Name: Ricombinante da α-β e γ Synucleins stimolare attività di subunità catalitica della proteina fosfatasi 2A nelle analisi gratuita delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Scopri come misurare l'attività della subunità catalitica della fosfatasi 2A (PP2Ac) in risposta alle sinucleine α, β e γ mediante saggio colorimetrico. Questo metodo rivela la specificità dell'α-sinucleina verso PP2Ac nel cervello di topo.

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Gli autori apprezzano gli sforzi dai membri di laboratorio previa Kendra Mackett, Sandra Slusher e Jie Chen che ha lavorato per ottimizzare il metodo. Gli autori ringraziano anche il National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso da studioso attività ricerca progetto (SARP), Lizanell e Colbert Coldwell Foundation, più sistema atrofia coalizione, Ricerca della famiglia Hoy e Anna Mae Doyle regalo fondi per il sostegno finanziario di questa ricerca.

1. preparazione dei tamponi e reagenti
<ol><li>
Preparazione del tampone di p-nitrofenil fosfato (pNPP)
	<ol>
<li>Preparare 50 mL di tampone pNPP come segue.</li>
		<li>Pesare base Tris 0,30285 g (Vedi la Tabella materiali) e dissolverlo in 25 mL di acqua deionizzata ultrapura.<ol>
<li>41,6 µ l di 120 mM CaCl2. Regolare il pH 7.0 con 1M HCl e portare il volume di soluzione finale a 50 mL con acqua deionizzata ultrapura.</li>
			<li>Garantire che la concentrazione finale è di 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7.0.</li>
			<li>Memorizzi il buffer pNPP a 4 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per le soluzioni di verde malachite, preparare il seguente.
	<ol>
<li>Preparare soluzione A aggiungendo 32,8 mL di HCl concentrato a 67,2 mL di acqua deionizzata ultrapura per creare una soluzione di HCl 4 M. Nota: Malachite soluzione viene preparata in una cappa utilizzando guanti monouso, mascherina e occhiali protettivi.</li>
		<li>Preparare soluzione B peso 4,2 g di molibdato di ammonio e aggiungendolo a 95,8 mL di soluzione A.</li>
		<li>Preparare soluzione C peso fuori 0,045 g malachite verde ossalato di sale e aggiungendo acqua deionizzata ultrapura per portare il volume totale finale a 100 mL.</li>
		<li>Preparare soluzione D mescolando soluzioni B e C al rapporto di 1:3 (v/v), mescolare per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Filtrare la Soluzione D attraverso una 0,22 µm poro dimensione nitrocellulosa membrana filtro unità utilizzando una siringa da 50 mL.</li>
		<li>Conservare la soluzione di malachite preparati alle 4 oC al riparo dalla luce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione dell'attivatore
	<ol>
<li>Per preparare un 1% soluzione di tween 20, dispensare 10 µ l di tween 20 in 990 µ l di ultrapura deionizzata (v/v) e poi vortice fino il tween 20 si dissolve completamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della soluzione di lavoro di verde malachite Tween 20 (MGT).
	<ol>
<li>Mescoli l'attivatore (punto 1.3) con la soluzione di verde malachite (soluzione D, punto 1.2.5) in un rapporto di 1: 100 (ad es. 1 attivatore di µ l a 99 µ l di soluzione di verde malachite).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di treonina fosfopeptide (KRpTIRR) (pT) substrato.
	<ol>
<li>Per preparare un posto stock, 2mm un flaconcino di phosphopeptide 1mg sul ghiaccio, aggiungere 550 µ l di acqua deionizzata ultrapura e agitare delicatamente per sciogliere.<ol>
<li>Fare ~ 10 aliquote e memorizzare pT a-20oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di sinucleina
	<ol>
<li>Preparare il synucleins in una cappa utilizzando guanti monouso, mascherina e occhiali protettivi.</li>
		<li>Risospendere 1 mg di synuclein ricombinante in 1 mL di acqua deionizzata ultrapura per una concentrazione finale di 1 mg/mL.</li>
		<li>Vortice delicatamente per sciogliere e metterli su ghiaccio.</li>
		<li>Aliquote di 50 µ l di preparare e conservare a-80 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di fosfati
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di riserva di fosfato 0,1 mM come segue.<ol>
<li>Pesare 0,1361 g KH2PO4 e posto in un becher con 80 mL di acqua deionizzata ultrapura. Aggiungere una barra per l'agitazione e mescolare per sciogliere. Trasferire tutta la soluzione a un cilindro graduato e portare il volume totale finale a 100 mL con acqua deionizzata ultrapura.</li>
			<li>Filtrare la soluzione intera attraverso una 0,22 µm poro nitrocellulosa membrana filtro unità di formato usando una siringa da 50 mL; la concentrazione finale è di 10 mM.</li>
			<li>Diluire la soluzione (10 mM) 1: 100; la concentrazione finale sarà 0,1 millimetri di fosfato (PO4) da utilizzare per gli standard di analisi.</li>
			<li>Conservare la soluzione di riserva di fosfato alle 4 oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vedere tabella 1 per la limitazione diluizioni usati per fare PO4 standard con un volume totale finale di 1250 µ l in ogni. Aggiungere la quantità appropriata di fosfato e acqua deionizzata ultrapura per provette da 1,5 mL secondo la tabella 1.<ol>
<li>Archivio preparato PO4 norme a-20 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">Fosfati</td>
		</tr>
<tr>
<td>soluzione di 0,1 mM PO4 (mL)</td>
			<td>0</td>
			<td>75</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1.200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua deionizzata ultrapura (mL)</td>
			<td>1.250</td>
			<td>1.175</td>
			<td>1.100</td>
			<td>950</td>
			<td>650</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentrazione finale di PO4 [pmol]</td>
			<td>0</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1.200</td>
			<td>2.400</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Fosfato standard.
2. PP2A Assay in risposta a Synucleins ricombinante
Nota: Il volume totale finale per ciascuna reazione sarà 60 µ l, così lo sperimentatore deve regolare il volume iniziale del buffer pNPP in modo appropriato per accogliere il volume di synucleins utilizzato per ciascun campione. Nella maggior parte dei casi, il volume di tampone pNPP sarà tra 40 e 44 µ l.
<ol><li>
Preparare ogni reazione PP2Ac come segue.
	<ol>
<li>In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 39 µ l di tampone pNPP e posto sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l (105 ng / µ l o 0.0007 U / µ l) di PP2Ac ricombinante umano (rPP2Ac).</li>
		<li>Aggiungere 4 µ l di 0, 1.5, 7.5, 15 o 30 µM synucleins a rPP2Ac nel buffer pNPP per concentrazioni finali di 0, 0.1, 0.5, 1.0 e 2.0 µM e incubare a 4 ° C per 30 min in un'unità rotante; il volume finale sarà 60 µ l.</li>
		<li>Dopo 30 min, spostare i campioni di ghiaccio e aggiungere 16 µ l di substrato pT 2 mM.</li>
		<li>Incubare ogni miscela di analisi di PP2A per 10 min a 30 ° C a bagnomaria con agitazione intermittente.</li>
		<li>Una piastra a 96 pozzetti fondo piatto, aggiungere 25 µ l di ciascun PO4 standard (0, 150, 300, 600, 1.200 e 2.400 pmol) in pozzetti duplicati dal più basso al più alto.</li>
		<li>Successivamente aggiungere 25 µ l di ogni campione sperimentale (PP2A dosaggio ± synuclein), preparato in passaggi 2.1.1 a 2.1.6, duplicare pozzi sulla stessa piastra 96 pozzetti.</li>
		<li>Successivamente, aggiungere 75 µ l di soluzione di lavoro di MGT a ciascuno contenente ben standard e campioni.</li>
		<li>Lasciare la piastra a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Osservare un colore cambia in campioni avendo differenze misurabili nei livelli di fosfato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analisi fotometrica
<ol><li>Analizzare la piastra a 96 pozzetti contenenti i campioni utilizzando un lettore spettrofotometrico con la lunghezza d'onda impostata a 630 nm29e standards.</li>
	<li>Tracciare la curva di assorbanza prodotta (campioni leggere a 630 nm) e si noti che rimane lineare fino a 2.400 pmol concentrazione di PO4.</li>
</ol>

<ol><li>Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+alpha-%2C+beta-+and+gamma-synucleins+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS.</a> Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).</li>
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<li>Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwingle%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).</li>
</ol>

Dr. Perez era un membro della facoltà nel dipartimento di neurologia presso l'Università di Pittsburgh School of Medicine dal 1999 – 2011.

Questa analisi di verde malachite con pT è stata usata per misurare l'attività di PP2Ac perché è più facile da eseguire rispetto al metodo classico che utilizza 32P-etichettati substrati. Un altro vantaggio di questo test su saggi radioattivi è che radioisotopi comportano qualche rischio e possono essere costosi, soprattutto 32P-etichettati molecole che hanno emivita breve, che limita il numero di test si può eseguire prima che scadano i reagenti. Utilizzando verde malachite anziché radioattività Elimina anche la necessità di disporre di 32P rifiuti. Saggi di verde malachite sono anche molto sensibili quando si misura l'attività della fosfatasi della serina/treonina rispetto ad un altro saggio colorimetrico che utilizza il substrato p-nitrophenylphosphate (pNPP), che è non-selettivi, come può essere defosforilata da un vasto numero di enzimi32.
Verde malachite commerciale kit per misurare l'attività di PP2A sono stati disponibili per un certo tempo e in precedenza erano utilizzate in laboratorio. Tuttavia, quando si fa molti saggi di verde malachite, tale kit è diventato proibitivo. Inoltre, kit commerciali per attività di PP2A è stabile solo per un anno, mentre avendo reagenti disponibili in polvere forma e con una corretta conservazione, forniscono componenti di analisi prontamente disponibili che sono strutturalmente stabili per lunghi periodi di tempo.
Prima del test bSyn e gSyn, aSyn è stato utilizzato come controllo positivo per stimolare l'attività PP2Ac e per determinare la quantità di PP2Ac necessaria per le analisi e anche per confermare che i dati risultanti rimangono sulla scala con la curva standard (150-2400 pmol di PO4 ). È interessante nota che se aSyn stimola PP2Ac troppo fortemente, anche se la reazione è in genere lineare, dati andrà fuori scala e prodotti chimici nella soluzione MGT precipitano, rendendo impossibile per misurare gli importi precisi di rilasciato gratis-PO4 con una piastra lettore.
Dato che contribuisce aSyn PP2Ac attività in vivo e in vitro12,19,21,23,25, e che tutte le synucleins hanno una notevole omologia, era stato supposto che tutti i membri della famiglia synuclein possono essere in grado di stimolare PP2Ac nelle analisi gratuita delle cellule. Utilizzando il saggio colorimetrico descritto qui, è stato trovato che, infatti, tutti i tre synucleins ricombinante (aSyn, bSyn, gSyn) ha stimolato attività PP2Ac, sollevando la possibilità che tutti i tre synucleins possono svolgere funzioni simili nel sistema nervoso. Tuttavia, del cervello dal morbo di Parkinson o demenza con corpi di Lewy casi hanno meno attività PP2Ac in tessuti che contengono altamente aggregate aSyn23. Tessuti di topo che harboring Lewy corpo-come patologia presentano anche ridotto PP2Ac attività25. Questo, e nuovi dati nella Figura 3 nonché dati precedente da aSyn KO topi12, suggeriscono fortemente che né bSyn né gSyn in genere può compensare la perdita di aSyn solubile nel cervello, o in alternativa che quelli omologhi synuclein potrebbero non associare a PP2Ac fortemente quanto aSyn come mostrato (Figura 3). L'Atlante del cervello di Allen Mostra colocalizzazione di tutti tre synuclein mRNAs in molte aree del cervello, e però topi knockout synuclein triple sono stati generati9,33, PP2Ac attività non è stata valutata in quel modello. Interessante, aSyn che è fosforilata su Ser129 di Polo-like chinasi 2, è meno in grado di attivare PP2Ac12, ma prova qui indicata per bSyn suggeriscono che la fosforilazione bSyn è improbabile che impatto attività PP2Ac, come bSyn molto poco è venuto giù con PP2Ac nel cervello del topo (Figura 3). Presi insieme, i dati suggeriscono che i modulatori endogeni di attività PP2Ac, come aSyn, probabile contribuiscano al benessere e alla malattia.
Il protocollo descritto qui è una semplice ma potente tecnica per determinare la capacità di PP2Ac a dephosphorylate un substrato phosphopeptide in risposta ai vari trattamenti. Per esempio, questa stessa metodologia può essere utilizzata per testare altri attivatori PP2Ac, come i ceramidi, nonché potenziali approcci terapeutici34, o per valutare l'impatto di PP2Ac inibitori in vitro. È anche importante sottolineare che simili analisi possono misurare l'attività di PP2Ac che è stato isolato dai 1 6 immunoprecipitazione da estratti di cellule o tessuti del corpo, come precedentemente descritti da autori12,19, 25. esistono applicazioni di futuro per il dosaggio di verde malachite oltre misura PP2Ac attività, come attività di ATP può anche essere determinata usando un'analisi di tali.
Si noti che una curva standard deve essere generata ogni volta per ogni dosaggio PP2Ac indipendente. È obbligatorio per assicurare che tutti i reagenti utilizzati sono fosfati, come fosfati gratis artificialmente aumentano il segnale di fondo e producono risultati errati. Il giorno del test è essenziale per preparare la soluzione MGT abbastanza fresco per tutti i campioni da saggiare. Inoltre, MGT è buono solo il giorno in cui è fatto e tende a precipitare dopo poche ore. PP2Ac acquistato da un fornitore deve essere aliquotato e conservati congelati subito dopo viene ricevuto per evitare cicli di scongelamento freeze che riducono la sua attività. Come altri fosfatasi possono dephosphorylate pT substrato (ad es. PP1 e PP535), quando si analizzano gli estratti delle cellule o del tessuto in cui PP2Ac non è stato isolato mediante immunoprecipitazione, campioni devono essere passati sopra le colonne per rimuovere i fosfati gratis e specifici inibitori delle fosfatasi devono essere utilizzati per confermare la specificità della fosfatasi, come descritto in precedenza18.

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Erratum: Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

Studi che definiscono la distribuzione di synucleins nel cervello e nel midollo spinale Mostra che tutti i tre synucleins sono arricchiti in tessuti neurali, anche se diversi modelli di localizzazione sono stati segnalati1. Per esempio, aSyn è più abbondante a siti presinaptici nella corteccia cerebrale e nei gangli basali2,3, bSyn ha una distribuzione più uniforme nel cervello e nel midollo spinale4,5e gSyn è più abbondante nel midollo spinale e gangli periferici6. Anche se può verificarsi qualche espressione embrionale di tutti i synucleins, i tre omologhi diventano più abbondanti durante il periodo neonatale4,5,6,7,8. Notevolmente, dati da topi synuclein triple, indicano che la perdita di tutti i tre synucleins causa età insorgenza disfunzione neuronale9, sostegno synuclein importanti funzioni nel sistema nervoso centrale (SNC)10, 11. non è ancora noto se synuclein triple topi mostrano cambiamenti nella distribuzione di PP2Ac o attività. I dati da topi knockout singolo synuclein rivelano che la perdita di aSyn da solo è in grado di ridurre significativamente l'attività PP2Ac in cervello12. Oltre al sistema nervoso centrale, tutti i synucleins si localizzano altri tessuti in tutto il corpo13,14,15.
A causa della sua consolidata collegamenti genetici a neurodegenerazione16,17, aSyn è tra i migliori studiato dei tre synucleins. Il laboratorio di Perez ha lavorato a lungo per definire normale attivita ' funzionale di aSyn, soprattutto a CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 e più recentemente in tessuti periferici24,25. Tra questi, è stata la scoperta che aSyn svolge un ruolo regolatore chiave in stimolante PP2Ac attività19. Attività di PP2A contribuisce ampiamente alla funzione normale del cervello, tra cui per la regolazione della produzione di dopamina26. Holoenzyme PP2A è costituito da tre subunità indipendente, la subunità catalitica di C, PP2Ac, una subunità di ponteggi A e uno di parecchie diverse normative/targeting B unità secondarie che aiutano a localizzare PP2A a specifici subcellulari, fornendo così PP2A la diversità funzionale27. La prova indica che aSyn interazioni con PP2Ac contribuiscono significativamente alla sua fosfatasi attività in vitro e in vivo12,19,21,23, 25. Quando aSyn si accumula in aggregati proteici, come avviene quando i corpi di Lewy in forma all'interno di neuroni di morbo di Parkinson e demenza con corpi di Lewy (DLB), tessuti con aggregati aSyn sonodiminuite PP2Ac attività23,25, quando i livelli di aSyn solubile diminuiscono. Dato che tutti i tre synucleins hanno omologia significativo28 (aSyn condivide identità di 66% con bSyn e 56% con gSyn) e quello aSyn contribuisce all'attivazione del PP2Ac, è stato supposto che tutti i membri della famiglia di proteine synuclein possono essere in grado di aumentare l'attività di PP2Ac, almeno in vitro. Per valutare questo, attività di PP2Ac è stata misurata in risposta a aSyn recombinante, bSyn e gSyn utilizzando un semplice saggio colorimetrico, modellato dopo il metodo di Finizio et al. 29. questo metodo e i risultati novelli sono dettagliati nel presente documento.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T15003</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (cloruro di calcio)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp concentrato; &nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>9535-33</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td></td></tr><tr><td>Sale di ossalato verde di malachite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6880</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Treonina fosfopeptide (KRpTIRR)</td><td>New England peptide LLC</td><td>BP12-011</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 ( fosfato di potassio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>subunità umana ricombinante PP2A C</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td></td><td></td>10011237</tr><tr><td>&alfa;-sinucleina umana ricombinante</td><td>rPeptide</td><td>S-1001-2</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-sinucleina umana ricombinante</td><td>rPeptide</td><td>S-1003-2</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-sinucleina umana ricombinante</td><td>rPeptide</td><td>S-1007-2</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac 1D6 anticorpo</td><td>Millipore</td><td>05-421</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac anticorpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-92217</td><td></td></tr><tr><td>aSyn anticorpo C-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>bSyn anticorpo EP1537Y</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-79903</td><td></td></tr><tr><td>gSyn anticorpo E-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10698</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalining Columns, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment/Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiskan Spectrum Plate Reader</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>51118650</tr><tr><td>pHmetro&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-636-AB15P</td><td></td></tr></tbody></table>

ricombinante da α-β e γ synucleins stimolare attività di subunità catalitica della proteina fosfatasi 2a nelle analisi gratuita delle cellule

Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) e γ-Synuclein (gSyn) sono membri di una famiglia conservata di proteine chaperone-like che sono altamente espressi in tessuti di un neurone dei vertebrati. Di tre synucleins, solo aSyn è stato fortemente implicato nei disordini neurodegenerative quali il morbo di Parkinson, demenza con corpi di Lewy e atrofia del sistema multiplo. Nello studio aSyn normale funzione, i dati indicano che aSyn stimola l'attività della subunità catalitica di un enzima dephosphorylating abbondantemente espressa, PP2Ac in vitro ed in vivo. Dati precedenti indicano che aSyn aggregazione nel cervello umano riduce PP2Ac attività nelle regioni con patologia del corpo di Lewy, dove aSyn solubile è diventato insolubili. Tuttavia, poiché tutte le tre synucleins hanno una notevole omologia nelle sequenze dell'amminoacido, esperimenti sono stati progettati per verificare se tutti possono modulare l'attività di PP2Ac. Utilizzando synucleins ricombinante e proteina PP2Ac ricombinante, l'attività è stata valutata dall'analisi colorimetrica di verde malachite. I dati hanno rivelato che tutti i tre synucleins ricombinante ha stimolato attività PP2Ac nelle analisi senza cellula, sollevando la possibilità che l'omologia conservata tra synucleins può dotare tutti i tre omologhi con la capacità di legare a ed attivare il PP2Ac. Dati di co-immunoprecipitazione, tuttavia, suggeriscono che PP2Ac modulazione probabile si verifica attraverso endogene interazioni tra aSyn e PP2Ac in vivo.

Attività e funzione della proteina può essere modificati da modificazioni post traduzionale, come la fosforilazione. Molte proteine possono essere fosforilate da una chinasi o defosforilate da una fosfatasi. Nel caso di proteina fosfatasi 2A (PP2A), questa fosfatasi del multisubunit facilita la defosforilazione di residui di serina e treonina su un ampio numero di fosfoproteine. Attività di PP2A anormale può portare a disregolazione della funzione proteica che si verifica in molte malattie, compreso il morbo di Parkinson dove aSyn può diventare hyperphosphorylated, e nel morbo di Alzheimer dove la proteina tau può diventare hyperphosphorylated. Ciò ha fornito giustificazione per l'ottimizzazione di una procedura interna per rapidamente valutare PP2Ac attività e determinare se l'attività anormale di PP2Ac può portare a disfunzione cellulare.
Usando questa analisi senza cellula colorimetrica, PP2Ac attività è stata misurata quantificando la quantità di libero PO4 spaccati dal substrato pT (Figura 1A) e rispetto alla quantità note picomolar di PO4 nella curva standard (Figura 1B ). PP2Ac attività inoltre è stata misurata in risposta a 0.0, 0,1, 0,5, 1,0 e 2,0 µM synucleins (Figura 1A), rispetto alle attività di PP2Ac di base in assenza di aggiunto synuclein (presso la grande freccia nella Figura 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig1.jpg"> Figura 1 : L'attivazione di PP2A di synucleins ricombinante, è misurata rispetto ai livelli del noti del fosfato nelle norme. Nel()aSyn, bSyn e gSyn sono stati valutati in un range da 0 - 2 µM concentrazioni nella proteina, da confrontare con 0 - 2400 pmol PO4 standard. (B) una curva standard per il dosaggio di PP2Ac verde malachite è stato generato per fornire quantità note di fosfato contro il quale possono essere calcolati i valori ottenuti in condizioni sperimentali. In tutti i casi, quando l'attività PP2Ac aumenta, la quantità di libero PO4 spaccati dal substrato pT aumenta e produce un colore verde più scuro. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I risultati mostrano che aggiunta di synucleins a PP2Ac nella fase iniziale di incubazione potrebbe aumentare la quantità di libero PO4 misurata, dimostrando in tal modo l'attività aumentata di PP2Ac. L'analisi statistica dopo molte ripetizioni mostrano che tutte le tre synucleins ricombinante (aSyn, bSyn, gSyn) aumentare significativamente PP2Ac attività (Figura 2). Questi risultati indicano che i cambiamenti nella quantità di synucleins cellulare solubile possono alterare PP2Ac attività; e così possono influenzare l'omeostasi cellulare. Non è noto, tuttavia, se tutte le tre synucleins contribuiscono all'attivazione di PP2Ac in vivo, anche se i dati nella Figura 3 suggeriscono che aSyn probabilmente contribuisce alla PP2Ac attività in vivo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig2.jpg"> Figura 2 : PP2Ac attività è stimolata da tutti i tre synucleins. Rappresentazione grafica di PP2Ac attivazione in risposta a diverse concentrazioni di aSyn recombinante, bSyn o gSyn è indicato. Tutti i tre synucleins ricombinante ha stimolato attività PP2Ac. aSyn nella maggior parte degli esperimenti sono sembrato essere leggermente più potente, anche se eseguita utilizzando il software statistico di ANOVAs erano notevolmente simili nel complesso. I dati rappresentano la media ± SEM di esperimenti indipendenti 4-9. ns, non significativo; p < 0,05; p < 0.01; p < 0,0001. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per valutare quale synuclein(s) può interagire con PP2Ac nel cervello, co-immunoprecipitazione (Co-IP) sono stati eseguiti utilizzando cervello di topo di tipo selvaggio e la PP2Ac--anticorpo specifico, 6 1. Le proteine sono state poi separate da SDS-PAGE e macchie sono state sondate per PP2Ac, aSyn, bSyn e gSyn utilizzando metodi consolidati19. Synuclein recombinante controlli mostrano specificità dell'anticorpo aSyn, bSyn e gSyn (Figura 3A). Co-IP dati rivelano che i principale sinucleina associata PP2Ac nel cervello era aSyn, come molto meno bSyn scese nel co-pi (Figura 3B), e nessun gSyn è nel Co-pi (dati non mostrati). Ciò suggerisce un ruolo distintivo per aSyn endogeno nella regolazione della PP2Ac nel cervello. Inoltre solleva la possibilità che la modulazione PP2Ac con bSyn-base-terapie potrebbe avere potenziale per ripristinare l'attività di PP2A in quelli con synucleinopathy, come bSyn è conosciuto per essere nonamyloidogenic ancora come mostrato qui può stimolare PP2Ac30, 31.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2.jpg"> Figura 3: Interazione di PP2Ac con synucleins endogena nel cervello di topo. ASyn recombinante (A), bSyn e gSyn sono stati sondati con anticorpi specifici synuclein come descritto di seguito. (B) utilizzo del mouse omogeneato del cervello Co-IP è stato effettuato con l'anticorpo 1 6, quindi i campioni sono stati analizzati sui immunoblots. Dati sono mostrati per PP2Ac, aSyn e bSyn, ma non per gSyn che ha fatto non Co-IP con PP2Ac. Inizio campioni mostrano livelli relativi di PP2Ac aSyn (lane 1), (vicolo 4) e bSyn (corsia 7) in omogenati di iniziale. Fine campioni mostrano i livelli restanti di PP2Ac aSyn (lane 2), (vicolo 5) e bSyn (corsia 8) in omogeneati dopo il 6 1 PP2Ac Co-IP. Livelli significativi di PP2Ac sono stati immunoprecipitati utilizzando 6 1 anticorpo (corsia 3), che hanno portato giù ampie quantità di aSyn (vicolo 6, accanto alla freccia) ma molto poco bSyn (corsia 9, fortemente sovraesposta per mostrare il segnale debole bSyn, all'altezza della freccia). * Asterischi e staffe marchio non-specifici segnali sulle macchie. Vedi la Tabella materiali per dettagli sugli anticorpi utilizzati. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questa pubblicazione presenta un protocollo che Mostra come misurare l'attività della subunità catalitica di recombinant della proteina fosfatasi 2A (PP2Ac) in risposta a ricombinante α-synuclein, β-synuclein o γ-synuclein proteine usando un semplice saggio colorimetrico. Mostriamo le conclusioni relative alla specificità di α-synuclein verso PP2Ac nel cervello del topo.

Ricombinante da α-β e γ Synucleins stimolare attività di subunità catalitica della proteina fosfatasi 2A nelle analisi gratuita delle cellule

&#945;-Synuclein (aSyn), &#946;-Synuclein (bSyn), and &#947;-Synuclein (gSyn) are members of a conserved family of chaperone-like proteins that are highly ...

Le sinucleine ricombinanti alfa, beta e gamma stimolano l'attività della subunità catalitica della proteina fosfatasi 2A in saggi privi di cellule. Salve, mi chiamo Sovanarak Lek. Sono uno studente di medicina presso il Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.In questo video, illustrerò un saggio colorimetrico bifasico della fosfatasi proteica utilizzando proteine sinucleine ricombinanti. Preparazione di tamponi e reagenti. Preparazione del tampone fosfato di p-Nitrofenolo.Per preparare 50 mils di tampone pNPP, sciogliere la base Trizma in 25 mils di acqua deionizzata ultrapura in un becher. Aggiungere una barretta magnetica pulita e posizionare sullo agitatore magnetico. Una volta che la Trizma si è sciolta, aggiungere cloruro di calcio continuando a mescolare.Regolare il pH a 7,0. Trasferire la soluzione in un cilindro graduato. Portare il volume totale finale a 50 mils con acqua deionizzata ultrapura.Preparazione della soluzione di verde malachite. La soluzione di verde malachite richiede tre soluzioni, parti A, B e C. La soluzione A è acido cloridrico 4 M. La soluzione B è una combinazione di molibdato di ammonio più soluzione A. La soluzione C è il sale di ossalato di verde malachite allo 0,045%.Per preparare la soluzione D, mescolare una parte di B con tre parti di C, in un rapporto uno a tre. Agitare per un'ora a temperatura ambiente. Infine, filtrare la soluzione D attraverso una membrana da 22 micrums e conservare a quattro gradi Celsius.Proteggere dalla luce. Preparazione dell'attivatore. L'attivatore è una soluzione all'uno percento di Tween 20.Pipettare 10 microlitri di Tween 20 in 990 microlitri di acqua deionizzata ultrapura. Vortexare fino a quando il Tween 20 si sarà completamente disciolto. Preparazione della soluzione di lavoro di verde malachite più Tween 20.Aggiungere l'attivatore alla soluzione D in un rapporto di uno a cento. Preparazione del fosfopeptide della treonina. Per preparare una soluzione madre di pT a due mM, aggiungere 550 microlitri di acqua deionizzata ultrapura a un milligrammo di pT.Vortexare fino a quando il fosfopetide è completamente disciolto. Mettere sul ghiaccio per utilizzarlo immediatamente. Conservare le aliquote di pT in eccesso a meno 20 gradi Celsius.Preparazione della sinucleina. Risospendere un milligrammo di sinucleina in un millilitro di acqua deionizzata ultrapura a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro. Vortexare delicatamente per sciogliere.Usare immediatamente e conservare le aliquote non utilizzate a meno 80 gradi Celsius. Preparazione di standard di fosfato. Passaggio uno della preparazione degli standard di fosfato.Per preparare una soluzione madre di fosfato 1 mM, sciogliere il fosfato di potassio in acqua deionizzata ultrapura in un becher con una barretta magnetica. Trasferire in un cilindro graduato e portare il volume finale a 100 mils. Questa è una soluzione 10 mM.Filtrare l'intera soluzione attraverso un filtro da 22 micrometri utilizzando una siringa grande. Diluire da 1 a 100 per ottenere una soluzione di fosfato 1 mM da utilizzare come standard per il saggio. Secondo passaggio per gli standard di fosfato.Aggiungere la quantità appropriata di fosfato più acqua deionizzata ultrapura in provette da 1,5 ml come indicato nella tabella. Questo produrrà provette contenenti 150, 300, 600, 1.200 e 2.400 pmol di fosfato. Conservare le aliquote a meno 20 gradi Celsius.Saggio dell'attività della PP2A. Preparare il saggio della PP2A in provette da 1,5 ml su ghiaccio. Aggiungere 43 microlitri di tampone pNPP.Aggiungere un microlitro di PP2Ac ricombinante umano. Aggiungere la sinucleina e incubare la PP2A insieme alla sinucleina per 30 minuti su un Nutator a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 16 microlitri di pT 2 mM.Incubare per 10 minuti a 30 gradi Celsius in bagnomaria. Su una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto, aggiungere 25 microlitri di ciascuno standard di fosfato in duplicato, dal più basso al più alto. Pipettare 24 microlitri di ciascun saggio PP2A in duplicato sulla stessa piastra a 96 pozzetti contenente gli standard.Aggiungere con la pipetta 75 microlitri di soluzione D contenente Tween 20 a ciascun campione e standard. Dopo l'aggiunta di MGT, si osserverà un cambiamento di colore nelle pozzette in presenza di fosfati liberi. Analisi fotometrica.Analizzare con uno spettrofotometro impostato a 630 nanometri. Risultati rappresentativi. Qui abbiamo un saggio rappresentativo della PP2A e il grafico che mostra la curva standard.A sinistra si trovano gli standard di fosfato. Maggiore è la quantità di fosfato contenuta nelle pozzette, più scura sarà la tonalità di verde. A destra sono mostrati i campioni di PP2A che sono stati incubati con sinucleine alfa, beta o gamma a diverse concentrazioni molari.Concentrazioni più elevate si sono dimostrate più efficaci nel stimolare l'attività della subunità catalitica della PP2A. Qui vediamo la rappresentazione grafica dell'attività della PP2A in risposta a diverse concentrazioni di alfa-sinucleina, beta-sinucleina e gamma-sinucleina. Alfa-sinucleina, beta-sinucleina e gamma-sinucleina sono risultate tutte stimolatrici significative dell'attività della PP2A alla concentrazione di uno a due micromolar.Solo l'alfa sinucleina e la beta sinucleina si sono rivelate stimolatrici significative dell'attività della PP2A a una concentrazione di 0,5 micromolare. La figura tre mostra l'interazione della PP2Ac con le sinucleine endogene nel cervello del topo. In A, le alfa, beta e gamma sinucleine ricombinanti sono mostrate come controlli positivi.In B, è stata eseguita una co-immunoprecipitazione utilizzando l'anticorpo specifico per PP2Ac 1D6, che ha immunoprecipitato PP2Ac e ha co-immunoprecipitato una notevole quantità di alfa-sinucleina interagente, ma quasi nessuna beta-sinucleina. Nessuna gamma-sinucleina è stata co-immunoprecipitata con PP2Ac. Questi dati di co-immunoprecipitazione suggeriscono che l'alfa-sinucleina è il modulatore endogeno di PP2Ac in vivo.Vogliamo ringraziare tutti coloro che ci hanno aiutato nella realizzazione di questo video. In conclusione, questa è Ruth Perez. Sonavarak Lek.Javier Vargas. Le auguriamo un grande successo. Arrivederci e buona fortuna.

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Viene descritta un'ELISA che offre un approccio quantitativo innovativo. Rileva specificamente l'α-sinucleina associata alla malattia (αSD) in un modello di topo transgenico (M83) di sinucleinopatia utilizzando diversi anticorpi contro la forma αS fosforilata nella Ser129 o la parte C-terminale della proteina.

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di alfa-sinucleina (α-syn) sempre più insolubile/aggregata da tessuto cerebrale umano post-mortem. Attraverso l'utilizzo di tamponi con forza detergente crescente e tecniche di ultracentrifugazione ad alta velocità, è possibile esaminare le proprietà variabili dell'aggregazione α-syn in tessuti malati e non malati.

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un sistema basato su cellule che replica la formazione dell'alfa-synuclein aggrega in vivo. Le inclusioni intracellulari dell'alfa-synuclein sono seminate in neuroni primari di interiorizzazione e propagazione di esogeno somministrato del microsomi nativo con alfa-synuclein aggregati isolati da topi transgenici malato dell'alfa-synuclein.

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

Le mutazioni nel gene della leucina ricca di parentesi 2 (LRRK2) causano il morbo di Parkinson ereditario. Abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusto per valutare il fosfororylazione controllata da LRRK2 di Rab10 nei neutrofili del sangue periferici umani. Questo può aiutare a identificare gli individui con aumento dell'attività del percorso della chinasi LRRK2.

Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation

Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l'accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L'imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l'analisi imparziale dell'immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l'accumulo di sinucleina.

Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni

L'estratto traslazionale di Leishmania (LTE) è un sistema di espressione proteica eucariotico privo di cellule derivato dal parassita unicellulare Leishmania tarentolae. Questo protocollo ottimizzato rende l'LTE semplice ed economico da produrre. È adatto per varie applicazioni incentrate sull'espressione multiparallela e sullo studio di proteine eucariotiche complesse e delle loro interazioni.

Produzione e ottimizzazione di LTE, un sistema di espressione proteica libera derivato da Leishmania tarantolae per la produzione di proteine ricombinanti

Qui, descriviamo un sistema di lievito che ricostituisce la γ-secretasi umana. Questo sistema consente l'identificazione e lo studio delle mutazioni che influenzano l'attività e lo screening degli inibitori della γ-secretasi (GSI). Utilizzando le proprietà di perdita di funzione dei mutanti familiari della malattia di Alzheimer, è possibile eseguire lo screening per i modulatori della γ-secretasi (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modelli di malattia di Alzheimer per lo screening di geni, mutazioni e sostanze chimiche che influenzano la produzione di amiloide-beta da parte della γ-secretasi

Scopri come misurare l'attività della subunità catalitica della fosfatasi 2A (PP2Ac) in risposta alle sinucleine α, β e γ mediante saggio colorimetrico. Questo metodo rivela la specificità dell'α-sinucleina verso PP2Ac nel cervello di topo.

Ricombinante da α-β e γ Synucleins stimolare attività di subunità catalitica della proteina fosfatasi 2A nelle analisi gratuita delle cellule (Video) | JoVE Journal

Ricombinante da α-β e γ Synucleins stimolare attività di subunità catalitica della proteina fosfatasi 2A nelle analisi gratuita delle cellule

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