utilizzati per lo screening per i potenziali bersagli farmacologici e di studiare i processi patobiologici fondamentali all&#39;interno DIPG. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per analizzare e isolare le cellule tumorali e microambientali utilizzando cellulare fluorescenza-attivato (FACS), che consente la successiva analisi del gene expressione, espressione della proteina, o modificazioni epigenetiche del DNA presso la cella di massa o livello di singola cellula. Infine, questo protocollo può anche essere adattato per generare culture derivati ​​da pazienti di altri tumori del sistema nervoso centrale.

Il protocollo descritto è riassunta come un flusso di lavoro in cinque fasi con le immagini del tessuto nelle varie fasi di lavorazione in figura 1. Il campione viene prima ottenuto attraverso una rapida autopsia sterile. Durante la dissociazione meccanica, il tessuto è macinata durante la rimozione dei vasi sanguigni e meningi dal campione, e filtrata attraverso un filtro a rete in nylon 100 micron. frammenti di tessuto rimanenti sono enzimaticamente dissociate in un forno di riscaldamento. Successivamente, detriti viene ridotto mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio, isolando uno strato distinto di mielina dal campione. Inoltre, ACK lisi riduce visibilmente la quantità di globuli rossi presenti nel campione. Infine, le cellule sono placcati in mezzi privi di siero addizionato con fattori di crescita. Supplemento figura 1 è un esempio del tumore su autopsia. Il tumore cresce come una infiltrazione diffusa del ponte did le regioni limitrofe del tronco encefalico. Durante i preparativi del campione, piccoli pezzi ~ 1 cm x 1 cm devono essere tagliati e immediatamente inseriti in supporti il ​​trasporto freddo sul ghiaccio. La figura 2 mostra vari esempi di come i campioni possono apparire dalle prime fasi di coltura ad una cultura durevole. Inizialmente placcato e culture precoce (A, B) spesso non sembrano contenere molte cellule sopravvissute. Inoltre, gruppi di cellule precoci (C, D) spesso non presentano il grado di contrasto tipicamente associati con neurosfere. In particolare, la durata del tempo di coltura prima della comparsa di gruppi di cellule può richiedere settimane per un paio di mesi. Tuttavia, il passaggio iniziale di questi gruppi di cellule, combinata con filtraggio inverso di gruppi di cellule, può isolare le cellule tumorali sani che sono in grado di formare sfere (F). Il filtrato (E) in genere contiene detriti avanzi; tuttavia, si consiglia di placcatura e mantenere il filtrato e monitoraggio per<html> lo sviluppo di gruppi di cellule. Questi campioni derivati ​​da pazienti possono essere mantenute in coltura per passaggi multipli (G, H). Figura 3 dimostra la capacità di queste cellule di essere xenotrapiantati in topi. In ciascuno di questi casi, le cellule sono state transfettate con DIPG un reporter GFP-luciferasi per monitorare lo sviluppo dei tumori tramite bioluminescenza (A). I tumori possono essere esaminate istologicamente, per esempio osservare attecchimento tumorale (B) o l&#39;espressione di marcatori specifici (C). Questi modelli in vivo, combinate con saggi in vitro possono essere utilizzati per valutare gli effetti di vari farmaci o manipolazioni genetiche (ad esempio, 8, 9, 10, 11, 14). les / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. I campioni di tessuto nelle varie fasi di lavorazione. (A) ottenere il campione attraverso procedure dell&#39;autopsia sterili e spedizione durante la notte sul ghiaccio bagnato. (B) Da sinistra a destra: (riga 1) provette contenenti tessuto tumorale nei mezzi di trasporto; tessuto fresco in un piatto di coltura cellulare di 100 mm x 20 mm macinazione iniziale di tessuti; (Riga 2) tessuto parzialmente tritato; rimozione delle meningi e dei vasi sanguigni; dimensione finale di pezzi di tessuto tritato. (C) Da sinistra a destra: (riga 1) tessuto incubato su una tavola rotante in un forno a 37 ° C; (Riga 2) triturazione di tessuto attraverso una punta di pipetta 1000 microlitri collegato a una pipetta 10 ml; filtraggio del tessuto dissociato attraverso un filtro a rete in nylon 100 micron. (D) Da sinistra a destra: dissociato tessuto sospeso in 0,9 M soluzione di saccarosio prima della centrifugazione; tessuto dissociato separati in un gradiente di saccarosio dopo centrifugazione; un livello visibile odetriti f mielina sopra del gradiente di saccarosio; un pellet di cellule finale dopo ACK lisi e lavaggio. (E) Il campione finale può essere collocato nella cultura o utilizzato in altre analisi a valle. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig2.jpg" /> Figura 2. Le immagini delle colture primarie e cellule Passage presto. (A - B) Culture placcato immediatamente dopo la dissociazione (SU-DIPG-XXX, A), o che non sono ancora cresciuti neurosfere (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) comparsa precoce di neurosfere in colture primarie di SU-DIPG-XXVIII (C) e SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Primo passaggio della coltura primaria da D usando un filtro di nylon 100 micron, con la fiinfiltrato (E) e filtrato inversa (F) placcato. (G - H) neurosfere adulte del primo passaggio di SU-DIPG-XXVII (G) e il terzo passaggio di SU-DIPG-XXV (H) che crescono in coltura. Barra di scala = 200 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig3.jpg" /> Figura 3. colture cellulari paziente-derivata può innestare e formare tumori nei topi. Immagini (A) bioluminescenza di quattro diverse colture cellulari derivati da pazienti trasfettate con un reporter GFP-luciferasi. (B) sezione sagittale da un xenotrapianto mouse, mostrando le cellule tumorali trapiantate nel ponte del mouse. Verde: GFP, rosso: la proteina basica della mielina. Barra di scala = 1 mm. immunofluores (C) Esempioimmagine scenza che mostra le cellule tumorali GFP trapiantate in un cervello di topo. Blu: DAPI, Verde: GFP, Rosso: IGF2R. Barra di scala = 40 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Supplementare Figura 1. Esempio Autopsia di un tumore pontino. Immediato post mortem aspetto di una diffusa glioma pontino intrinseca. Il tumore appare come una grande massa ricca di mielina sulla superficie ventrale del ponte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa immagine.</a>

Questo protocollo descrive un metodo per la rapida trasformazione del post mortem diffuse campioni di glioma pontino intrinseca per la definizione di modelli di coltura cellulare derivati ​​da pazienti o la caratterizzazione diretta delle cellule tumorali e microambiente.

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

L'obiettivo generale di questo protocollo rapido di coltura cellulare post-mortem è generare colture cellulari durevoli derivate da pazienti con glioma intrinseco diffuso del ponte per facilitare gli esperimenti necessari a comprendere e, in ultima analisi, sviluppare terapie efficaci per il DIPG. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulla biologia di base e sulle strategie terapeutiche per il glioma intrinseco diffuso del ponte, ad esempio se determinati farmaci risultino efficaci su colture derivate da diversi pazienti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio diretto della biologia delle cellule derivate dai pazienti.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del DIPG, poiché consentono di testare diverse strategie terapeutiche su diversi sottotipi genetici della malattia. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul DIPG, può essere applicato anche ad altre malattie, come altri gliomi pediatrici di alto grado, glioblastomi negli adulti o altri tumori del sistema nervoso centrale. In generale, le persone alle prime esperienze con questa tecnica incontreranno difficoltà, poiché è complesso reperire e processare rapidamente campioni autoptici in modo efficiente.Prima della preparazione del campione, sterilizzare l'incubatrice per colture cellulari, insieme a lame di rasoio, pinze emostatiche curve e altri strumenti non sterili, sotto luce UV per un'ora ed eseguire tutti i passaggi successivi in condizioni sterili. Successivamente, trasferire il tessuto in una piastra per colture cellulari alta, di 100 millimetri per 20 millimetri. Rimuovere il mezzo residuo del trasporto e sostituirlo con 10-15 millilitri di mezzo di coltura freddo.Quindi, utilizzando pinze emostatiche curve per afferrare una lametta, tritare finemente il tessuto rimuovendo vasi sanguigni o meningi. I frammenti di tessuto finali dovrebbero essere più piccoli di un millimetro. Successivamente, trasferire il tessuto in un tubo conico sterile da 50 millilitri.Lavare la piastra per coltura cellulare con ulteriori cinque millilitri di mezzo di coltura freddo e trasferire il campione nel tubo conico. Ripetere questo passaggio di lavaggio secondo necessità per trasferire il tessuto rimanente. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, triturare delicatamente il campione da quattro a cinque volte.Lasciare depositare sul fondo del tubo i frammenti di tessuto più grandi. Se necessario, centrifugare brevemente il campione per un minuto. Per raccogliere la frazione dissociata, rimuovere il soprannatante e filtrarlo attraverso un filtro da 100 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri etichettato Dissociazione Meccanica.Rovesciare il filtro sul tubo conico originale e lavarlo con mezzo di coltura per recuperare i frammenti di tessuto. Successivamente, centrifugare la frazione di dissociazione meccanica per cinque minuti. In seguito, rimuovere il soprannatante dalla frazione di dissociazione meccanica pellettata e risospendere il tessuto in mezzo di coltura freddo.Se sono presenti più di cinque millilitri di tessuto nel tubo conico per la dissociazione meccanica, suddividere il tessuto in altri tubi conici da 50 millilitri in modo che nessun tubo contenga più di cinque millilitri di tessuto. Successivamente, conservare la frazione dissociata meccanicamente in ghiaccio fino al passaggio di centrifugazione su gradiente di saccarosio. In questa procedura, centrifugare il tubo conico contenente i frammenti di tessuto residui per cinque minuti.Successivamente, rimuovere il soprannatante e aggiungere la soluzione di digestione enzimatica preriscaldata, in modo che siano presenti cinque millilitri di soluzione di digestione per ogni millilitro di tessuto. Quindi, sigillare il coperchio del tubo conico con pellicola da laboratorio e incubare la reazione su un agitatore rotante a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, triturare delicatamente i campioni.Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, aspirare e dispensare il campione da sei a otto volte, evitando di generare bolle d'aria eccessive. Successivamente, applicare un'asticella da 1.000 microlitri alla fine della pipetta e triturare il campione per ulteriori sei a otto volte. Lasciare che eventuali frammenti rimanenti si depositino sul fondo del tubo.Quindi, rimuovere e filtrare il soprannatante con le cellule ancora sospese attraverso un filtro da 100 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri etichettato Dissociazione Enzimatica e conservarlo sul ghiaccio. Successivamente, centrifugare il tubo della dissociazione enzimatica per cinque minuti e procedere con la centrifugazione su gradiente di saccarosio. Se il campione è ancora sospeso in soluzione, centrifugarlo per cinque minuti.Successivamente, rimuovere il soprannatante e risospendere il tessuto in 20 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio. Quindi, portare il volume a 25 millilitri con HBSS freddo. Aggiungere lentamente 25 millilitri di soluzione di saccarosio 1,8 M e capovolgere il tubo per mescolare.Questo produce un gradiente di saccarosio 0,9 molare. Successivamente, centrifugare il campione senza frenata per 10 minuti. Aspirare con attenzione i detriti di mielina nella maggior quantità possibile di soluzione di saccarosio.Quindi, lavare il campione aggiungendo 30 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio, e mescolando delicatamente. Successivamente, centrifugare per cinque minuti. In questa procedura, rimuovere il soprannatante di lavaggio.Aggiungere cinque millilitri di tampone di lisi ACK e risospendere delicatamente il pellet cellulare, agitando il tubo per un minuto a temperatura ambiente. Successivamente, interrompere la lisi aggiungendo 30 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio. Infine, centrifugare per cinque minuti.Risospendere il pellet cellulare finale in 10-15 millilitri di TSM completo caldo con fattori di crescita e quantificare la densità cellulare vitale mediante emocitometro, utilizzando l'esclusione al blu di Trypan. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare finale in una nuova fiasca da coltura T75. Aggiungere fattori di crescita aggiuntivi ogni due giorni per mantenere i livelli complessivi di fattori di crescita e monitorare lo sviluppo di neurosfere da cellule tumorali.Di seguito sono riportati diversi esempi di come i campioni possono apparire dalle prime fasi di coltura fino a una coltura stabile. Inizialmente, le piastre e le colture precoci spesso non sembrano contenere molte cellule vitali. Inoltre, gli aggregati cellulari precoci spesso non mostrano il grado di contrasto tipicamente associato ai neurosfere.Tuttavia, il primo passaggio di questi aggregati cellulari, combinato con la filtrazione inversa degli aggregati cellulari, può isolare cellule tumorali sane in grado di formare sfere. Il filtrato contiene tipicamente detriti residui. Questi campioni derivati da pazienti possono quindi essere mantenuti in coltura per diversi passaggi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se svolta correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che il campione sia mantenuto a temperatura fredda in ogni passaggio, ad eccezione della dissociazione enzimatica, e minimizzare la manipolazione traumatica del campione. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere effettuati ulteriori studi, come lo screening di farmaci in vitro o il trapianto ortotopico eterologo, per rispondere a domande successive sulla patobiologia del DIPG.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica di coltura ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuro-oncologia pediatrica per esplorare nuove vie terapeutiche per i bambini affetti da DIPG. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona conoscenza su come eseguire protocolli di coltura cellulare post-mortem rapida su campioni di tumori cerebrali. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale e tecniche sterili.

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Questo video dimostra il processo di isolamento e coltura delle cellule progenitrici gliali dal glioma pontino intrinseco diffuso o dal tessuto del tronco encefalico affetto da DIPG. Le cellule gliali isolate dal tessuto tumorale tramite una digestione enzimatica vengono coltivate in un mezzo neurobasale, che ne promuove la crescita e lo sviluppo di neurosfere fluttuanti.

Isolamento e coltura di cellule da glioma pontino intrinseco diffuso

I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici.

Gli xenoinnesti glioma ortotopici primari ricapitolano la crescita infiltrativa e la mutazione isocitrato deidrogenasi I

Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.

Ottimizzazione della coltura cellulare glioma di alto grado da campioni chirurgici per l'uso in modelli animali clinicamente rilevanti e immunochimica 3D

Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Qui presentiamo un sistema di coltura motrice mista ex-vivo per lo studio della migrazione delle cellule glioma umane (hGC) in tempo reale. Questo modello fornisce la capacità di osservare le interazioni tra hGC e assoni mielinati e non mielinati all'interno di una camera compartimentata.

Monitoraggio in tempo reale della migrazione delle cellule del Glioma umano sulle coculture di Asse-Olgon-Oligodendroce

Questo lavoro descrive lo sviluppo di elettrodi interdigitati flessibili per l'implementazione in modelli 3D di tumore cerebrale, vale a dire, coltura in vitro , modello ovo e modello murino in vivo . Il metodo proposto può essere utilizzato per valutare gli effetti dei campi elettrici pulsati sui tumori a diversi livelli di complessità.

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Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

I gliomi diffusi di basso grado con mutazione IDH1 sono tumori rari e difficili da coltivare. Introduciamo un metodo di espianto semplice e non enzimatico che preserva l'espressione della proteina IDH1-mutante e sostiene le colture per mesi. È importante sottolineare che questa tecnica funziona con i tumori crioconservati, offrendo una risorsa preziosa per la ricerca sul glioma.

Un protocollo per l'espiantazione di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1

Impara un protocollo per la coltura cellulare post-mortem rapida di DIPG per studiare la biologia tumorale e testare strategie terapeutiche. Questo metodo consente di generare colture derivate dal paziente per ricerche oncologiche pediatriche.

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

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