Name: Determinazione della potenza relativa di un Anti-TNF anticorpo monoclonale (mAb) di neutralizzante TNF utilizzando un metodo di Bioanalytical In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: Scopri come determinare la potenza relativa di anticorpi monoclonali anti-TNF utilizzando cellule WEHI 164. Questo metodo bioanalitico in vitro consente di confrontare l'efficienza di neutralizzazione tra mAb di riferimento e campioni analitici.

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Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio nazionale di scienza e tecnologia (CONACYT), Messico concedere PEI CONACYT 2015 220333, senza partecipazione nella progettazione dello studio.

1. preparazione dei Media e delle soluzioni <ol><li>preparare il terreno di coltura: RPMI-1640 con 10% FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Preparare analisi colturale: RPMI-1640 senza rosso fenolo ma con 1% FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavaggio della cella: soluzione di privo di Ca e Mg DPBS con 0,02% EDTA, pH 7.4.</li>
	<li>Preparare soluzione di distacco delle cellule: 0,125% tripsina con 1 mM EDTA.
	<ol><li>Scongelare 100 mL di una soluzione di 0,25% di tripsina-EDTA e trasferimento in una sterile bottiglia da 500 mL.</li>
		<li>Mix con 100 mL di cella soluzione di lavaggio e dispensare aliquote da 15 mL in provette sterili da 15 mL. Conservare a -70 a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
		<li>Filtrare queste soluzioni attraverso una membrana da 0,22 µm e caldo fino a 37 ° C per almeno 30 min prima dell'uso.</li>
	</ol></li> <li>Preparare la soluzione di riserva di induzione di apoptosi soluzione TNFα 3,3 µ g/ml.
	<ol><li>Sciogliere 20 µ g di TNFα con 500 µ l di acqua filtro-sterilizzato nel suo contenitore primario e mescolare fino a completa dissoluzione.</li>
		<li>Trasferire in una provetta sterile da 15 mL e aggiungere 5,5 mL di DPBS privo di Ca e Mg soluzione per questo tubo. Mescolare delicatamente con un miscelatore vortex.</li>
		<li>Aliquota della soluzione in 70 porzioni µ l. Pipettare ogni aliquota in microprovette da 0,5 mL e conservare a -80 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Preparare apoptosi induzione soluzione: soluzione TNFα a 40 ng/mL.
	<ol><li>Scongelare un'aliquota della soluzione madre induzione apoptosi, incubando in un bagno di acqua a 25 ˚ c per 10 min.</li>
		<li>Diluire la soluzione madre di induzione di apoptosi a 40 ng/mL aggiungendo 61 µ l di soluzione TNFα 3,3 µ g/mL a 4,939 mL di medium di coltura di analisi in una provetta sterile da 15 mL.</li>
		<li>Mix da miscelatore vortex per 10 s; questa soluzione deve essere preparata fresca prima dell'uso.</li>
		<li>Riscaldare la soluzione a 37 ° C per almeno 30 min prima dell'uso in analisi eneutralization th.</li>
	</ol></li> <li>Preparare la soluzione di substrato: caspase 3/7 Glo soluzione 7 , 8.
	<ol><li>Scongelare caspase soluzione tampone (buffer di Glo caspase 3/7) 12 h prima dell'uso.</li>
		<li>Lasciare che la soluzione tampone di caspase e il substrato (caspase 3/7 Glo substrato) siedono separatamente a 25 ± 5 ° C per 30 min prima della miscelazione.</li>
		<li>Trasferire 10 mL della soluzione tampone caspase flaconcino di substrato e mescolare capovolgendo.</li>
		<li>Keep a 25 ± 5 ° C, protetto da luce fino all'uso. 
		Nota: La soluzione è stabile per 6 ore a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li></ol> 2. Culturing e conteggio delle cellule <ol><li>cella lo scongelamento e la sottocultura prima.
	<ol><li>Rimuovere un flaconcino con 164 WEHI cellule 9 da un congelatore a-80 ˚ c e trasferirli in un bagno di ghiaccio.</li>
		<li>Pipetta su e giù con 1 mL di terreno di coltura pre-riscaldato, fino a quando le cellule congelate scongelare completamente.</li>
		<li>Erogare 9 mL di terreno di coltura pre-riscaldato in una provetta sterile da 15ml.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare nella provetta sterile 15 mL e mescolare delicatamente cinque volte capovolgendo.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 125 x g per 3 min. scartare il sopranatante e disaggregare il pellet cellulare.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di terreno di coltura per il tubo. Mescolare fino a quando le cellule sono completamente risospese.</li>
		<li>Per conta cellulare, trasferire 50 µ l di sospensione cellulare a una 500 µ l conetti e mescolare con 50 µ l di blu di trypan 0,4%. Contare le celle e regolare a 0,5 x 10 6 cellule/mL. Vedere il punto 2.2, di sotto.</li>
		<li>Aggiungere 13 mL di terreno di coltura pre-riscaldato per un matraccio di cultura cellulare 75ml.</li>
		<li>Erogazione sufficiente volume di sospensione cellulare dal punto 2.1.6 per raggiungere 0,5 x 10 6 cellule/mL in un matraccio di cultura delle cellule e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte.</li>
	</ol></li> <li>Conta cellulare. 
	Nota: Vedi riferimento 10.
	<ol><li>Utilizzando la soluzione dal punto 2.1.6, trasferire 0,05 mL in un emocitometro e determinare la densità delle cellule al microscopio usando l'esclusione del blu di trypan.</li>
		<li>Quantificare il numero totale di cellule e cellule vitali.</li>
		<li>Regolare le sospensioni delle cellule a 0,5 x 10 6 cellule/mL. 
		Equazione 1 
		V il terreno di coltura (mL) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55376/55376eq1.jpg" /> V il terreno di coltura (mL) = (5 mL - V sospensione cellulare) V terreno di coltura (mL) = volume rettificato di WEHI 164 cella sospensione NVC = numero di vitali WEHI 164 cellule/mL V terreno di coltura (mL) = volume di terreno di coltura di dosaggio aggiunto alla sospensione di cellule di raggiungere 0,5 x 10 6 cellule/mL 0,5 x 10 6 = densità cellulare Target</li>
	</ol></li> <li>Cellulare distacco e la seconda e la terza subcoltura. 
	Nota: Un sistema di vuoto può essere utilizzato per rimuovere le soluzioni dai palloni. Pipette sterili monouso o vetro possono essere utilizzati. Se la pipetta ha uno zoccolo di cotone nella parte superiore, questa deve essere rimossa prima dell'uso.
	<ol><li>Rimuovere il terreno di coltura dalla coltura delle cellule T-boccetta utilizzando una pipetta sterile da 1 mL e un vuoto.</li>
		Soluzione <li>dispensare 5 mL di lavaggio delle cellule nella cultura T-boccetta, mescolare delicatamente e scartare la soluzione. Ripetere questo passaggio due volte. 
		Nota: La rimozione completa del mezzo di coltura è critica per distacco cellulare efficiente.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL di soluzione di distacco delle cellule al T-pallone e lasciare riposare per 3 minuti in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
		<li>Verificare l'assenza di cellule nella parete interna pallone sotto il microscopio. Rimuovere le celle dalla cultura T-boccetta utilizzando una pipetta sterile 20 mL e li pipettare in una provetta sterile da 50 mL.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 125 x g per 3 min. scartare il supernatante e risospendere il sedimento con un altro 5 mL di terreno di coltura.</li>
		<li>Contare le celle e aggiungere abbastanza terreno di coltura per raggiungere la concentrazione di cella desiderata secondo l'equazione 1.</li>
		<li>Aggiungere questa sospensione un 72 cm 2 T-boccetta e incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
		<li>Sottocultura le cellule almeno due volte prima di utilizzarli nella neutralizzazione di dosaggio. Ripetere i passaggi 2.3.1-2.3.8 per i prossimi due giorni.</li>
	</ol></li> <li>Assay sospensione cellulare.
	<ol><li>Selezionare un 164 WEHI sottocultura che ha almeno tre passaggi. Vedere il passaggio 2.1.</li>
		<li>Detach e contare le celle secondo punti 2.2 e 2.3 del presente protocollo.</li>
		<li>Diluire la sospensione cellulare secondo l'equazione 1 a 0,5 x 10 6 cellule/mL.</li>
		<li>Utilizzare questa sospensione cellulare per l'analisi di neutralizzazione. Mescolare tutte le sospensioni di cellule da prima del miscelatore vortex utilizzare.</li>
	</ol></li></ol> 3. L'anticorpo e diluizioni <ol><li>quantificazione di mAbs.
	<ol><li>Determinare la concentrazione della sostanza di riferimento, campione di controllo e campione analitico attraverso assorbimento UV a 280 nm usando loro estinzione di massa coefficiente (1.39) 11. 
		Nota: Originale concentrazioni potrebbero essere prese da etichette di prodotto di droga. Tuttavia, questo deve essere verificato di assorbimento UV.</li>
	</ol></li> <li>mAb diluizioni.
	<ol><li>Diluire tutti i campioni in modo indipendente in triplice copia, con soluzione di DPBS privo di Ca e Mg in 2 mL microprovette, fino a 2 mg/mL. Confermare questa concentrazione di assorbimento UV in triplice copia, con DPBS privo di Ca e Mg soluzione come il vuoto.</li>
		<li>Mescolare le soluzioni stock proteina per 5 s usando un miscelatore vortex.</li>
		<li>Diluire 100 µ l di ogni soluzione di mAb 2 mg/mL con 0,9 mL di medium di coltura analisi.</li>
		<li>Mix per 5 s di Miscelatore vortex. 
		Nota: Queste soluzioni hanno una concentrazione di 200 µ g/mL. Diluizioni devono essere fatto per ogni triplicato.</li>
		<li>Diluire 10 & n.181; L di ogni soluzione di mAb 200 µ g/mL con 0,99 mL di medium di coltura di analisi. Mix per 5 s usando un miscelatore vortex. Queste soluzioni hanno una concentrazione di 2 µ g/mL. Effettuare diluizioni seriali per ogni triplice copia prima del loro utilizzo nell'analisi della neutralizzazione.</li>
		<li>Rendere anti TNFα mAb diluizioni in tre piastre microtiter indipendente. Creare un duplicato da ogni triplice copia indipendente e dispensare loro in una micropiastra, come indicato nella tabella 1. Sostanza di riferimento < tavolo fo:keep-together.within-pagina = "1" fo:keep-con-next.within-pagina = "sempre" fo:text-align = "center" > <tbody><tr><td colspan="2"> piastra 1</td> <td colspan="2"> Plate 2</td>
					<td colspan="2"> piastra 3</td></tr>
				<tr><td>Pozzetti</td> <td>campione</td> <td>pozzi</td> <td>campione</td> <td>pozzi</td> <td>campione</td></tr>
				<tr><td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> sostanza di riferimento</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> campione di controllo</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> campione analitico</td></tr>
				<tr><td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td></tr>
				<tr><td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> campione analitico</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> sostanza di riferimento</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> campione di controllo</td></tr>
				<tr><td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td></tr>
				<tr><td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> esempio di controllo</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> campione analitico</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> sostanza di riferimento</td></tr>
				<tr><td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td></tr></tbody>
		</table> Tabella 1: le matrici di campione di micropiastre. Un'analisi completa neutralizzazione deve essere eseguita in tre micropiastre entro coordinate B2 a G11. Casuale di erogazione di riferimento, analitica e campioni di controllo permettono ai ricercatori di verificare ogni pregiudizio nei test.</li>
		<li>Eseguire diluizioni di mAb di ogni riferimento, campione o di controllo, come illustrato nella tabella 2. 
		Nota: Le concentrazioni di mAb anti-TNFα descritte in questa tabella non sono le concentrazioni finali con il test di neutralizzazione.
		<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>Piastra colonna</td> <td>Volume di dosaggio di coltura (μL)</td> <td>Volume di sostanza di riferimento, campione o controllo Campione (uL)</td> <td>concentrazione nella piastra di dosaggio (ng/mL)</td></tr> <tr><td>2</td> <td>0</td> <td>230</td> <td>2000</td></tr> <tr><td>3</td> <td>150</td> <td>150 dalla linea 2</td> <td>1000</td></tr>
				<tr><td>4</td> <td>75</td> <td>75 da linea 3</td> <td>500</td></tr> <tr><td>5</td> <td>100</td> <td>50 da linea 3</td> <td>333</td></tr> <tr><td>6</td> <td>75</td> <td>75 dalla riga 4</td> < td &gt; 250</td></tr> <tr><td>7</td> <td>75</td> <td>75 dalla linea 5</td> <td>166</td></tr> <tr><td>8</td> <td>75</td> <td>75 dalla linea 6</td> <td>125</td></tr> <tr><td>9</td> <td>75</td> <td>75 fro linea m 7</td> <td>83</td></tr> <tr><td>10</td> <td>75</td> <td>75 dalla linea 9</td> <td>41</td></tr> <tr><td>11</td> <td>150</td> <td>75 dalla riga 10</td> <td>13</td></tr></tbody></table> T in grado 2: diluizioni di mAb Anti-TNF. Diluizioni seriali di anticorpi monoclonali anti-TNF sono illustrati in questa tabella. Le concentrazioni finali descritte in questa tabella non sono le concentrazioni nell'analisi, dove anticorpi monoclonali anti-TNF sono stati diluiti di un fattore di 3 (mAb diluizione + terreno di coltura e sospensioni di cellule). Linee in grassetto rappresentano diluizioni provenienti da linee 3, 5, 7, 9 e 10; le linee in grassetto non rappresentano diluizione dalle linee 3, 4 e 6. Queste diluizioni seriali sono fatto appena prima dell'eseguimento del test di neutralizzazione. Cura deve essere presa per miscelare pipettando su e giù tre volte prima di dispensare le diluizioni.</li>
		<li>Tenere le piastre a 25 ± 5 ° C fino all'utilizzo.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analisi di neutralizzazione con le cellule WEHI 164 <ol><li>Mix tutto cella sospensioni (0,5 x 10 6 cellule/mL) prima dell'erogazione ad ogni passo di questo protocollo nel Vortex. 
	Nota: In questa sezione, caldo ogni soluzione a 37 ° C per 30 min prima dell'uso.</li>
	<li>Trasferire 50 µ l della sospensione delle cellule a ciascuno dei 60 pozzetti di micropiastre, muovendo dalla colonna 2 e 11 e linea B a G.</li>
	<li>Trasferire 50 µ l di riferimento mAb, campione e controllo diluizioni in piastre microtiter. Seguire lo schema rappresentato nella Figura 1.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l della soluzione di induzione di apoptosi in ciascun pozzetto.</li>
	Cellule <li>utilizzare i controlli cellulari di 50 µ l di WEHI 164, erogate in tre pozzi. Portare ciascun pozzetto ad un volume finale di 150 µ l con medium di analisi cultura.</li>
	<li>Utilizzare un controllo di citotossicità di una miscela di 50 µ l di cellule WEHI 164 oltre 50 µ l di soluzione di induzione di apoptosi. Portare ciascun pozzetto ad un volume finale di 150 µ l con medium di analisi cultura.</li>
	<li>Controllo per il TNFα, utilizzare 50 µ l della soluzione di induzione di apoptosi e portarlo a 150 µ l con il medium di coltura analisi.</li>
	<li>Per il bianco, utilizzare 150 µ l di terreno di coltura saggio da solo.</li>
	<li>Riempire i pozzetti rimanenti con 150 µ l di terreno di coltura per evitare effetti di evaporazione piastra.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 4.1.1-4.1.9 due volte in due altre piastre microtiter. 
	Nota: Le concentrazioni finali di mAb nella micropiastra sono: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0,056, 0,042, 0.028, 0,014 e 0,004 µ g/mL.</li>
	<li>Caricare i campioni in micropiastre, come indicato nella Figura 1. 
	<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig1.jpg" /> Figura 1: disposizione dei campioni nelle piastre di dosaggio. B1 per G11 sono bene coordinate in micropiastre e descrivere le posizioni in cui si trovano le diluizioni del campione. Coordinate mancante sono pozzi riempiti con controlli e analisi terreno di coltura (A1-A12 e H1-H12). Questa distribuzione casuale dei campioni (forward e reverse diluizioni in micropiastra) aiuta ad per eliminare i pregiudizi nei risultati dovuto all'evaporazione del medium o altre variabili. È meglio che ogni micropiastra è fatto da un analista alla volta. R: riferimento, s: campione, CS: esempio di controllo, Dil: diluizione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a></li>
	<li>Incubare le tre piastre a 37 ° C e 5% di CO 2 per 16 ± 2 h.</li>
	<li>Lasciare che il reagente di Glo caspase 3/7 stand a 25 ± 5 ° C per 30 min prima dell'uso.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l del reagente in tutti i pozzetti, tra cui i controlli e campioni.</li>
	<li>Scuotere le piastre con un miscelatore vortex micropiastra per 3 min a 25 ± 5 ° C immediatamente dopo l'erogazione nei pozzetti.</li>
	<li>Incubare le piastre per 2,5 ± 0,5 h a 25 ± 5 ° C, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Inserire il microfonoroplates nel luminometro e completare la successiva sezione.</li>
</ol> 5. Analisi dei risultati <ol><li>utilizzando un software per rilevamento di luminescenza, selezionare la funzione di modalità ed endpoint luminescenza.</li>
	<li>Selezionare un 96 pozzetti clear-fondo piatto e suoi 80 pozzi interni, escluse le colonne 1 e 12.</li>
	<li>Selezionare un tempo d'integrazione di 1.250 ms e 10 s per la miscelazione la micropiastra prima della lettura.</li>
	<li>Selezionare i pozzi dove sostanza di riferimento, sostanza analitica e campione di controllo verrà inseriti e identificare con loro concentrazioni corrispondenti.</li>
	<li>Leggere i campioni inseriti in micropiastra con il luminometro.</li>
	<li>Utilizzare una quarta equazione di parametro per l'analisi dei risultati. Grafico di una curva dose-risposta, come raffigurato in Figura 2. 
	<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig2.jpg" /> Figura 2: curva Dose-risposta. Concentrazione di mAb anti-TNFα contro luminescenza (attuabilità delle cellule) è raffigurato. Un quarto equazione di parametro che descrive la protezione anti-TNF di Marazzi è stato utilizzato come un modello. EC50 è la concentrazione di mAb che possono neutralizzare la quantità di TNFα che causano la morte delle cellule di 50% in ogni dosaggio, esemplificato nel grafico come la variazione di pendenza. Bar descrivono la deviazione standard di luminescenza per ogni concentrazione di mAb. x rappresenta la concentrazione di Ab anti-TNF e viene raffigurato come una funzione logaritmica in ng/mL, mentre y rappresenta la risposta di luminescenza in unità arbitrarie luminescenza. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
	Nota: Nell'equazione del quarto parametro, C è la concentrazione efficace 50 (EC50). Questo valore verrà utilizzato per confrontare la sostanza di riferimento, campione e campione di controllo mediante la funzione effettrice.</li>
	<li>Per calcolare le potenze relative, difficoltà la sostanza di riferimento al 100% e calcolare le potenze del campione e controllo conseguenza. 
	Nota: Questi valori sono rappresentati in Figura 3. 
	<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig3.jpg" /> Figura 3: equazione matematica utilizzata per calcolare i EC50s e i loro valori. Valori di EC50, o parametri di tipo C, hanno loro incertezza raffigurato come errore standard. È raffigurato anche un confronto di EC50s tra i risultati di campione ed il riferimento di potenza relativa. L'intervallo di confidenza è calcolato con un α = 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a></li>
</ol>

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<li>Ponnappan, S., Ponnappan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+immune+function%3A+molecular+mechanisms+to+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Antiox+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions.</a> Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).</li>
<li>Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+sensitization+to+TNF-induced+apoptosis+by+acute+glutathione+depletion+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes.</a> Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).</li>
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<li>Männel, D. N., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+induction+of+tumor+necrosis+factor+production+in+human+monocytes+requires+complete+S-form+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide.</a> Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).</li>
<li>Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+inhibitors-state+of+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge.</a> Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Questa caratterizzazione consente di determinare a priori il comportamento biologico di una molecola in fase di sviluppo prima di costosi e laboriosi studi clinici sono condotti. È anche utile per il rilascio lotto di un prodotto di farmaco approvato. Vale la pena ricordare che queste analisi sono utili per determinare se una molecola ha un effetto biologico adeguato per quanto riguarda il suo meccanismo d'azione. Il metodo bio-analitici presentato in questa esercitazione è estremamente importante per il confron...

Potenza biologica è la misura quantitativa dell'attività biologica basate sugli attributi prodotto dosato che sono collegati alle proprietà biologiche rilevanti, considerando che la quantità (espressa in massa) è una misura fisico-chimica del contenuto proteico. Prove di attività, insieme ad altre metodologie analitiche, vengono effettuate nell'ambito di studi di comparabilità, la stabilità e la conformità del prodotto. In questo senso, misurazioni di potenza vengono utilizzati per dimostrare che i lotti di prodotto soddisfano gli attributi di qualità critica (CQAs) o i criteri di accettazione durante tutte le fasi della sperimentazione clinica e previa approvazione del mercato.
L'apoptosi è la morte programmata delle cellule, naturalmente che si verificano quando le cellule sono infettate con un virus o quando le cellule sono sollecitate da un ambientale fattore che compromette cellulare attuabilità e la funzione1,2. Tra gli altri, l'inibizione di apoptosi, o neutralizzazione biologico, è uno dei meccanismi terapeutici principalmente noti di mAbs, particolarmente nel trattamento delle malattie croniche, quali disordini infiammatori immuno-mediata. Molecole anti-TNFα esercitano le loro proprietà terapeutiche bloccando l'interazione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα) con il p55 e p75 delle cellule recettori di superficie3, impedendo così le vie di segnale che infine conducono all'apoptosi cellulare.
TNFα può produrre infiammazione in alcune malattie croniche4. TNFα spurio è secernuto nell'ambiente extracellulare da parte dei macrofagi, che sono le sentinelle del sistema immunitario innato e degli attori principali in questo tipo di malattia5. Come un percorso comune, TNFα deregolamentazione è associata con la patogenesi di queste malattie. Senza controllo e sotto costante induzione e stress cellulare, TNFα induce degenerazione delle cellule morte e tessuto, sfociare in artrite reumatoide, malattia di Crohn e altri profili patologici6.
Antagonisti TNF che bloccano l'interazione tra TNF e dei suoi recettori sono stati sempre più utilizzati come efficace terapia per ridurre la sintomatologia e ostacolare la progressione di queste malattie. Oggi, i prodotti di droga di anti-TNF sono ampiamente utilizzati per controllare la concentrazione sistemica di questa citochina, evitando così ulteriore degenerazione dei tessuti coinvolti. In questo senso, fornendo un'analisi biologica riproducibile e affidabile per descrivere la capacità specifica di un farmaco per raggiungere l'effetto biologico è di importanza fondamentale.
In questo protocollo, critico gradini-identificati durante lo sviluppo di un'analisi di neutralizzazione-per la misura di successo di potenza biologica sono evidenziate, con una particolare enfasi sulle competenze necessarie per eseguire il metodo bio-analitici. Questo metodo bioanalitiche fornisce informazioni utili comparabilità tra lotti diversi o anti-TNF prodotti di droga rispetto ad una sostanza di riferimento clinicamente testato.

<table><tbody><tr><td>WEHI 164</td><td>ATCC</td><td>CRL-1751</td><td>Cellule di fibrosarcoma da Mus musculus</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td>Conservare il terreno a 2 gradi C a 8 gradi C</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio, senza rosso fenolo</td><td>GIBCO</td><td>11835-030</td><td>Conservare il terreno a 2 gradi; C a 8 gradi C</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td>Conservare il terreno a -10 &deg; C a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>GIBCO</td><td>14190-136</td><td>Conservare il terreno a 2 gradi; C a 8 gradi C</td></tr><tr><td>Proteina TNF-alfa umana ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-020</td><td>Conservare a -20 C a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (USA), IgG molto basso</td><td>HyClone</td><td>SH3089803</td><td>conservare a -10 gradi C a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (USA), caratterizzato</td><td>HyClone</td><td>SH3007103</td><td>conservare a -10 gradi C a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Kit di analisi Caspase-Glo 3/7</td><td>Promega</td><td>G8093</td><td>Conservare il substrato Caspase-Glo. 3/7 e il tampone Caspasi-Glo. 3/7 a &ndash; 20 &ordm; C protetto daLight</td></tr><tr><td>EDTA, sale disodico, diidrato, cristallo, A.C.S. Reagente</td><td>J.T.Baker</td><td>8993-01</td><td>--</td></tr><tr><td>Campione mAb Adalimumab</td><td>Probiomed</td><td>NA</td><td>Le concentrazioni finali nella micropiastra sono:&nbsp; 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>mAb di riferimento e controllo Adalimumab</td><td>Abbvie</td><td>NA</td><td>Le concentrazioni finali nella micropiastra sono: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Molecular Devices</td><td>89429-536</td><td>SpectraMax M3</td></tr> Software per lettore di micropiastre multimodale<tr><td>&nbsp;</td><td>Dispositivi molecolari</td> <td>-</td> <td>Incubatore SoftMax Pro 6.3 GxP</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Revco&nbsp;</td><td>30482</td><td>Revco RNW3000TABB</td></tr> cappa a flusso laminare CO2 ad aria forzata<tr><td>&nbsp;</td><td>L'azienda del fornaio&nbsp; &nbsp;</td><td>200256</td><td>Panettiere SG603A-HE | Alta efficienza, classe II tipo A2&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

determinazione della potenza relativa di un anti-tnf anticorpo monoclonale (mab) di neutralizzante tnf utilizzando un metodo di bioanalytical in vitro

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

Questo protocollo viene visualizzata la misura della neutralizzazione attività apoptotica di TNFα in un modello di cellulare dei fibroblasti del topo (WEHI 164) utilizzando un mAb anti-TNF. Inoltre, questo protocollo può essere usato per valutare altre molecole anti-TNF, come proteine di fusione. Il modello di cellulare utilizzato qui è sensibile all'apoptosi TNFα-mediata quando un fattore di stress aggiuntivo è indotta in condizioni di coltura delle cellule (per esempio, la privazione del siero). Questa procedura esemplifica come eseguire questo test analitico, evidenziando le operazioni chiave riguardanti la preparazione del campione, diluizione delle cellule, l'induzione di apoptosi e misure spettrofotometriche che sono fondamentali per garantire risultati di successo. Questo protocollo rivela le condizioni migliori prestazioni relative all'induzione di apoptosi e segnale efficiente registrazione, portando a valori di bassa incertezza.

Grafico di dose-risposta (con controlli) 
Figura 1 rappresenta la risposta di luminescenza contro concentrazione di mAb. Questa funzione sigmoidale esemplifica la caspasi 3 e 7 rilascio nel terreno di coltura di dosaggio a causa di lisi delle cellule. Morte delle cellule è esaltata dalla deprivazione di siero plus TNFα induzione di segnalazione. Di conseguenza, la molecola anti-TNF (mAb) interagisce con la citochina, inibizione della sua i...

Un protocollo per la determinazione dell'attività anti-apoptotica relativa di un mAb anti-TNFα utilizzando un meccanismo di neutralizzazione con cellule WEHI 164 è presentato qui. Questo protocollo è utile per confrontare la forza di neutralizzazione di molecole diverse con la stessa funzionalità biologica.

Determinazione della potenza relativa di un Anti-TNF anticorpo monoclonale (mAb) di neutralizzante TNF utilizzando un metodo di Bioanalytical In Vitro

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la potenza relativa di molecole anti-TNF-alfa. In questo esempio, confrontiamo due anticorpi monoclonali anti-TNF-alfa per determinare l'efficienza di neutralizzazione di un mAb di riferimento rispetto a un mAb in esame. Questo tutorial illustra passaggi dettagliati per la determinazione della potenza di neutralizzazione del TNF-alfa, che non sono inclusi nella letteratura.Le cellule possono essere sottoposte a stress da diversi fattori ambientali, ad esempio la privazione di nutrienti. Ogni cellula presenta sulla sua superficie diverse proteine chiamate recettori. Alcuni di questi sono specifici per la citochina TNF-alfa.Quando questa molecola interagisce con il suo recettore e viene generato un segnale specifico, questa via di segnalazione, combinata con un fattore di stress ambientale, induce una morte cellulare programmata chiamata apoptosi. Tuttavia, in presenza di una molecola anti-TNF-alfa, che può essere un anticorpo monoclonale, la citochina può essere titolata dall'anticorpo monoclonale, subendo un processo di neutralizzazione che aiuta le cellule a sopravvivere. Pertanto, seguendo una metodologia standardizzata, è possibile misurare l'efficacia di neutralizzazione di una molecola.Questo protocollo viene attualmente eseguito nell'arco di cinque giorni. Nel primo giorno, è necessario preparare le soluzioni per la coltura cellulare. Inoltre, le cellule WEHI 164 verranno scongelate e sottocultivate.Nel secondo e nel terzo giorno, è necessario verificare la confluenza delle cellule. Dopo questo passaggio, le cellule devono essere staccate, contate, la densità cellulare deve essere regolata e, infine, le cellule devono essere nuovamente coltivate. Tutti questi passaggi devono essere eseguiti ogni giorno.Al quarto giorno, la concentrazione dell'anticorpo monoclonale deve essere determinata mediante assorbimento UV e devono essere effettuate le diluizioni dell'anticorpo. Verranno preparate le soluzioni per l'induzione dell'apoptosi. Infine, la densità cellulare delle cellule WEHI 164 deve essere regolata a mezzo milione di cellule per mL.Al quinto giorno, verrà preparata la soluzione substrato per la rilevazione delle cellule apoptotiche e verrà effettuata l'analisi spettrofotometrica. Infine, verrà discussa l'analisi in silico dei risultati. Tutte le soluzioni utilizzate in questo protocollo sono illustrate in questa diapositiva.Nel primo giorno, questa soluzione deve essere preparata in anticipo rispetto all'esecuzione del protocollo, con l'eccezione delle soluzioni per l'induzione dell'apoptosi e del substrato, che devono essere utilizzate immediatamente dopo la ricostituzione. All'inizio di questo protocollo, le cellule congelate devono essere prelevate dal contenitore di azoto liquido. La provetta contenente le cellule WEHI congelate deve essere mantenuta sul ghiaccio fino al momento dell'uso.Mantieni il posto di lavoro pulito e precedentemente sanificato per evitare contaminazioni incrociate prima di eseguire qualsiasi attività. Trasferisci il rack termoregolato all'interno della cappa a flusso laminare e dispensa nove mL di mezzo di coltura preriscaldato in un tubo sterile da 15 millilitri. Con un mL di mezzo di coltura preriscaldato, lava le cellule WEHI 164 mediante pipettaggio delicato su e giù fino a quando le cellule congelate si staccano dal microtubo.Mescolare mediante inversione cinque volte fino a quando le cellule congelate non si siano completamente scongelate. Centrifugare quindi le cellule a 125 g per tre minuti. Rimuovere il soprannatante e disgregare il pellet cellulare.Aggiungere cinque mL di mezzo di coltura preriscaldato al tubo e mescolare la sospensione fino a quando le cellule non saranno completamente risospese. Recuperare le cellule in un’allevola T e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5%. Ogni giorno, prima di staccare e contare le cellule in coltura, è obbligatorio verificare lo stato di salute della coltura al microscopio.Il ricercatore deve verificare lo stato di salute, la vitalità e la densità cellulare per il passaggio. Questa verifica deve essere eseguita anche per il saggio biologico. Innanzitutto, va accertata l'assenza di contaminazioni biologiche, ad esempio batteriche.In secondo luogo, la salute delle cellule può essere verificata mediante la confluenza. Una confluenza superiore al 90% è sufficiente per ottenere buoni risultati. Tuttavia, se le cellule non hanno raggiunto la densità cellulare desiderata, il flask deve essere rimesso nell'incubatrice e si deve attendere finché le cellule non avranno raggiunto la densità e la confluenza desiderate.È necessario rimuovere il mezzo di coltura vecchio dal matraccio T. Lavare le cellule aderenti sulle pareti del matraccio T con cinque mL di soluzione per il lavaggio delle cellule. Prestare attenzione a non rimuovere le cellule aderenti.Mescolare manualmente per eliminare i residui di mezzo di coltura e i detriti cellulari. Questo passaggio deve essere eseguito due volte. Rimuovere le soluzioni di lavaggio residue mediante vuoto e aggiungere tre mL della soluzione di distacco cellulare.Agitare e incubare per tre minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere il mezzo di coltura preriscaldato nel matraccio T per inattivare l'enzima e recuperare le cellule.Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare. Identificare il pellet cellulare e scartare il soprannatante. La rimozione del mezzo di coltura vecchio è fondamentale per la coltivazione di cellule sane.Disaggregare il pellet cellulare e ricostituire le cellule con cinque mL di mezzo di coltura preriscaldato. Trasferire 50 microlitri della sospensione cellulare in una microprovetta. Contare le cellule utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano.Contare le cellule e determinare la vitalità cellulare. Una volta ottenuto il numero di cellule vitali, regolare 15 mL del mezzo di coltura a una densità cellulare di mezzo milione di cellule per mL utilizzando la seguente formula. Trasferire 15 mL della sospensione cellulare aggiustata in un’asta di coltura T e incubare durante la notte.Questo processo complessivo di coltura deve essere ripetuto almeno un’altra volta, per un totale di tre passaggi cellulari, prima di iniziare il saggio di neutralizzazione. Al quarto giorno, misurare la densità ottica della sostanza di riferimento, del campione analitico e del campione di controllo mediante assorbimento UV a 280 nanometri. Eseguire una diluizione iniziale a due milligrammi per mL con il mezzo di coltura del saggio per ciascun campione, in triplicato indipendente.Eseguire un secondo diluizione fino a due microgrammi per mL per ogni campione di mAb. Distribuire 75 microlitri di mezzo di coltura per il saggio nei 60 pozzetti presenti al centro di una micropiastra in polistirene. Aggiungere 230 microlitri di sostanza di riferimento nei pozzetti 2B e 2C.Campioni analitici nei pozzetti 2D e 2E. E infine, il campione di controllo nei pozzetti 2F e 2G. Un campione di controllo è una molecola che ha una potenza relativa nota.Quindi effettuare diluizioni seriali nella micropiastra. Un esempio è mostrato nelle diapositive seguenti. Ricordare di mescolare le soluzioni precedentemente al loro prelievo per il trasferimento nei pozzetti.Questa operazione è fondamentale per il successo di questo protocollo. Regolare in precedenza a mezzo milione di cellule per mL in un distributore. Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare alle 60 pozzette interne della piastra per saggi, partendo dalla colonna due fino all'undicesima.Mescolare la sospensione cellulare precedentemente all'aggiunta del liquido nella micropiastra. Trasferire immediatamente 50 microlitri delle diluizioni di mAb nella piastra per il saggio. Per le corsie accoppiate, dispensare le diluizioni ruotando la micropipetta.Le diluizioni di mAb possono essere distribuite nelle pozzette nell'ordine seguente, con i controlli distribuiti nelle pozzette periferiche. Diluire il TNF-alfa con 500 microlitri di acqua ultrapura. Mescolare con un agitatore vortex a 2200 giri al minuto.Trasferire in una provetta da 15 mL e, infine, diluire a 40 nanogrammi per mL con mezzo di coltura per il saggio. Distribuire 50 microlitri della soluzione di induzione dell'apoptosi nei 60 pozzetti interni del saggio. Distribuire 50 microlitri della soluzione di induzione dell'apoptosi nei 60 pozzetti interni del saggio.Infine, incubare per 16 ore. Il quinto giorno, ricostituire il substrato con questa soluzione tampone seguendo le istruzioni del produttore. Mescolare capovolgendo cinque volte.Distribuire la soluzione del substrato. Aggiungere 50 microlitri di soluzione del substrato in ogni pozzetto del campione nella piastra del saggio. Aggiungere inoltre il substrato ai controlli.Agitare la piastra del saggio in un agitatore vortex a 400 giri/min per tre minuti. Rimuovere la piastra del saggio dal mixer e incubare a temperatura ambiente. Accendere un lettore di piastre-spettrofotometro.Aprire il software SoftMax Pro o qualsiasi programma equivalente. Inserire la micropiastra nello spettrofotometro e regolare i seguenti parametri. Attivare la funzione di luminescenza e impostare il tipo di lettura su Endpoint.Regolare l'Area di Lettura, escludendo le colonne uno e 12. Selezionare il Tipo di Piastra come microplaca standard a 96 pozzetti con fondo trasparente. Modificare il Tempo di Integrazione fino a 1250 millisecondi.Regolare il tempo di agitazione della micropiastra a 10 secondi. Selezionare la pozzetta in cui verranno posizionati la Sostanza di Riferimento, la Sostanza Analitica e il Campione di Controllo. Iniziare la lettura.I risultati di questo saggio sono le curve di risposta espresse in luminescenza rispetto alle scale logaritmiche della concentrazione dell'anticorpo monoclonale. I punti di flesso di queste curve corrispondono alle concentrazioni efficaci, EC50 per ciascun anticorpo monoclonale. C o EC50 è espresso in nanogrammi per mL.Tuttavia, questo valore non ha significato di per sé, se non viene confrontato con il campione di riferimento. Pertanto, la potenza di un campione analitico è espressa in percentuale ed è chiamata potenza relativa. La potenza relativa è la media dei risultati di tre micropiastre indipendenti, ottenuta in base al valore di EC50 di ciascuna piastra.Il confronto tra campioni di controllo e campioni di riferimento aiuta a determinare eventuali deviazioni o bias nel saggio in corso. Il confronto tra il campione di riferimento e un campione analitico aiuta a determinare la potenza relativa. Questa tabella mostra la potenza relativa degli mAb e il relativo intervallo di confidenza al 95%. Inoltre, mostra la deviazione standard relativa di ciascun campione rispetto alla potenza della sostanza di riferimento.Una deviazione standard relativa superiore al 15% non è considerata accettabile. Questa caratterizzazione consente di determinare a priori il comportamento biologico di una molecola in fase di sviluppo, prima di effettuare studi clinici costosi e dispendiosi in termini di tempo. È inoltre utile per il rilascio da lotto a lotto di un prodotto approvato.È nostra determinazione che questi saggi siano utili per stabilire se una molecola presenta un effetto biologico adeguato in relazione al suo meccanismo d'azione. Come parte dei metodi biophysici, questa metodologia è in grado di determinare mediante approcci biologici la potenza e l'efficacia della qualità e degli attributi di un farmaco, mostrando così un significato completo e pieno delle sue funzioni effettori.

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Determinazione della potenza relativa di un Anti-TNF anticorpo monoclonale (mAb) di neutralizzante TNF utilizzando un metodo di Bioanalytical In Vitro

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