Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)
March 7th, 2017
Questo protocollo descrive un metodo per la rapida trasformazione del post mortem diffuse campioni di glioma pontino intrinseca per la definizione di modelli di coltura cellulare derivati da pazienti o la caratterizzazione diretta delle cellule tumorali e microambiente.
L'obiettivo generale di questo protocollo di coltura cellulare post-mortem rapido è quello di generare colture cellulari durevoli derivate da pazienti di glioma pontino intrinseco diffuso per facilitare gli esperimenti necessari per comprendere e, in ultima analisi, sviluppare terapie efficaci per il DIPG. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla biologia fondamentale e sulle strategie terapeutiche per il glioma pontino intrinseco diffuso, ad esempio se alcuni farmaci funzionano in diverse colture derivate da pazienti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette lo studio diretto della biologia delle cellule derivate dai pazienti.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per la DIPG, perché consente di testare diverse strategie terapeutiche in diversi sottotipi genetici della malattia. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul DIPG, può essere applicato anche ad altre malattie, come altri gliomi pediatrici di alto grado, glioblastomi adulti o altri tumori del sistema nervoso centrale. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà, perché è difficile procurarsi ed elaborare rapidamente i campioni dell'autopsia in modo efficiente.
Prima della preparazione del campione, sterilizzare la cappa di coltura tissutale, insieme alle lame di rasoio, agli emostatici curvi e ad altri strumenti non sterili sotto la luce UV per un'ora ed eseguire tutti i passaggi seguenti in condizioni sterili. Quindi, trasferire il tessuto in una piastra di coltura cellulare a parete alta di 100 millimetri per 20 millimetri. Rimuovere il terreno rimasto dalla spedizione e sostituirlo con 10-15 millilitri di terreno di coltura a freddo.
Quindi, usando gli emostatici curvi per afferrare una lama di rasoio, tritare finemente il tessuto rimuovendo i vasi sanguigni o le meningi. I frammenti di tessuto finali dovrebbero essere più piccoli di un millimetro. Successivamente, trasferisci il fazzoletto in un tubo conico pulito da 50 millilitri.
Lavare la piastra di coltura cellulare con altri cinque millilitri di terreno di coltura freddo e trasferire il campione nella provetta conica. Ripetere questa fase di lavaggio se necessario per trasferire il fazzoletto rimanente. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, triturare delicatamente il campione per quattro o cinque volte.
Lasciare che i frammenti di tessuto più grandi si depositino sul fondo del tubo. Se necessario, centrifugare brevemente il campione per un minuto. Per raccogliere la frazione dissociata, rimuovere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro da 100 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri etichettato come Dissociazione Meccanica.
Capovolgere il filtro sulla provetta conica originale e lavarla con terreni di coltura per recuperare i frammenti di tessuto. Successivamente, centrifugare la frazione di dissociazione meccanica per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il surnatante dalla frazione di dissociazione meccanica pellettata e risospendere il tessuto in terreni di coltura freddi.
Se ci sono più di cinque millilitri di tessuto nel tubo conico di dissociazione meccanica, dividere il tessuto in altri tubi conici da 50 millilitri in modo tale che nessun tubo abbia più di cinque millilitri di tessuto. Quindi, conservare la frazione dissociata meccanicamente su ghiaccio fino alla fase di centrifugazione in gradiente di saccarosio. In questa procedura, centrifugare la provetta conica contenente i frammenti di tessuto rimanenti per cinque minuti.
Successivamente, rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione di digestione enzimatica preriscaldata, in modo tale che ci siano cinque millilitri di soluzione di digestione per ogni millilitro di tessuto. Quindi, sigillare il coperchio della provetta conica con pellicola da laboratorio e incubare la reazione su un rotatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, triturare delicatamente i campioni.
Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, pipettare il campione su e giù per sei-otto volte ed evitare di generare bolle d'aria eccessive. Quindi, aggiungere un puntale per pipetta da 1.000 microlitri all'estremità della pipetta e triturare il campione per altre sei-otto volte. Lasciare che i pezzi rimanenti si depositino sul fondo del tubo.
Quindi, rimuovere e filtrare il surnatante con le cellule ancora sospese attraverso un filtro da 100 micron in una nuova provetta conica da 50 millilitri etichettata come dissociazione enzimatica e conservarla sul ghiaccio. Successivamente, centrifugare la provetta di dissociazione enzimatica per cinque minuti e continuare con la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Se il campione è ancora sospeso in soluzione, centrifugarlo per cinque minuti.
Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere il tessuto in 20 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio. Quindi, portare il volume fino a 25 millilitri con HBSS freddo. Aggiungere lentamente 25 millilitri di soluzione di saccarosio 1,8 molare e capovolgere il tubo per mescolare.
Ciò si traduce in un gradiente di saccarosio molare di 0,9 molari. Successivamente, centrifugare il campione senza interruzioni per 10 minuti. Aspirare con cura i detriti di mielina in quanta più soluzione possibile di saccarosio e saccarosio.
Quindi, lavare il campione aggiungendo 30 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio e mescolando delicatamente. Dopodiché, centrifugare per cinque minuti. In questa procedura, rimuovere il surnatante di lavaggio.
Aggiungere cinque millilitri di tampone di lisi ACK e risospendere delicatamente il pellet cellulare, facendo roteare il tubo per un minuto a temperatura ambiente. Quindi, spegnere la lisi aggiungendo 30 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio. Successivamente, centrifugarlo per cinque minuti.
Risospendere il pellet cellulare finale in 10-15 millilitri di TSM completo caldo con fattori di crescita e quantificare la densità cellulare vitale su un emocitometro, utilizzando l'esclusione del blu di tripano. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare finale in un nuovo pallone di coltura T75. Aggiungere ulteriori fattori di crescita a giorni alterni per mantenere i livelli complessivi dei fattori di crescita e monitorare lo sviluppo delle neurosfere delle cellule tumorali.
Ecco vari esempi di come i campioni possono apparire dalle prime fasi della coltura a una coltura duratura. Inizialmente, le colture piastrate e precoci spesso non sembrano contenere molte cellule sopravvissute. Inoltre, i primi cluster cellulari spesso non mostrano il grado di contrasto tipicamente associato alle neurosfere.
Tuttavia, il passaggio iniziale di questi gruppi di cellule, combinato con il filtraggio inverso dei gruppi di cellule, può isolare cellule tumorali sane che sono in grado di formare sfere. Il filtrato contiene tipicamente detriti residui. Questi campioni derivati dal paziente possono quindi essere mantenuti in coltura per più passaggi.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che il campione sia mantenuto a temperatura fredda in ogni fase, ad eccezione della dissociazione enzimatica, e ridurre al minimo la manipolazione traumatica del campione. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori studi, come lo screening farmacologico in vitro o lo xenotrapianto ortotopico, per rispondere alle domande successive sulla patobiologia DIPG.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica di coltura ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuro oncologia pediatrica per esplorare nuove strade terapeutiche per i bambini con DIPG. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come eseguire rapidi protocolli di coltura cellulare post-mortem su campioni di tumore cerebrale. Non dimenticare che lavorare con i tessuti umani può essere pericoloso e che dovrebbero essere sempre utilizzate precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale e tecniche sterili.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per l'elaborazione rapida di campioni di glioma pontino intrinseco diffuso post-mortem per stabilire modelli di coltura cellulare derivati dal paziente. Questa tecnica facilita lo studio della biologia del tumore e delle strategie terapeutiche.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Oncologia
- Biologia Cellulare
Sfondo
- Il glioma pontino intrinseco diffuso (DIPG) è un tumore cerebrale pediatrico impegnativo.
- Comprendere la biologia del DIPG è cruciale per sviluppare terapie efficaci.
- Le colture cellulari derivate dal paziente possono fornire informazioni sul comportamento del tumore.
- Questo metodo può essere applicato anche ad altri gliomi di alto grado e tumori del SNC.
Obiettivo dello Studio
- Generare colture cellulari derivate dal paziente di DIPG durevoli.
- Facilitare esperimenti volti a comprendere la biologia del DIPG.
- Testare strategie terapeutiche attraverso diversi sottotipi genetici.
Metodi Utilizzati
- Elaborazione del campione post-mortem in condizioni sterili.
- Dissociation meccanica ed enzimatica dei campioni di tessuto.
- Centrifugazione in gradiente di saccarosio per la separazione cellulare.
- Mantenimento della coltura cellulare con fattori di crescita.
Principali Risultati
- Generazione riuscita di colture cellulari derivate dal paziente.
- Informazioni sulla biologia del DIPG e potenziali risposte terapeutiche.
- Applicabilità dimostrata ad altri tumori del SNC.
Conclusioni
- Questo protocollo consente lo studio diretto delle cellule DIPG derivate dal paziente.
- Fornisce una piattaforma per testare varie strategie terapeutiche.
- Le applicazioni future potrebbero estendersi ad altri tumori cerebrali pediatrici e adulti.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the critical need for physiologically relevant models in pediatric oncology by enabling rapid generation of patient-derived DIPG cultures from post-mortem tissue. It supports target validation and preclinical de-risking by providing a scalable system to evaluate therapeutic response across genetic subtypes. The method enhances translational continuity from discovery to lead identification by supplying durable cultures for mechanistic and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using patient-derived cells that retain tumor-specific biology.
- Operational Value: Provides a renewable source of DIPG cells for functional target validation and pathway analysis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing drug response comparison across genetically distinct cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dissociated cell suspensions suitable for FACS isolation and downstream molecular profiling.
- Operational Value: Standardizes sample preparation to produce consistent inputs for high-throughput screening platforms.
- Scalability: Enables production of sufficient cell numbers for multi-well assay formats and dose-response testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains tumor-derived neurosphere-forming capacity, preserving key pathobiological features for preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates orthotopic xenograft establishment for in vivo efficacy and pharmacokinetic studies.
- Translational Alignment: Bridges discovery findings to preclinical validation through continuous culture passaging.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supplying validated biological systems for lead identification and preclinical evaluation. It enables hypothesis-driven screening and supports go/no-go decisions through quantitative, reproducible outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing direct testing of drug effects on patient-derived DIPG cells.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions ready for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Enables quantification of viable cell density and neurosphere formation as phenotypic readouts for compound screening.
- Translational Research: Provides a continuous culture system that maintains tumor properties for longitudinal preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating CNS tumor models applicable to multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing reliance on non-predictive cell lines and enhancing biological relevance.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissociation, filtration, and centrifugation steps under sterile conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early elimination of ineffective compounds using patient-relevant models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating efficacy data across multiple DIPG genetic subtypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to post-mortem tissue and rapid processing infrastructure to maintain sample viability.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure culture consistency and comparability of results.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other CNS tumor types with differing tissue characteristics.
- Limited by the difficulty in procuring and rapidly processing autopsy samples, which affects throughput and accessibility.
