Name: Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo lespressione del TCR umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Scopri l'isolamento di singole cellule TCR e la generazione di vettori retrovirali per l'espressione del TCR umano in vitro e in vivo. Questo metodo PCR a due passaggi amplifica le catene alfa e beta con alta efficienza.

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Questo studio è stato finanziato dal JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 pilota PJ e The Robert e Janice McNair Foundation.
Ringraziamo Sandra Pena e Andrene McDonald per il reclutamento dei pazienti, Samuel Blum per l'assistenza tecnica, Dr. George Makedonas per il dono di anticorpi e di controllo utilizzato per l'ottimizzazione di PCR del DNA.

1. identificare la popolazione delle cellule di T di interesse.
 Nota: antigene specifica proliferazione in combinazione con la tintura di divisione cellulare (come Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE) può essere utilizzata per isolare le cellule T basato sulla loro proliferazione in risposta alla stimolazione antigenica. Se a partire da PBMCs, un'espansione di 7 giorni in vitro dovrebbe essere sufficiente per identificare un antigene specifico CFSE popolazione bassa 12.
<ol><li>PBMCs Mix 1:1 con le cellule di alimentatore MHC-abbinato ed etichetta con colorante divisione cellulare di 5 µM CFSE.</li>
	<li>Piastra 2-2,5 x 10 5 cellule per pozzetto in un turno di 96 pozzetti-fondo cultura piastra in 200 µ l 10% FCS completo RPMI media. 
	Nota: RPMI completo contiene 2 mM l-glutammina, piruvato di sodio di 1 mM, 100 µM MEM aminoacidi non essenziali, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 &#8722; 5 unità di 2-mercaptoetanolo, 100ml U &#8722; 1 penicillina e 100 µ g mL &#8722; 1 streptomicina.</li>
	<li>Stimolare le cellule con l'antigene di peptide 25 µM.</li>
	<li>Il quarto giorno della cultura, con attenzione rimuovere e sostituire 100 µ l di media. 
	Nota: Un approccio più ottimale per l'identificazione di cellule T antigene-specifiche è l'uso di peptide-HLA tetrameri 13. Tetramero colorazione consente una valutazione simultanea di specificità antigenica, così come HLA-restrizione.</li>
</ol> 2. Impostare il tipo unicellulare.
<ol><li>Eseguire tutte le procedure in un cappuccio o una area destinata gratuitamente modello amplificato. Aliquotare i reagenti per evitare la contaminazione, pulire tutte le superfici di lavoro e, se fattibile, attrezzature con 10% di candeggina prima dell'installazione PCR. Utilizzare puntali con filtro, RNasi e dnasi gratis reagenti e materiali plastici in tutti la PCR e il vettore di clonazione passi. Chiavi reagenti possono essere trovati nella Tabella materiali. 
	Nota: La reazione di PCR multiplex è altamente sensibile, e bassi livelli di contaminazione possono provocare prodotto amplificato.</li>
	<li>Genera il mix master trascrizione inversa mediante la combinazione di reazione di RT: 10x buffer, 25 X DNTPs, enzima RT U 9, 0,01% Triton-X, inibitore di 0,7 U RNasi e 383 nM di ogni primer RT-TCR (elencati nella tabella 1) in un serbatoio di pipettaggio sterile. Per ogni piastra a 96 pozzetti, make up abbastanza mix master per 10 ulteriori reazioni (Totale 106), per compensare la perdita di liquido durante il pipettaggio. Vedere la tabella 2 per i componenti di reazione e importi per pozzetto.</li>
	Piastra <li>preparare una collezione di PCR 96 pozzetti per cella ordinamento di pipettaggio 6 µ l del mix master trascrizione inversa per pozzetto con una pipetta multicanale. Tenere la piastra su ghiaccio o in un blocco freddo.</li>
	<li>Marcare le cellule con anticorpi alla cella marcatori di superficie (ad esempio CD4 e CD3, o CD8 e CD3, ciascuna a 2 µ g/mL, in combinazione con la divisione cellulare tintura o colorazione tetramero).</li>
	<li>Cellule di T di sorta in uno delle cellule per pozzetto, saltando la dodicesima fila, che servirà come controllo negativo. 
	Nota: L'efficienza dell'ordinamento dipenderà precisa raccolta piatto allineamento all'interno il portatarga, nonché a mantenere le cellule e piastre a bassa temperatura prima reazione di cDNA. Piastre di raccolta dovrebbero essere tenuti su ghiaccio in ogni momento, tranne durante l'ordinamento, quando sono fissati all'interno della placca di raffreddamento. Non tutti i selezionatori sono dotate di un portatarga regolamentato di temperatura; Tuttavia, si raccomanda vivamente l'uso di uno. Poiché l'ordinamento richiede generalmente circa 10-15 min per piastra, c'è un potenziale aumento di degradazione del RNA se la piastra non viene mantenuta a bassa temperatura.</li>
	<li>Come controllo positivo, aggiungere un numero maggiore di cellule (100) manualmente con una pipetta a uno dei pozzi in questa fase. In alternativa, precedentemente isolato RNA da cellule in pool può essere utilizzato come controllo positivo alle 10 ng per pozzetto. 
	Nota: Pipettare controllo purificato RNA con precisione e cura al fine di evitare la contaminazione incrociata di altri pozzi e risultati falsi positivi.</li>
	<li>Sigillare la piastra con la pellicola adesiva e spin giù a 1000 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Immediatamente trascrivere RNA in cDNA incubando la piastra a 25 ° C per 10 min, 37 ° C per 45 min e 85 ° C per 10 min. 
	Nota: Per garantire la reazione di PCR efficiente, è consigliabile che la prima reazione di PCR viene eseguita il giorno stesso. In alternativa, le piastre trascritte possono essere conservate a-80 ° C per fino a 2 mesi.</li>
</ol> 3. Eseguire nidificati multiplex PCR Nota: preparare tutti i master mix in un ambiente pulito privo di modello per evitare la contaminazione.
Primer <ol><li>ricostituire ogni regione variabile 100 µM con DNasi e RNasi free H 2 O. Poi, combinate 20 µ l di ciascuno dei 44 primer per generare la piscina di primer V-alfa. Per generare il V-beta piscina primer combinare 20 µ l di ciascuno dei 40 V-beta primer plus 80 µ l di DNasi e RNasi free H 2 O. Primer sequenze sono elencate nella tabella 1. Una volta riuniti, la concentrazione di ogni primer nel mix è 2,3 µM.</li>
	<li>Ricostituire i primer regione costante alla soluzione stock di 100 µM con DNasi e RNAsi libera H 2 O. Diluire i primer regione costante a 10 µM lavoro soluzione e aliquota per l'uso.</li>
	<li>Preparare due mix master separati per l'amplificazione di TCR-alfa e beta-TCR. Generare i master mix combinando 5 X 80 µM dNTPs, 3% DMSO, 2 µM primer pool di buffer, (concentrazione finale di 46 nM per ciascun primer), 200 nM TCR-costante regione reverse primer, 1 U DNA polimerasi e DNasi e RNasi free H 2 O (tabella 2 
	Nota: I calcoli si basano sul volume di PCR finale di 25 µ l per pozzetto, dove il mix PCR master di 22,5 µ l è combinato con modello di cDNA 2,5 µ l.</li>
	<li>Tenere la piastra con cDNA su ghiaccio o in un blocco di freddo. Utilizzare un multicanale per 22,5 µ l di reazione di TCR-beta in una nuova piastra per PCR a 96 pozzetti. Quindi utilizzare un multicanale per trasferire 2,5 µ l di cDNA nella piastra PCR.</li>
	<li>Utilizzare un multicanale per 22,5 µ l di reazione di TCR-alfa direttamente nella piastra contenente il resto del cDNA.</li>
	<li>Sigillare le piastre con adesivo, delicatamente vortice e spin giù a 1000 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eseguire la reazione di PCR multiplex con i seguenti cicli: 5 min a 95 ° C seguita da 34 cicli di 20 s a 95 ° C, 30 s a 54 ° C e 1 min a 72 ° C, seguita da 7 min a 72 ° C.</li>
	<li>Portare fuori la reazione di PCR annidata in un volume finale di 25 µ l, utilizzando 2,5 µ l della miscela PCR multiplex come modello.
	<ol><li>Ricostituire i primers interni ed adattatore a 100 µM con DNasi e RNasi free H 2 O. fare 10 µM aliquote per lo stock di lavoro.</li>
		<li>Preparare due mix master separati per TCR-alfa e beta-TCR amplflussi, la verifica. Mix 5 X 200 nM inversa nidificati primer, primer di adattatore avanti 200 nM X DNTP, 3% DMSO, 25, buffer, 1 U DNA polimerasi e DNA polimerasi e privo di nucleasi H 2 O per un volume finale di 22,5 µ l (tabella 2). Per ogni piastra a 96 pozzetti, make up abbastanza mix master per 10 ulteriori reazioni (Totale 106), per compensare la perdita di liquido durante il pipettaggio. 
		Nota: L'uso di reazione di PCR secondo il 5 X PCR tampone contenente caricamento colorante per facilitare il caricamento del gel dell'agarosi.</li>
		<li>Tramite un multicanale, dispensare i master mix per le reazioni di TCR-alfa e beta-TCR a 22,5 µ l per pozzetto in due nuove piastre PCR a 96 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere il modello di reazione di PCR multiplex a 2,5 µ l per pozzetto. 
		Nota: La prima reazione di PCR rimanente dovrebbe essere sigillata e conservata a-20 ° C per servire come fonte di modelli aggiuntivi, se si rende necessario (Vedi passo Nota 4.3).</li>
		<li>Sigillare le piastre, delicatamente vortice e spin giù a 1000 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Eseguire la reazione di PCR annidata con i seguenti cicli: 5 min a 95 ° C seguita da 34 cicli di 20 s a 95 ° C, 30 s a 56 ° C e 1 min a 72 ° C, seguita da 7 min a 72 ° C.</li>
		<li>Eseguire 5 µ l di reazione finale fuori su un 1% di agarosio gel contenente bromuro di etidio (compresi i pozzetti di controllo positivi e negativi). 
		Nota: La band prevista deve essere eseguito con dimensioni di circa 500 bp. Una reazione di esempio è illustrata nella Figura 2.</li>
		<li>Purificare il resto della seconda reazione (20 µ l) utilizzando un formato a 96 pozzetti kit di purificazione di PCR, eluire con 15 µ l di 70 ° C H 2 O per pozzetto ed eseguire Sanger sequenziamento. Utilizzare apposito TCR-alfa o TCR-beta adattatore forward primer di sequenziamento (tabella 1). 
		Nota: Sequenze possono essere analizzate con il software di Immunogenetica disponibile online.</li>
	</ol></li></ol> 4. Sub-clonazione catene PCR di alfa e beta.
 Nota: lo stagno di forward primer utilizzati nella prima reazione e gli iniettori d'inversione nella seconda reazione di PCR è usato per incorporare siti di restrizione. Di conseguenza, i prodotti PCR catena alfa e beta ottenuti sono pronti per essere in sequenza Sub-clonato nel vettore retrovirale modello ( Figura 1).
Prodotti <ol><li>Digest la PCR purificato dalla beta annidati di reazione con BstbI e MfeI (tabella 3). 
	Nota: Non superare 5 µ g inserto.</li>
	<li>In parallelo, digerire il template vettoriale con BstbI e MfeI (tabella 3). Utilizzare 1-2 µ g di template vettoriale per TCR. Eseguire il vettore digerito su un gel di agarosio e isolare la band più grande (~ 7500 bp). Purificare il vettore con un gel kit di purificazione di DNA. 
	Nota: Durante il digest di enzima di restrizione, area variabile del modello murino TCR-beta viene rimosso, consentendo l'aggiunta della regione variabile umana TCR-beta.</li>
	<li>Purificare i prodotti PCR digeriti con un kit di purificazione di PCR. 
	Nota: Verificare la capacità di purificazione del DNA delle colonne incluse nel kit; Se necessario, utilizzare più colonne. L'importo minimo di un inserto purificato necessario per una reazione di legatura successo è 50 ng ad una concentrazione minima di 10 ng / µ l. Se la quantità di inserto purificata non è sufficiente per una legatura di successo, la seconda reazione di PCR può essere ripetuta.</li>
	<li>Trattare il template vettoriale con 10 enzima U CIP per 1h a 37 ° C per evitare auto-legatura, seguita da inattivazione termica per 10 min a 75 ° C. purificare il DNA con un kit di purificazione di PCR (tabella 3).</li>
	<li>Legano TCR-beta inserire e vettoriale utilizzando ligasi del DNA in un volume totale di 20 µ l in eccesso molare 6 dell'inserto per 30 min a temperatura ambiente. 
	Nota: In totale, la reazione di legatura dovrebbe contenere circa 150 ng di DNA (tabella 3).</li>
	<li>Per le trasformazioni, 8 µ l della reazione di legatura con 80 µ l di cellule di e. coli DH5α chimicamente competenti (Tabella materiali) e incubare in ghiaccio per 30 min. shock termico a 42 ° C per 45 s. aggiungere 500 µ l Super Brodo di ottimo con medie di soppressione (S.O.C) dei cataboliti e agitare per 1,5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Piastra fuori 250 µ l di coltura batterica su un ampicillina contenente piastra di agar Lisogenesi brodo (LB). Incubare la piastra durante la notte (~ 16 h) a 37 ° C.</li>
	<li>Il giorno successivo scegli colonie batteriche e loro crescono in mezzo mL 3 LB contenente ampicillina durante la notte. Isolare il DNA del plasmide utilizzando kit di purificazione di DNA plasmidico.</li>
	<li>Confermare l'esito positivo inserimento della catena beta da un test su piccola scala-digest con gli enzimi di restrizione BstbI e MfeI. In un volume di reazione totale 12 µ l, unire 200-500 µ g plasmide DNA, 0,25 µ l di ogni enzima e buffer di 10 X enzima (tabella 3). Eseguire la reazione fuori su un gel di agarosio all'1% contenente etidio bromuro per confermare la dimensione della band inserto (~ 500 bp).</li>
	<li>Dopo aver confermato la presenza dell'inserto, sequenza sezione TCR-beta del vettore utilizzando il primer reverse IRES (tabella 1).</li>
	<li>In seguito alla conferma di sequenza dell'inserto TCR-beta, eseguire un processo simile per l'inserimento della regione variabile alfa. Digerire i prodotti di PCR purificati dalla reazione alfa nidificata e l'inserimento di TCR-beta appena generato contenente vettoriale, con SnaBI e Silvio. 
	Nota: Durante il digest di enzima di restrizione, area variabile del modello murino TCR-alfa viene rimosso, consentendo l'aggiunta della regione variabile TCR-alfa umana.</li>
	<li>Legano alfa inserisce in vettori TCR codifica regione variabile corrispondente beta utilizzando ligasi del DNA in un volume totale di 20 µ l in eccesso molare 6 dell'inserto per 30 min a temperatura ambiente. 
	Nota: In totale, la reazione di legatura dovrebbe contenere circa 150 ng di DNA (tabella 3).</li>
	<li>Per le trasformazioni, 8 µ l della reazione di legatura con 80 µ l di cellule di e. coli DH5α chimicamente competenti (Tabella materiali) e incubare in ghiaccio per 30 min. shock termico a 42 ° C per 45 s. aggiungere 500 µ l S.O.C medio e agitare per 1,5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Piastra fuori 250 µ l di coltura batterica su un ampicillina contenente piastra di agar Lisogenesi brodo (LB). Incubare la piastra durante la notte (~ 16 h) a 37 ° C.</li>
	<li>Il giorno successivo scegli colonie batteriche e loro crescono in mezzo mL 3 LB contenente ampicillina durante la notte. Isolare il DNA del plasmide utilizzando kit di purificazione di DNA plasmidico.</li>
	<li>Confermare l'esito positivo inserimento della catena alfa da un test su piccola scala-digest con gli enzimi di restrizione SnaBI e Silvio. In un volume di reazione totale 12 µ l unire 200-500 µ g plasmide DNA, 0,25 µ l di ogni enzima e buffer di 10 x enzima (tabella 3). Eseguire la reazione fuori su un gel di agarosio all'1% contenente etidio bromuro per confermare la dimensione della band inserto (~ 500 bp).</li>
	<li>Dopo aver confermato la presenza dell'inserto, sequenza la sezione di TCR-alfa del vettore utilizzando il MSCV2-forward primer (tabella 1).</li>
	<li>Una volta che la sequenza di alfa catena viene convalidata, verificare il completo inserimento TCR di sequenziamento con TCR-beta-reverse e IRES-reverse primer (tabella 1).</li>
</ol> 5. Verificare l'espressione di superficie delle cellule TCR e la specificità.
 Nota: HEK293T cellule sono utilizzate per testare successo TCR catena paring e cellule superficiali espressione ( Figura 3A) 8. Peptide-MHC tetramero macchiatura può essere eseguita anche su cellule transfected HEK293T per testare per la ritenzione dell'isolamento di specificità antigenica post TCR gene ( Figura 3B).
<ol><li>Piastra HEK293T cellule in piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti a 1 x 10 5 cellule per pozzetto in 1 mL completo DMEM media contenente 5% FCS e cultura durante la notte a 37 ° C. piastra fuori abbastanza cellule per hanno designato pozzetti separati per ogni nuovo TCR , vettore di controllo modello TCR, CD3 vettoriale solo, controllo vettoriale TCR unico e un non-transfettate bene. 
	Nota: Transfezione con un modello del mouse completamente TCR vector (mTCR-pMIA) in combinazione con mCD3εγδζ-pMIG vettore, vettore mTCR-pMIA da solo, e mCD3εγδζ-pMIG vettoriale da solo sono utilizzati come controlli positivi e negativi. 
	Nota: DMEM completo contiene 2 mM L-Glutammina, 1 mM sodio piruvato, 100 µM Non essenziali aminoacidi, 5 mM HEPES buffer, 5.5 x 10 -5 unità di 2-mercaptoetanolo, 100 U/ml di penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Il giorno seguente, le cellule con 1 µ g chimerico h/mTCR-pMIA vettoriale, 1 µ g del mouse CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vettore e un reagente di transfezione liposoma-base seguendo le istruzioni del produttore del transfect.</li>
	<li>Per ogni TCR, aggiungere 6 µ l di reagente di transfezione di 100 µ l temperatura, DMEM privo di siero. Brevemente vortice e incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>In separata 1,5 mL tubi combinano 1 µ g di TCR-pMIA vettoriale con 1 µ g del mouse CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vettore o 1 µ g di ogni vettore separato per i controlli.</li>
	<li>Dropwise, aggiungere la soluzione di reagente/DMEM trasfezione le provette contenenti il vettore di DNA. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Dropwise, aggiungere la soluzione di reagente/DMEM/DNA di transfezione delle cellule HEK293T. Picchiettare delicatamente la piastra per mescolare. Incubare a 37 ° C per 24 h.</li>
	<li>Dopo 24 h sostituire i media e mantenere le cellule in coltura per altre 24 h.</li>
	<li>Rimuovere cellule dalla piastra pipettando vigoroso e macchiare le cellule con anti-anticorpo CD3 topo (2,5 µ g/mL) per verificare l'espressione di superficie del chimerico-TCR tramite flusso cytometry.</li>
	<li>Al fine di confrontare l'espressione CD3 tra celle transfected a un livello analogo, cancello l'analisi sulle cellule che esprimono un simile livello elevato di molecole fluorescenti reporter (GFP per complesso CD3 e ametrino per vettore di espressione TCR). In modo ottimale, l'analisi dovrebbe essere recintato su GFP + ametrino + cellule entro 10 4 10 5 intensità fluorescente ( Figura 3A). 
	Nota: Il livello di espressione di CD3 in cellule trasfettate con il costrutto chimerico dovrebbe essere paragonabile al vettore di controllo del mouse (modello originale) ( Figura 3A). I vettori retrovirali TCR generati sono compatibili con sistemi di espressione in vivo come descritto in precedenza 4.</li>
</ol>

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<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice%3A+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li>
<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nel protocollo attuale, descriviamo un metodo efficiente per singola cella TCR amplificazione e successiva Sub-clonazione di accoppiati catene alfa e beta TCR in un vettore retrovirale espressione di modello. Anche se, sono stati sviluppati diversi protocolli di PCR di singola cellula, nessuno finora sono stati compatibili con immediata Sub-clonazione in un vettore di espressione. Nella maggior parte dei casi, una sequenza parziale che comprende le regioni CDR3 altamente variabile è amplificata, con abbastanza sequenza d...

T cell receptor (TCR) detta decisione di destino delle cellule T durante lo sviluppo, stato stazionario/omeostasi e stimolazione antigenica in periferia1,2,3. Recente espansione delle tecnologie di sequenziamento profondo ha scoperto una diversità TCR precedentemente poco apprezzata all'interno di risposte specifiche delle cellule di T di antigene. Diversità TCR suggerisce un potenziale per le risposte delle cellule T funzionalmente ampio. Al fine di integrare l'analisi di repertorio TCR sequenza con saggi funzionali TCR, gli approcci di sequenziamento dovrebbero essere progettati per essere compatibile con sistemi sperimentali e in vivo modelli utilizzati per la successiva analisi funzionale di select TCR. Abbiamo sviluppato un approccio efficace per l'isolamento di sequenza umana del TCR e razionalizzato Sub-clonazione in un vettore di modello TCR chimerico umano/mouse compatibile con espressione TCR in topi umanizzati HLA4. Isolamento delle relative catene alfa e beta del TCR heterodimeric richiede l'amplificazione di PCR di entrambe le catene da una singola cellula. Anche se, diversi protocolli clonazione di singole cellule TCR sono stati sviluppati e utilizzati, nessuno finora sono stati facilmente compatibile con alto-rendimento aerodinamico clonazione diretta di sconosciuto Vα/Vβ TCR in vettori retrovirali necessari per ri-espressione in vivo 4,5,6,7. Precedenti studi hanno utilizzato due approcci principali, sia per amplificare selettivamente una porzione limitata del TCR sufficiente per estrapolare la sequenza, o per amplificare l'intero TCR sequenza4,5,6 , 7. analisi funzionale a valle di TCR sequenze ottenute tramite il primo approccio richiede costose in silico un costruzione assemblaggio e de novo del TCR. Mentre il secondo approccio prevede la sequenza completa di TCR, regione costante umana non è compatibile con l'espressione in vivo del TCR clonato in modelli murini. Il nostro approccio è specificamente progettato per essere compatibile con in vivo analisi funzionale di TCR in modelli murini. Abbiamo sviluppato un'efficiente e snella singola cella protocollo PCR che consente per sub-clonazione diretta di frammenti PCR nel vettore di espressione di modello.
Il nostro approccio utilizza un'altamente sensibile reazione di PCR multiplex-nidificati che viene eseguita in due fasi. Nella prima reazione multiplex passo una piscina di 40 primer specifici per tutte le catene di V-beta e una piscina di 44 primer specifici per tutte le catene di V-alfa sono utilizzate per amplificare il TCR-alfa o TCR-beta senza la preventiva conoscenza della sequenza (tabella 1). Il primer forward ha una sequenza di adattatore, che è incorporata in 5' del prodotto della PCR. Il primer reverse si basa sulla regione costante del TCR. Abbiamo identificato siti di restrizione unici che sono assente dal variabile umana o regioni della giunzione TCR e ha incluso tali in nuova e ridisegnata, TCRα e TCRβ primer (Figura 1). Nella seconda reazione nidificata, un primer specifico per la sequenza di adattatore e un primer reverse nidificato all'interno della regione costante sono utilizzati per amplificare ulteriormente le catene TCR con specificità aumentata (tabella 1, Figura 1). Dopo isolamento di singole cellule, due tondi di PCR (reazione prima con un pool di primer sia Vα e Vβ e in secondo luogo con gli iniettori adattatore) portano a un prodotto PCR che può direttamente essere sub-clonato nel vettore retrovirale modello. Il costrutto TCR finale codificherà, in una cornice unica lettura aperta (ORF), umane regioni variabili combinate con regioni costante del mouse collegate di sequenza della proteina 'self-che fende', P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. La sequenza P2A è stata utilizzata nei sistemi multipli ed è stato ampiamente testata in modo specifico per l'espressione del TCR8,9,10,11. Anche se, dopo traduzione la maggior parte del P2A sequenza rimane attaccata al C-terminale della catena alfa collegato da un linker flessibile, mentre la sequenza di segnale catena beta ha un'ulteriore prolina, questa modifica non ha alcun effetto negativo sulla funzione TCR. La regione costante del mouse viene utilizzata nel costrutto anziché umani per evitare potenziali interazioni alterate con componenti di segnalazione a valle quando ri-espressa in cellule di topo. Il singolo ORF si tradurrà in espressione separata stechiometrico di alfa e beta catene9,11. Il protocollo attuale è basato su reagenti e approcci che sono ampiamente disponibili ed è stato progettato per essere eseguita in modo snello ed efficiente. Anche se abbiamo usato questa tecnica in particolare test TCR da cellule T autoreattive implicate nel diabete autoimmune, prevediamo che questo protocollo può essere ampiamente applicabile per l'identificazione e la valutazione funzionale di umano TCR specifico per epitopi autoimmuni, cancro epitopi o risposte a patogeni e vaccini.

<table><tbody><tr><td>CFSE&nbsp;</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-umano CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-umano CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-topo CD3 AF647</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>100322</td><td>2,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Inibitore dell'RNAsi ricombinante biotech grd 2,5KU&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Kit RT cDNA ad alta capacità&nbsp;</td><td>Ingrozzo&nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (enzima RT)&nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Acqua senza nucleasi 1000mL</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polimerasi 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 pozzetti Piastra PCR a mezza gonna</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Pellicola adesiva trasparente&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>4306311</tr><tr><td>Agarosio UltraPuro&nbsp;</td><td>Ingrozzo&nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (inserire) 30 U (vettore)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (inserire) 80 U (vettore)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (inserire) 80 U (vettoriale)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (inserire) 80 U (vettore)</td></tr><tr><td>Fosfatasi intestinale di vitello (CIP)</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Ligasi rapida&nbsp;</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td>Sistemi di purificazione del DNA <td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus sistemi di purificazione del DNA midipreps&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>Kit di pulizia e concentratore del DNA-25</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 Kit di pulizia e concentratore-5</td><td>DNA Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Efficienza di subclonaggio DH5a Cellule competenti&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18265017 Reagente Transit LT-1 1mL (reagente di trasfezione)</td><td>Mirus&nbsp;</td><td></td><td></td>MIR2300</tr><tr><td>BD FACS Aria II (selezionatore)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (citometro a flusso)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

razionalizzato isolamento di singole cellule tcr e generazione di vettori retrovirali per in vitro e in vivo l'espressione del tcr umano

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Anche se, sono stati sviluppati diversi metodi per il sequenziamento di catene alfa e beta di accoppiati delle cellule T a ricevitore (TCR) da singole cellule di T, nessuno finora sono stati favorevoli a valle in vivo analisi funzionale di TCR eterodimeri. Abbiamo sviluppato un protocollo migliorato basato su una PCR multiplex-annidato in due fasi, che si traduce in un prodotto PCR che si estende su intere regioni variabili di un catene alfa e beta TCR di umane. Identificando i siti di restrizione unici e incorporare gli iniettori PCR, abbiamo fatto il prodotto PCR compatibile con Sub-clonazione diretta nel vettore retrovirale modello. Il costrutto retrovirale risultante consente di codificare un chimerico umano/mouse TCR con un dominio intracellulare del mouse, che è funzionale in cellule di topo o in modelli di topo in vivo . Nel complesso, il protocollo descritto qui combina umana singola cella accoppiato TCR alfa e beta catena identificazione con generazione ottimizzata di vettori retrovirali facilmente adattabile per espressione TCR in vitro e in vivo . Il video e il materiale di accompagnamento sono progettati per fornire una descrizione altamente dettagliata della singola cella PCR, cosicché i passaggi critici possono essere seguite e potenziali insidie evitati. Inoltre, forniamo una descrizione dettagliata dei passaggi clonazione necessari per generare il vettore di espressione. Una volta imparato, l'intera procedura da singola cella ordinamento all'espressione TCR potrebbe essere eseguita in un breve periodo di due settimane.

L'efficienza della reazione di PCR multiplex-annidata è selezionata nel passaggio 3.2.7 (Figura 2) eseguendo fuori 5 µ l di seconda reazione su un gel di agarosio. In media dovrebbe essere circa 80%, mentre l'efficienza della reazione TCR-alfa è di norma inferiore al 50% l'efficienza di amplificazione di TCR-beta4. Solo catene accoppiate TCR-alfa e beta-TCR possono essere utilizzate per l'espressione TCR; Tuttavia, tutti i prodotti di ...

I combines di protocollo corrente singola cella coppia umana TCR alfa e beta catena sequenziamento con snella generazione di vettori retrovirali compatibile con espressione TCR in vitro e in vivo .

Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo l'espressione del TCR umano

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come il repertorio TCR alfa e beta della popolazione specifica di un antigene, nonché la funzionalità in vivo dei TCR umani. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'efficienza relativamente elevata della reazione PCR e la sua compatibilità con il successivo clonaggio TCR. Questo protocollo utilizza una PCR in due fasi per amplificare le catene alfa e beta del TCR da una singola cellula senza una conoscenza preliminare della sequenza TCR.La prima PCR è una reazione multiplex che utilizza un pool di primer specifici per regione variabile alfa o beta in combinazione con un primer specifico per la regione costante. La seconda PCR è una reazione nidificata che si innesca a partire dalla sequenza adattatore incorporata all'estremità a cinque numeri primi del prodotto PCR, nonché da una sequenza interna a regione costante. Questi primer incorporano anche siti di restrizione unici nelle cinque estremità principali e nelle tre estremità principali del prodotto PCR per facilitare la successiva clonazione.Una volta clonata nel vettore modello, la sequenza TCR codificata è chimerica, costituita da regioni variabili umane con regioni costanti speculari. Il costrutto chimerico del TCR consente l'interazione tra il TCR e il complesso di segnalazione CD3 specchiante, rendendo questo protocollo di clonazione TCR compatibile con i successivi studi funzionali in linee cellulari specchianti e in modelli murini umanizzati. Impostazione per lo smistamento di singole cellule preparando i reagenti di trascrizione inversa in un'area pulita e priva di modellini.In generale, le persone che non conoscono il metodo PCR a cellula singola avranno difficoltà a causa dei bassi livelli di modello. D'altra parte, la sensibilità della PCR nidificata multiplex è sensibile a bassi livelli di contaminazione del modello. Pertanto, è necessario pulire accuratamente le aree in cui si imposteranno le reazioni PCR.In questa reazione viene utilizzata una miscela di tre primer inversi specifici per la regione costante delle catene alfa e beta. Preparare la master-mix di trascrizione inversa combinando i reagenti in un serbatoio di pipettaggio. Per tenere conto dell'errore di pipettaggio, preparare una miscela di reazione sufficiente per dieci pozzetti in più.Utilizzare un multicanale per pipettare sei microlitri per pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti. Coprire il piatto senza stringere con un sigillo e mantenere il piatto sul ghiaccio. Preparare le cellule T per lo smistamento di singole cellule colorando le cellule con anticorpi contro i marcatori della superficie cellulare.Ordina le cellule T in una sola cella per pozzetto lasciando vuote le dodici righe, che serviranno come controllo negativo. Sigillare la piastra con pellicola adesiva e centrifugare a 1000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Eseguire immediatamente la reazione di trascrizione inversa.Se possibile, eseguire la prima reazione PCR lo stesso giorno. Per eseguire la reazione multiplex, miscelare separatamente le miscele master V alfa e V beta PCR nei serbatoi di pipettaggio. Conservare la piastra con cDNA su ghiaccio o su un blocco freddo.Trasferire 22,5 microlitri di reazione beta TCR in una nuova piastra PCR da 96 pozzetti. Quindi utilizzare un multicanale per trasferire 2,5 microlitri di cDNA nella piastra PCR. Utilizzare un multicanale per pipettare 22,5 microlitri di reazione TCR alfa direttamente nella piastra contenente il resto del cDNA.Sigillare le piastre con l'adesivo, vorticare delicatamente e girare brevemente verso il basso. Eseguire la prima reazione PCR. Le piastre possono essere conservate a 20 gradi Celsius.Il giorno successivo, preparare le seconde reazioni PCR annidate. Utilizzando un multicanale, pipettare le miscele master per le reazioni TCR alfa e TCR beta a 22,5 microlitri per pozzetto in due nuove piastre PCR a 96 pozzetti. Aggiungere il modello di reazione PCR multiplex a 2,5 microlitri per pozzetto.Sigillare le piastre, vorticare delicatamente e girare brevemente verso il basso. La prima reazione PCR rimanente deve essere sigillata e conservata a 20 gradi Celsius per fungere da fonte di modello di backup. Eseguire la seconda reazione PCR.Al termine della seconda reazione di PCR annidata, esaurire cinque microlitri di reazione su un gel di agarosio all'1%. Includi i pozzetti di controllo positivo e negativo. La banda prevista dovrebbe avere una dimensione di circa 500 coppie di basi.Purificare il resto della seconda reazione, venti microlitri, utilizzando un kit di purificazione PCR in formato 96 pozzetti ed eseguire il sequenziamento Sanger. Le sequenze TCR ottenute possono essere analizzate utilizzando il software immunogenetico disponibile online. Le informazioni sulla sequenza possono essere utilizzate per valutare il repertorio e la clonalità della popolazione di cellule T.Le sequenze alfa e beta del TCR accoppiate possono essere utilizzate in ulteriori analisi funzionali. Eseguire legature consecutive di TCR beta e TCR alpha nel vettore modello. Il TCR beta e il TCR alfa modello vengono sostituiti con le catene amplificate PCR.Nella prima legatura, il TCR beta stampo viene sostituito con la catena beta amplificata PCR. Dopo che l'inserimento riuscito del TCR beta è stato verificato mediante il sequenziamento test-digest, sostituire il modello TCR alfa con la catena alfa amplificata dalla PCR. HEK293T cellule vengono utilizzate per testare il successo dell'accoppiamento della catena TCR e l'espressione della superficie cellulare.HEK293T cellule sono co-trasfettate con il vettore TCR marcato dal reporter fluorescente ametrino e con un vettore codificante il complesso CD3 marcato con GFP. L'espressione superficiale del TCR chimerico è verificata mediante citometria a flusso colorando le cellule con anticorpo CD3 anti-topo. Il livello di espressione di CD3 di superficie nelle cellule trasfettate con il costrutto TCR chimerico dovrebbe essere paragonabile a quello di quelle trasfettate con il vettore modello di controllo completamente speculare.In sintesi, abbiamo descritto un efficiente protocollo basato sulla PCR per l'identificazione e il clonaggio di catene TCR accoppiate da singole cellule. Prevediamo che questo sarà uno strumento prezioso per studiare le risposte delle cellule T umane nell'autoimmunità, nella sorveglianza dei tumori e nell'eliminazione dei patogeni. Il vantaggio principale del protocollo PCR qui descritto è la sua compatibilità con i successivi studi in vitro e in vivo.

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Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo lespressione del TCR umano (Video) | JoVE Journal

Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo l'espressione del TCR umano

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