Maturazione di staminali umane cardiomiociti derivati ​​dalle cellule in Biowires Utilizzando Stimolazione Elettrica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare metodi di coltura cellulare tridimensionale controllata nella stimolazione elettrica per promuovere la maturazione di cardiomiociti derivati da cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria del tessuto cardiaco, incluso il modo in cui i diversi parametri di stimolazione elettrica o la durata influenzano la funzione delle cellule cardiache e lo stato di maturazione. I risultati finali sono tessuti cardiaci umani ingegnerizzati di maggiore maturità.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle applicazioni diagnostiche come i test di sicurezza ed efficacia di nuovi farmaci perché i cardiomiociti con caratteristiche mature come il progresso elettrico hanno maggiori probabilità di fungere da modelli più accurati di cellule cardiache umane negli studi di screening farmacologico. Combinare il monomero PDMS e l'agente indurente in un rapporto 10:1 e mescolare bene. Lasciare riposare per cinque minuti per degassare.

Quindi caricare una piastra di Petri contenente il master per il modello di biowire con la miscela PDMS. Cerca di ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria. Quindi polimerizzare il PDMS a 70 gradi Celsius per due ore.

Quindi recuperare lo stampo solidificato utilizzando prima una lama affilata attorno ai bordi e poi staccandolo. Quindi tagliare il PDMS in eccesso e raccogliere tutti i modelli in una busta di sterilizzazione. Steam autoclave i modelli a 121 gradi Celsius per 20 minuti.

E poi caricare ogni modello in una capsula di Petri sterile sotto la ventilazione di una cappa di biosicurezza. Ora per ogni modello, usa una pinzetta per montare un pezzo di sutura di seta sterile 6.0 nella scanalatura che attraversa l'intero canale. I modelli sono quindi pronti per la semina cellulare.

La sutura servirà come modello per la formazione di costrutti 3D che si allineano lungo l'asse della sutura imitando la forma delle fibre cardiache. Per ogni camera, crea un paio di pezzi rettangolari in policarbonato che fungano da cornice per la camera di stimolazione elettrica. Lungo la linea centrale di ogni pezzo, praticare due fori larghi tre millimetri, a due centimetri di distanza.

Per ogni camera preparare due canne di carbonio lunghe 1,5 centimetri. A circa 3 millimetri dall'estremità di ogni asta praticare un foro largo un millimetro. Quindi infilare ogni foro con un filo di platino e avvolgere un'estremità del filo attorno all'asta.

Successivamente, per ogni camera inserire due aste tra due pezzi di policarbonato formando un telaio. Quindi versare circa due millilitri di PDMS in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti e posizionare il telaio nel pozzetto con PDMS, immergendo il fondo dei telai. Polimerizzare il PDMS a 70 gradi Celsius per due ore in modo che il PDMS fissi il telaio.

Quindi rimuovere la camera completata dalla piastra con il PDMS collegato. Per testare il funzionamento di una camera assemblata, collegare i fili di platino a una batteria e utilizzare un voltmetro per verificare che l'elettricità passi attraverso le aste. Ora trasferisci le camere funzionali in una busta di sterilizzazione e usa 20 minuti di sterilizzazione a vapore a 121 gradi Celsius per prepararle alla coltura cellulare.

Per preparare il gel, preraffreddare tutti i componenti del gel con ghiaccio prima di mescolarli in un tubo sterile. Assicurarsi di aggiungere per ultimo il collagene e la matrice extra cellulare e mescolare i componenti utilizzando il pipettaggio. Le cellule hanno cardiomiociti differenziati dalle cellule staminali pluripotenti umane.

Raccogli le cellule e per ogni impianto di preparazione biowire prepara 3,5 microlitri di gel di collagene contenente mezzo milione di cellule. A questo punto, utilizzare un puntale per pipetta P10 per caricare circa quattro millilitri di sospensione nella dima a canale lunga 0,5 centimetri in ciascuna piastra. Regolare la posizione della sutura utilizzando una pinza sterile, se necessario, in modo che sia completamente tesa.

Una volta seminate le cellule, assicurati di risospendere sempre la miscela di cellule in gel prima di assumere l'autoclave per avere risultati coerenti. Dopo aver caricato i canali, coprire il fondo del piatto con PBS sterile facendo attenzione a non toccare il gel. Ciò garantirà che i biofili non si disidratino durante la polimerizzazione.

Dopo aver incubato i biofili a 37 gradi Celsius per 30 minuti, sostituire il PBS con un terreno di coltura sufficiente a coprire le cellule. 12 millilitri sono di solito sufficienti. Quindi coltiva il piatto per una settimana, sostituendo il mezzo a giorni alterni.

In una cabina di biosicurezza, aggiungere due millilitri di PBS a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti che ospiterà una camera di stimolazione elettrica. Quindi utilizzare una pinzetta sterile per posizionare delicatamente i dispositivi dell'autoclave nei pozzetti. Una volta in posizione, scartare il PBS e sostituirlo con cinque millilitri di terreno caldo che dovrebbe coprire completamente le aste di carbonio.

Prima di coltivare le cellule per 24 ore, osservare la contrattilità dei cardiomiociti in risposta alla stimolazione elettrica per assicurarsi che le cellule catturino lo stimolo elettrico e rispondano con le contrazioni. Quindi, posizionare i biofili nella camera dello stimolatore elettrico e orientare i canali perpendicolarmente alle barre di carbonio. Estendere i fili di platino lontano dalla piastra e poi coprire le piastre.

Collegare i fili a uno stimolatore elettrico. Impostare lo stimolatore in modo che fornisca impulsi bifasici di un millisecondo a un hertz e a tre volt per centimetro. Quindi trasferire i preparati nello stimolatore elettrico in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Aumentare la velocità di stimolazione in modo incrementale ogni 24 ore da un hertz al giorno zero a sei hertz al sesto giorno. Durante questa settimana di cultura, cambia il mezzo a giorni alterni. E osservare la contrattilità dei cardiomiociti su base giornaliera.

Dopo sette giorni di precoltura nel biowire, le cellule hanno rimodellato il gel attorno alla sutura. Le cellule si sono assemblate lungo l'asse della sutura per formare tessuto cardiaco allineato. Le cellule che esprimevano proteine contrattili cardiache mostravano bande sarcomeriche nell'apparato contrattile e le loro miofibrille erano allineate lungo l'asse della sutura.

Le cellule nel biowire hanno mostrato tassi di proliferazione inferiori rispetto alle cellule nei corpi embrioidi. La gestione del calcio è stata significativamente migliorata nei cardiomiociti coltivati nei biofili. Il trattamento con caffeina ha indotto un brusco rilascio di calcio dal reticolo sacroplasmatico.

Tali transitori sono stati trovati solo nelle cellule stimolate. C'erano anche frequenze di stimolazione significativamente più elevate a seconda delle ampiezze di rilascio del calcio. Inoltre, i cardiomiociti coltivati in biofili hanno mostrato un miglioramento dell'hERG e della densità di corrente del raddrizzatore verso l'interno rispetto alla coltivazione in corpi embrioidi, che è stata ulteriormente potenziata dalla stimolazione elettrica.

La migliore corrente del raddrizzatore verso l'interno era coerente con l'aumento dell'espressione del canale di rettifica verso l'interno del potassio jean, KCN J2. L'automaticità, la capacità di battere spontaneamente, era significativamente più alta nei cardiomiociti derivati dal corpo embrioide rispetto ai biofili controllati. Il controllo ha mostrato un'automaticità paragonabile alla preparazione di biowire sottoposta al regime a sei hertz. Una volta padroneggiati, l'installazione dei biofili può essere eseguita in mezza giornata.

L'impostazione della stimolazione elettrica richiederà un paio d'ore e i risultati finali possono essere raggiunti in due settimane. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i cardiomiociti differenziati da diverse linee cellulari o da diversi protocolli possono variare leggermente nella loro maturità e purezza. Pertanto, potrebbe essere necessario ottimizzare i parametri sperimentali, come la velocità di stimolazione delle cellule.

Seguendo questa procedura, altre condizioni, tra cui la variazione della composizione cellulare e l'utilizzo di cardiomiociti mutanti, possono essere ottimizzate per rispondere a una serie di domande aggiuntive.