Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

L'obiettivo generale dell'isolamento della microglia magnetica CD11b è quello di ottenere un'elevata purezza finale della microglia postnatale in un periodo di tempo relativamente breve ai fini di una versatile sperimentazione in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come i meccanismi di segnalazione pertinenti all'infiammazione neurale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi attualmente disponibili è che l'isolamento richiede circa 30 minuti, senza sacrificare la purezza, la resa o la vitalità.

Inizia trasferendo le teste appena decapitate da cuccioli di topo di uno o due giorni in una cappa a flusso d'aria laminare. Quindi, usa le forbici da micro-dissezione diritte da 4,5 pollici per praticare una piccola incisione nel cranio e nelle meningi inserendo le punte nell'apertura formata dalla decapitazione e tagliando da caudale a rostrale. Dopo aver praticato l'incisione, sbucciare lateralmente una parte dell'emisfero.

Quindi usa un paio di pinzette curve o uncinate per rimuovere l'intero cervello. Trasferire il cervello in una provetta da 50 millilitri contenente due millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% e incubare per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Lavare il cervello con un terreno di coltura fresco aggiungendo e rimuovendo il terreno.

Al termine dei lavaggi, aggiungere due millilitri di terreno di coltura per cervello e omogeneizzare triturando il cervello. Quando il tessuto cerebrale non si riduce, passare a una pipetta con un'apertura più piccola. Al termine della triturazione, quando la sospensione è chiara e senza pezzi visibili, passare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micron per creare una singola coltura cellulare.

Quindi pipettare da otto a nove millilitri di terreno di crescita in fiasche T75, due fiasche per cervello e aggiungere millilitri di cervello omogeneizzato a ciascuna fiaschetta. Far crescere le cellule fino all'isolamento il sedicesimo giorno. Dopo sedici giorni, trasferire il terreno di coltura dal pallone in un tubo fresco da 50 millilitri.

Aggiungere tre millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% a ciascun pallone T75. Quindi agitare i palloni per cinque minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Centrifugare il terreno di coltura a 0,4 volte g per cinque minuti.

Dopo aver agitato per cinque minuti, aggiungere un minimo di quattro millilitri di terreno di coltura centrifugato per arrestare la reazione di tripsina EDTA e triturare per assicurarsi che tutte le cellule siano state staccate. Quindi passare le cellule attraverso un colino cellulare da 70 micromolari per creare una singola coltura cellulare. Eseguire un conteggio delle cellule, quindi centrifugare a 0,4 volte g per cinque minuti.

Quindi, prendi un tubo di polistirolo da cinque millilitri, aggiungi un millilitro di terreno consigliato e segna il menisco. Aggiungi il terreno consigliato fino a 2,5 millilitri e segna anche questo menisco. Quindi, rimuovere il terreno e risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno consigliato.

Trasferisci questa miscela in un tubo di polistirene da cinque millilitri, quindi diluisci fino al segno di un millilitro. Quindi aggiungere 50 microlitri di siero di ratto per ogni millilitro di cellule sospese e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, preparare il cocktail di selezione mescolando 25 microlitri del componente A e 25 microlitri del componente B.Trascorsi i cinque minuti, aggiungere 50 microlitri del cocktail di selezione alle cellule e incubare per altri cinque minuti a temperatura ambiente.

Agitare le microsfere per 45 secondi. Quindi aggiungere 80 microlitri di microsfere per un millilitro di campione e incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere il terreno consigliato fino al segno di 2,5 millilitri sul tubo di polistirolo.

Mettere il tubo nel supporto magnetico per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, versare lentamente il terreno in un tubo di polistirene da 15 millilitri ancora nel magnete. Ripetere la separazione magnetica altre tre volte, aggiungendo ogni volta il terreno consigliato fino al segno di 2,5 millilitri.

Dopo l'ultima separazione magnetica, aggiungere tre millilitri di terreno di coltura e contare il numero di cellule utilizzando un contatore di cellule. Piastra le cellule in piastre rivestite di poli-D-lisina per i trattamenti. Placcare la frazione negativa dal tubo da 15 millilitri, che contiene principalmente astrociti, in fiasche T75.

Dopo almeno sei ore di incubazione in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, riposizionare tutto il terreno di coltura nelle fiasche contenenti la frazione negativa prima di rimetterlo nell'incubatrice. Questa immagine mostra l'immunocitochimica di una coltura microgliale isolata sondata per IBA, un marcatore di microglia nel canale verde, e GFAP, un marcatore di astrociti, nel canale rosso. La colorazione di Hoechst rivela la presenza di nuclei cellulari.

L'assenza di cellule GFAP-positive dimostra che anche le microglia isolate utilizzando il kit di selezione positiva CD11b hanno un'elevata purezza. Queste proteine immunoblotted provenienti da una coltura microgliale isolata sono state sondate per GFAP, che appare come una banda di circa 51 kilodalton, e IBA1, che appare come una banda di circa 15 kilodalton. La beta-actina è stata utilizzata come controllo del carico e appare a circa 42 kilodalton.

Un problema con il vecchio kit di isolamento era che la fluorescenza PE poteva essere osservata nel canale rosso, come si vede qui. La procedura modificata non produce alcuna autofluorescenza dalle sfere magnetiche, come si vede nel canale rosso qui. La microglia isolata con questa procedura può essere utilizzata per studi di segnalazione.

L'analisi del western blot mostra che il Fyn e la fosfo-src tirosina Y416 possono essere rilevati da microglia isolate con il nostro metodo recentemente perfezionato. La frazione negativa della separazione microgliale contiene astrociti che possono essere utilizzati per studi di segnalazione. Il Western blotting mostra che la frazione negativa contiene cellule GFAP-positive.

L'analisi del western blot mostra che il Fyn e la fosfo-src tirosina Y416 possono essere rilevati dalle cellule GFAP-positive. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la microscopia a fluorescenza multicanale, il western blotting e la PCR quantitativa, per rispondere a domande riguardanti l'espressione genica e la segnalazione proteica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questa tecnica di isolamento rapido ai fini della sperimentazione microgliale.