Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo l'espressione del TCR umano

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come il repertorio TCR alfa e beta della popolazione specifica di un antigene, nonché la funzionalità in vivo dei TCR umani. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'efficienza relativamente elevata della reazione PCR e la sua compatibilità con il successivo clonaggio TCR. Questo protocollo utilizza una PCR in due fasi per amplificare le catene alfa e beta del TCR da una singola cellula senza una conoscenza preliminare della sequenza TCR.

La prima PCR è una reazione multiplex che utilizza un pool di primer specifici per regione variabile alfa o beta in combinazione con un primer specifico per la regione costante. La seconda PCR è una reazione nidificata che si innesca a partire dalla sequenza adattatore incorporata all'estremità a cinque numeri primi del prodotto PCR, nonché da una sequenza interna a regione costante. Questi primer incorporano anche siti di restrizione unici nelle cinque estremità principali e nelle tre estremità principali del prodotto PCR per facilitare la successiva clonazione.

Una volta clonata nel vettore modello, la sequenza TCR codificata è chimerica, costituita da regioni variabili umane con regioni costanti speculari. Il costrutto chimerico del TCR consente l'interazione tra il TCR e il complesso di segnalazione CD3 specchiante, rendendo questo protocollo di clonazione TCR compatibile con i successivi studi funzionali in linee cellulari specchianti e in modelli murini umanizzati. Impostazione per lo smistamento di singole cellule preparando i reagenti di trascrizione inversa in un'area pulita e priva di modellini.

In generale, le persone che non conoscono il metodo PCR a cellula singola avranno difficoltà a causa dei bassi livelli di modello. D'altra parte, la sensibilità della PCR nidificata multiplex è sensibile a bassi livelli di contaminazione del modello. Pertanto, è necessario pulire accuratamente le aree in cui si imposteranno le reazioni PCR.

In questa reazione viene utilizzata una miscela di tre primer inversi specifici per la regione costante delle catene alfa e beta. Preparare la master-mix di trascrizione inversa combinando i reagenti in un serbatoio di pipettaggio. Per tenere conto dell'errore di pipettaggio, preparare una miscela di reazione sufficiente per dieci pozzetti in più.

Utilizzare un multicanale per pipettare sei microlitri per pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti. Coprire il piatto senza stringere con un sigillo e mantenere il piatto sul ghiaccio. Preparare le cellule T per lo smistamento di singole cellule colorando le cellule con anticorpi contro i marcatori della superficie cellulare.

Ordina le cellule T in una sola cella per pozzetto lasciando vuote le dodici righe, che serviranno come controllo negativo. Sigillare la piastra con pellicola adesiva e centrifugare a 1000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Eseguire immediatamente la reazione di trascrizione inversa.

Se possibile, eseguire la prima reazione PCR lo stesso giorno. Per eseguire la reazione multiplex, miscelare separatamente le miscele master V alfa e V beta PCR nei serbatoi di pipettaggio. Conservare la piastra con cDNA su ghiaccio o su un blocco freddo.

Trasferire 22,5 microlitri di reazione beta TCR in una nuova piastra PCR da 96 pozzetti. Quindi utilizzare un multicanale per trasferire 2,5 microlitri di cDNA nella piastra PCR. Utilizzare un multicanale per pipettare 22,5 microlitri di reazione TCR alfa direttamente nella piastra contenente il resto del cDNA.

Sigillare le piastre con l'adesivo, vorticare delicatamente e girare brevemente verso il basso. Eseguire la prima reazione PCR. Le piastre possono essere conservate a 20 gradi Celsius.

Il giorno successivo, preparare le seconde reazioni PCR annidate. Utilizzando un multicanale, pipettare le miscele master per le reazioni TCR alfa e TCR beta a 22,5 microlitri per pozzetto in due nuove piastre PCR a 96 pozzetti. Aggiungere il modello di reazione PCR multiplex a 2,5 microlitri per pozzetto.

Sigillare le piastre, vorticare delicatamente e girare brevemente verso il basso. La prima reazione PCR rimanente deve essere sigillata e conservata a 20 gradi Celsius per fungere da fonte di modello di backup. Eseguire la seconda reazione PCR.

Al termine della seconda reazione di PCR annidata, esaurire cinque microlitri di reazione su un gel di agarosio all'1%. Includi i pozzetti di controllo positivo e negativo. La banda prevista dovrebbe avere una dimensione di circa 500 coppie di basi.

Purificare il resto della seconda reazione, venti microlitri, utilizzando un kit di purificazione PCR in formato 96 pozzetti ed eseguire il sequenziamento Sanger. Le sequenze TCR ottenute possono essere analizzate utilizzando il software immunogenetico disponibile online. Le informazioni sulla sequenza possono essere utilizzate per valutare il repertorio e la clonalità della popolazione di cellule T.

Le sequenze alfa e beta del TCR accoppiate possono essere utilizzate in ulteriori analisi funzionali. Eseguire legature consecutive di TCR beta e TCR alpha nel vettore modello. Il TCR beta e il TCR alfa modello vengono sostituiti con le catene amplificate PCR.

Nella prima legatura, il TCR beta stampo viene sostituito con la catena beta amplificata PCR. Dopo che l'inserimento riuscito del TCR beta è stato verificato mediante il sequenziamento test-digest, sostituire il modello TCR alfa con la catena alfa amplificata dalla PCR. HEK293T cellule vengono utilizzate per testare il successo dell'accoppiamento della catena TCR e l'espressione della superficie cellulare.

HEK293T cellule sono co-trasfettate con il vettore TCR marcato dal reporter fluorescente ametrino e con un vettore codificante il complesso CD3 marcato con GFP. L'espressione superficiale del TCR chimerico è verificata mediante citometria a flusso colorando le cellule con anticorpo CD3 anti-topo. Il livello di espressione di CD3 di superficie nelle cellule trasfettate con il costrutto TCR chimerico dovrebbe essere paragonabile a quello di quelle trasfettate con il vettore modello di controllo completamente speculare.

In sintesi, abbiamo descritto un efficiente protocollo basato sulla PCR per l'identificazione e il clonaggio di catene TCR accoppiate da singole cellule. Prevediamo che questo sarà uno strumento prezioso per studiare le risposte delle cellule T umane nell'autoimmunità, nella sorveglianza dei tumori e nell'eliminazione dei patogeni. Il vantaggio principale del protocollo PCR qui descritto è la sua compatibilità con i successivi studi in vitro e in vivo.