Ricombinante da α-β e γ Synucleins stimolare attività di subunità catalitica della proteina fosfatasi 2A nelle analisi gratuita delle cellule

Le sinucleine ricombinanti alfa, beta e gamma stimolano l'attività della subunità catalitica della proteina fosfatasi 2A in saggi privi di cellule. Salve, mi chiamo Sovanarak Lek. Sono uno studente di medicina presso il Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.

In questo video, illustrerò un saggio colorimetrico bifasico della fosfatasi proteica utilizzando proteine sinucleine ricombinanti. Preparazione di tamponi e reagenti. Preparazione del tampone fosfato di p-Nitrofenolo.

Per preparare 50 mils di tampone pNPP, sciogliere la base Trizma in 25 mils di acqua deionizzata ultrapura in un becher. Aggiungere una barretta magnetica pulita e posizionare sullo agitatore magnetico. Una volta che la Trizma si è sciolta, aggiungere cloruro di calcio continuando a mescolare.

Regolare il pH a 7,0. Trasferire la soluzione in un cilindro graduato. Portare il volume totale finale a 50 mils con acqua deionizzata ultrapura.

Preparazione della soluzione di verde malachite. La soluzione di verde malachite richiede tre soluzioni, parti A, B e C. La soluzione A è acido cloridrico 4 M. La soluzione B è una combinazione di molibdato di ammonio più soluzione A. La soluzione C è il sale di ossalato di verde malachite allo 0,045%.

Per preparare la soluzione D, mescolare una parte di B con tre parti di C, in un rapporto uno a tre. Agitare per un'ora a temperatura ambiente. Infine, filtrare la soluzione D attraverso una membrana da 22 micrums e conservare a quattro gradi Celsius.

Proteggere dalla luce. Preparazione dell'attivatore. L'attivatore è una soluzione all'uno percento di Tween 20.

Pipettare 10 microlitri di Tween 20 in 990 microlitri di acqua deionizzata ultrapura. Vortexare fino a quando il Tween 20 si sarà completamente disciolto. Preparazione della soluzione di lavoro di verde malachite più Tween 20.

Aggiungere l'attivatore alla soluzione D in un rapporto di uno a cento. Preparazione del fosfopeptide della treonina. Per preparare una soluzione madre di pT a due mM, aggiungere 550 microlitri di acqua deionizzata ultrapura a un milligrammo di pT.

Vortexare fino a quando il fosfopetide è completamente disciolto. Mettere sul ghiaccio per utilizzarlo immediatamente. Conservare le aliquote di pT in eccesso a meno 20 gradi Celsius.

Preparazione della sinucleina. Risospendere un milligrammo di sinucleina in un millilitro di acqua deionizzata ultrapura a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro. Vortexare delicatamente per sciogliere.

Usare immediatamente e conservare le aliquote non utilizzate a meno 80 gradi Celsius. Preparazione di standard di fosfato. Passaggio uno della preparazione degli standard di fosfato.

Per preparare una soluzione madre di fosfato 1 mM, sciogliere il fosfato di potassio in acqua deionizzata ultrapura in un becher con una barretta magnetica. Trasferire in un cilindro graduato e portare il volume finale a 100 mils. Questa è una soluzione 10 mM.

Filtrare l'intera soluzione attraverso un filtro da 22 micrometri utilizzando una siringa grande. Diluire da 1 a 100 per ottenere una soluzione di fosfato 1 mM da utilizzare come standard per il saggio. Secondo passaggio per gli standard di fosfato.

Aggiungere la quantità appropriata di fosfato più acqua deionizzata ultrapura in provette da 1,5 ml come indicato nella tabella. Questo produrrà provette contenenti 150, 300, 600, 1.200 e 2.400 pmol di fosfato. Conservare le aliquote a meno 20 gradi Celsius.

Saggio dell'attività della PP2A. Preparare il saggio della PP2A in provette da 1,5 ml su ghiaccio. Aggiungere 43 microlitri di tampone pNPP.

Aggiungere un microlitro di PP2Ac ricombinante umano. Aggiungere la sinucleina e incubare la PP2A insieme alla sinucleina per 30 minuti su un Nutator a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 16 microlitri di pT 2 mM.

Incubare per 10 minuti a 30 gradi Celsius in bagnomaria. Su una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto, aggiungere 25 microlitri di ciascuno standard di fosfato in duplicato, dal più basso al più alto. Pipettare 24 microlitri di ciascun saggio PP2A in duplicato sulla stessa piastra a 96 pozzetti contenente gli standard.

Aggiungere con la pipetta 75 microlitri di soluzione D contenente Tween 20 a ciascun campione e standard. Dopo l'aggiunta di MGT, si osserverà un cambiamento di colore nelle pozzette in presenza di fosfati liberi. Analisi fotometrica.

Analizzare con uno spettrofotometro impostato a 630 nanometri. Risultati rappresentativi. Qui abbiamo un saggio rappresentativo della PP2A e il grafico che mostra la curva standard.

A sinistra si trovano gli standard di fosfato. Maggiore è la quantità di fosfato contenuta nelle pozzette, più scura sarà la tonalità di verde. A destra sono mostrati i campioni di PP2A che sono stati incubati con sinucleine alfa, beta o gamma a diverse concentrazioni molari.

Concentrazioni più elevate si sono dimostrate più efficaci nel stimolare l'attività della subunità catalitica della PP2A. Qui vediamo la rappresentazione grafica dell'attività della PP2A in risposta a diverse concentrazioni di alfa-sinucleina, beta-sinucleina e gamma-sinucleina. Alfa-sinucleina, beta-sinucleina e gamma-sinucleina sono risultate tutte stimolatrici significative dell'attività della PP2A alla concentrazione di uno a due micromolar.

Solo l'alfa sinucleina e la beta sinucleina si sono rivelate stimolatrici significative dell'attività della PP2A a una concentrazione di 0,5 micromolare. La figura tre mostra l'interazione della PP2Ac con le sinucleine endogene nel cervello del topo. In A, le alfa, beta e gamma sinucleine ricombinanti sono mostrate come controlli positivi.

In B, è stata eseguita una co-immunoprecipitazione utilizzando l'anticorpo specifico per PP2Ac 1D6, che ha immunoprecipitato PP2Ac e ha co-immunoprecipitato una notevole quantità di alfa-sinucleina interagente, ma quasi nessuna beta-sinucleina. Nessuna gamma-sinucleina è stata co-immunoprecipitata con PP2Ac. Questi dati di co-immunoprecipitazione suggeriscono che l'alfa-sinucleina è il modulatore endogeno di PP2Ac in vivo.

Vogliamo ringraziare tutti coloro che ci hanno aiutato nella realizzazione di questo video. In conclusione, questa è Ruth Perez. Sonavarak Lek.

Javier Vargas. Le auguriamo un grande successo. Arrivederci e buona fortuna.