Ricombinante da α-β e γ Synucleins stimolare attività di subunità catalitica della proteina fosfatasi 2A nelle analisi gratuita delle cellule

Le sinucleine alfa, beta e gamma ricombinanti stimolano l'attività della subunità catalitica della proteina fosfatasi 2A nei saggi su cellule libere. Ciao, mi chiamo Sovanarak Lek. Sono uno studente di medicina presso il Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L.Foster School of Medicine.

In questo video, dimostrerò un saggio metrico del colore a due vie della fosfatasi proteica utilizzando proteine della sinucleina ricombinante. Preparazione di tamponi e radianti. Preparazione del tampone p-nitrofenolo fosfato.

Per preparare 50 mil di tampone pNPP, sciogliere la base di Trizma in 25 mil di acqua deionizzata ultrapura in un becher. Aggiungere una barra di agitazione pulita e posizionarla sull'agitatore magnetico. Una volta che Trizma si è sciolto, aggiungere il cloruro di calcio continuando a mescolare.

Regolare il pH a 7,0. Trasferire la soluzione in un cilindro graduato. Portare il volume totale finale a 50 mil con acqua deionizzata ultrapura.

Preparazione della soluzione verde di malachite. La soluzione verde di malachite richiede tre soluzioni, parti A, B e C.La soluzione A è acido cloridrico a quattro molari. La soluzione è una combinazione di molibdato di ammonio più la soluzione A.La soluzione C è allo 0,045% di sale di ossalato verde di malachite.

Per preparare la soluzione D, mescolare una parte B con tre parti C, rapporto uno a tre. Mescolate un'ora a temperatura ambiente. Infine, filtrare la soluzione D attraverso una membrana da 22 micrum e conservarla a quattro gradi Celsius.

Proteggere dalla luce. Preparazione dell'attivatore. L'attivatore è l'uno per cento di soluzione Tween 20.

Pippette 10 microlitri di Tween 20 in 990 microlitri di acqua deionizzata ultrapura. Vortice fino a quando Tween 20 non si dissolve completamente. Preparazione della soluzione di lavoro malachite verde più Tween 20.

Aggiungere l'attivatore alla soluzione D in un rapporto di uno a 100. Preparazione della treonina fosfopeptide. Per preparare una soluzione madre da due mM pT, aggiungere 550 microlitri di acqua deionizzata ultrapura a un milligrammo di pT.

Vortice fino a quando la fosfopeptide non è completamente dissolta. Mettere sul ghiaccio per usarlo immediatamente. Conservare le aliquote pT extra a meno 20 gradi Celsius.

Preparazione della sinucleina. Risospendere un milligrammo di sinucleina in mil di acqua deionizzata ultrapura ad una concentrazione finale di un milligrammo per mil. Vorticare delicatamente per sciogliere.

Utilizzare immediatamente e conservare le aliquote non utilizzate a meno 80 gradi Celsius. Preparazione degli standard sui fosfati. Primi passi sugli standard dei fosfati.

Per preparare 1 mM di soluzione madre di fosfato, sciogliere il fosfato di potassio in acqua deionizzata ultrapura in un becher con una barra di agitazione. Trasferire nel cilindro graduato e portare il volume finale a 100 mils. Si tratta di una soluzione da 10 mM.

Filtrare l'intera soluzione attraverso un filtro da 22 micros utilizzando una siringa grande. Diluire questo a 1 a 100 per ottenere una soluzione di fosfato da 1 mM da utilizzare per gli standard di analisi. Norme sui fosfati fase due.

Aggiungere la quantità appropriata di fosfato più acqua deionizzata ultrapura in provette da 1,5 mil come da tabella. In questo modo si otterranno provette da 150, 300, 600, 1, 200 e 2.400 pmol di fosfato. E conservare le aliquote a meno 20 gradi Celsius.

Saggio di attività PP2A. Preparare il saggio PP2A in provette da 1,5 mil su ghiaccio. Aggiungere 43 microlitri di tampone pNPP.

Aggiungere un microlitro di PP2Ac ricombinante umano. Aggiungere la sinucleina e incubare PP2A più sinucleina per 30 minuti su un Nutator a quattro gradi Celsius. Quindi, aggiungi 16 microlitri di 2mM pT.

Incubare 10 minuti a 30 gradi Celsius a bagnomaria. Su una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti, aggiungere 25 microlitri di ciascuno standard di fosfato in duplice duplicato dal basso verso l'alto. Pipet 24 microlitri di ciascun saggio PP2A in duplicato sulla stessa piastra a 96 pozzetti con gli standard.

Pipetta 75 microlitri di soluzione D contenente Tween 20 per ogni campione e standard. Dopo l'aggiunta di MGT, si noterà un cambiamento di colore nei pozzetti quando sono presenti fosfati liberi. Analisi fotometrica.

Analisi su uno spettrofotometro impostato a 630 nanometri. Risultati rappresentativi. Qui abbiamo un saggio PP2A rappresentativo e il grafico che dimostra la curva standard.

A sinistra ci sono gli standard sui fosfati. Più fosfato contengono i pozzetti, più scura è la tonalità di verde. A destra abbiamo PP2A che è stato incubato con sinucleine alfa, beta o gamma a diverse concentrazioni molari.

Concentrazioni più elevate erano più efficaci nello stimolare l'attività della subunità catalitica PP2A. Qui vediamo la rappresentazione grafica dell'attività di PP2A in risposta a concentrazioni variabili di alfa sinucleina, beta sinucleina e gamma sinucleina. L'alfa sinucleina, la beta sinucleina e la gamma sinucleina erano tutti stimolatori significativi dell'attività di PP2A alla concentrazione di uno o due micromolari.

Solo l'alfa sinucleina e la beta sinucleina erano stimolatori significativi dell'attività di PP2A a una concentrazione di 0,5 micromolari. La figura tre mostra l'interazione di PP2Ac con le sinucleine endogene nel cervello di topo. In A, le sinucleine alfa, beta e gamma ricombinanti sono mostrate come controlli positivi.

In B, la co-immunoprecipitazione è stata effettuata utilizzando l'anticorpo 1D6 specifico per PP2Ac, che ha ridotto PP2Ac e ha anche ridotto una notevole quantità di alfa sinucleina interagente, ma quasi nessuna beta sinucleina. Nessuna gamma sinucleina è scesa con PP2Ac nella co-immunoprecipitazione. Questi dati di co-immunoprecipitazione suggeriscono che l'alfa sinucleina è il modulatore endogeno di PP2Ac in vivo.

Vogliamo ringraziare tutti coloro che ci hanno aiutato a realizzare questo video. Quindi, in conclusione, questa è Ruth Perez. Sonavarak Lek.

Javier Vargas. Ti auguro un grande successo. Arrivederci e buona fortuna.