Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

L'obiettivo generale di questo protocollo per la generazione di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC è modellare i disturbi neurosviluppali umani precoci. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo del cervello umano, come il ruolo dei sintesomi e delle ciglia nella neurogenesi e nella microcefalia primaria. Il principale vantaggio di questa tecnica è che rappresenta un modello solido e rapido per ottenere risultati riproducibili da organoidi cerebrali derivati da iPSC di pazienti.

La procedura sarà dimostrata da Elke Gabriel, una ricercatrice post-dottorato del mio laboratorio presso il Centro di Medicina Molecolare di Colonia. Per iniziare questa procedura, raccogliere le neurosfere con una micropipetta da 200 microlitri utilizzando una punta da due millimetri precedentemente tagliata con forbici sterili. Successivamente, posizionare le neurosfere a circa cinque millimetri di distanza l'una dall'altra su un film di paraffina in una piastra da 100 millilitri.

E rimuovere con attenzione la maggior quantità possibile del mezzo residuo. Quindi, aggiungere una goccia di matrice EHS su ciascun neurosfero singolo. Incubare le gocce di matrice EHS con i neurosfere per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

In seguito, lavare con attenzione le neurosfere dal film di paraffina lavandole con mezzo per neurosfere. Successivamente, incubare le neurosfere per i successivi quattro giorni e aggiungere due millimetri di mezzo fresco per neurosfere al secondo giorno. In questa procedura, aggiungere 100 millilitri di mezzo per organoidi cerebrali a ciascun matraccio agitatore attraverso i bracci laterali.

E preriscaldare il mezzo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per almeno 20 minuti. Successivamente, assicurarsi che le neurosfere siano tutte separate. Se due o più sono collegate tramite matrice EHS, separarle tagliando la matrice di collegamento con un bisturi.

Impostare un programma di agitazione a 25 giri al minuto. Trasferire con attenzione le neurosfere incorporate nella matrice EHS nei flaconi agitatori contenenti 100 millilitri di mezzo per organoidi. Successivamente, posizionare i flaconi agitatori su una piastra magnetica di agitazione all'interno dell'incubatore per 14 giorni a 37 gradi Celsius.

Questo è il giorno zero della coltura di organoidi. Cambiare il mezzo una volta alla settimana rimuovendo metà del mezzo e aggiungendo la stessa quantità di mezzo fresco. In questo passaggio, raccogliere gli organoidi dalla coltura in fiasca agitata al giorno 14 utilizzando una micropipetta da un millilitro pre-tagliata.

Mettere tutti in una piastra da 60 millimetri e lavarli una volta con cinque millilitri di DMEM F12 caldo per tre minuti. Successivamente, preparare una provetta da 1,5 millilitri con 500 microlitri di PFA al 4% caldo. Posizionare ogni organoide separatamente in ciascuna provetta e fissarli per 30-60 minuti a temperatura ambiente.

In seguito, utilizzare un’ansa di inoculazione per rimuovere gli organoidi. Quindi, rimuovere il PFA e lavare gli organoidi fissati due volte per 10 minuti ciascuna con un millilitro di PBS. Successivamente, conservare gli organoidi in un millilitro di PBS a quattro gradi Celsius per un massimo di 7 giorni per ulteriori utilizzi.

Per incorporare gli organoidi per la crio-sezione, rimuovere il PBS e aggiungere 1 millilitro di soluzione di saccarosio al 30% in ogni provetta per disidratare gli organoidi prima della criocongelazione. Dopo l'aggiunta della soluzione di saccarosio, gli organoidi dovrebbero galleggiare sulla superficie. Conservare gli organoidi tutta la notte nella soluzione di saccarosio a quattro gradi Celsius.

Entro il giorno successivo, gli organoidi dovrebbero essere affondati sul fondo del tubo. Successivamente, riempire uno stampo per campioni in vinile con 400 millilitri di composto OCT. Utilizzare quindi un’ansa di inoculazione per posizionare un organoide al centro dello stampo.

Etichettare il bordo dello stampo con il nome del campione. Successivamente, congelare lo stampo contenente gli organoidi a meno 80 gradi Celsius fino alla criosezione. In seguito, ricoprire le vetrini in vetro con PLL 0,1% in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi, lasciare asciugare i vetrini per tre ore. Conservare i vetrini a quattro gradi Celsius e riscaldarli alla temperatura ambiente prima dell'uso. Successivamente, sezionare gli organoidi congelati in fette spesse da 20 a 50 micrometri sui vetrini criogenici rivestiti con PLL.

Lasciare asciugare i preparati per un'ora a temperatura ambiente e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino all'ulteriore elaborazione. Imaging immunofluorescente di organoidi criosezionati che mostrano una zona ventricolare tipica e una placca corticale primitiva. La zona ventricolare si estende dal lato apicale a quello basilare.

Si noti che le cellule all'interno della zona ventricolare (VZ) mostrano nuclei disposti in modo simile a un palizzata, suggerendo che si tratti di cellule gliali radiali. Il pannello destro mostra la colorazione immunofluorescente di NPC positive a nestina all'interno della VZ e di neuroni positivi a TUJ1 nella lamina corticale primitiva. Qui sono mostrati due esempi di VZ colorate con PVIM e ARL13B.

Le regioni contrassegnate da quadrati bianchi sono ingrandite. Le cellule gliali radiali apicali che si dividono nel lato apicale della zona ventricolare sono positive per PVIM. Il piano di divisione di una cellula in anafase è orizzontale rispetto alla linea della superficie del lume, che è marcata dalla colorazione per ARL 13B.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 23 giorni se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire controlli periodici della qualità e del microplasma sulle colture. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo in neurobiologia per esplorare i meccanismi dello sviluppo neuronale negli organoidi cerebrali umani.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare organoidi cerebrali umani da diverse linee cellulari iPSC, inclusi ceppi cellulari di pazienti con funzioni cellulari compromesse.