Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di visualizzare la formazione di vasi sanguigni in vivo in scaffold tridimensionali in tempo reale mediante microscopia multifotone. Queste misure sono questioni chiave nel campo della generazione ossea, come ad esempio come neutralizzare e ingannare la formazione di vasi sanguigni in vivo in scaffold tridimensionali in tempo reale. L'unico vantaggio di questa tecnica è che consente di neutralizzare simultaneamente CERES, metriche extracellulari e reti molecolari circostanti in vivo.

Per iniziare, preparare una soluzione omogenea contenente 20 grammi di PLGA e 20 millilitri di 1,4 diossano. Quindi, aggiungi due grammi di nHAP in polvere alla soluzione. Utilizzando un agitatore magnetico, mescolare energicamente la sospensione a 1500 giri/min a temperatura ambiente per 16 ore per formare una pasta uniforme che verrà utilizzata per la stampa di scaffold PLGA NHAP porosi.

Una volta stampati, liofilizzare gli scaffold per 48 ore per rimuovere completamente il solvente. E poi sterilizzarli in etanolo al 75% per un'ora. Successivamente, lifalizzali ancora una volta per ottenere materiale neutro e antisettico.

Quindi, aggiungi quattro virgola cinque volte 10 al quinto di particelle lentivirali a ciascuna impalcatura e lascia che le particelle vengano assorbite in un'incubatrice umidificata mantenendo i 37 gradi Celsius per due ore. Ora che la particella lentivirale è stata assorbita dagli scaffolds, lavare gli scaffold due volte con due millilitri di PBS per rimuovere eventuali residui non legati. Congelare a scatto le impalcature lavate in azoto liquido.

E dopo aver lifalizzato ancora una volta, conservali a meno 80 gradi Celsius per ulteriori studi. Trasferire scaffold 3d precedentemente rivestiti con quattro particelle lentivirali virali cinque volte dieci che trasportano la proteina fluorescente verde in fiale criogeniche da due virgola zero millilitri riempite con un millilitro di DMEM completo e incubarle a 37 gradi Celsius con agitazione per cinque giorni. Ogni dodici ore di incubazione, raccogliere un millilitro di campioni del terreno contenente particelle lentivirali rilasciate dagli scaffold e sostituirli con un millilitro di terreno fresco.

Per trasdurre HEK293T cellule, rimuovere prima il terreno dalle cellule coltivate in una piastra HEK293T 12 pozzetti e lavare le cellule due volte con PBS. Quindi, aggiungere un millilitro del terreno precedentemente raccolto alle celle HEK293T lavate e incubare la piastra per 48 ore a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata. Dopo 48 ore di incubazione, misurare il numero di cellule HEK293T positive al GFB mediante citometria a flusso per determinare il numero di particelle lentivirali bioattive.

Per iniziare, dividi casualmente sei topi neri C57 in tre gruppi di trattamento: controllo, PH e PHp di 14 animali ciascuno. Radere la pelle sulla testa di un topo anestetizzato e disinfettare la superficie con una tintura di iodio e poi una soluzione alcolica al 75%. Posizionare la testa del topo in uno strumento stereotassico e dimensionare la pelle con un bisturi e poi con le forbici, effettuare un taglio lineare di un centimetro.

Usando un batuffolo di cotone sterile, raschiare il periostio dall'osso cranico per rivelarne la superficie. Quindi, sul lato sinistro del cranio, creare con una fresa a trefina un difetto di dimensione critica di quattro millimetri di diametro. Trapiantare l'impalcatura sul lato del difetto osseo.

Utilizzare una pinza oftalmica per coprire delicatamente il sito chirurgico con il periostio. Successivamente, chiudere la ferita applicando tre punti di sutura per ogni centimetro di incisione. Infine, somministrare l'analgesico buprenorfina per controllare il dolore post-operatorio e mantenere l'animale su un termoforo per mantenere la sua temperatura corporea fino al risveglio.

Quando il topo riprende conoscenza, forniscigli cibo e acqua e monitora la sua attività quotidiana fino alla fine dell'esperimento. Dopo aver assemblato il sistema di microscopia multifotone per l'imaging TPEF e SHG, sintonizzare il laser in titanio zaffiro a femtosecondi a 860 nanometri. Per visualizzare i vasi sanguigni appena formati, iniettare nel topo per via endovenosa 200 microlitri di una soluzione di destrano da 10 milligrammi per millilitro in soluzione salina, quindi, utilizzando lo strumento stereotassico, immobilizzare l'animale anestetizzato su una piastra riscaldante per mantenere la sua temperatura corporea a 37 gradi Celsius.

Iniettare nel topo 200 microlitri di soluzione fisiologica per via intraperitoneale per prevenire la disidratazione. Infine, fornire all'animale una miscela al tre percento di isoflurano in ossigeno al 100 percento per mantenere un'anestesia e un'analgesia sufficienti durante l'imaging. Per iniziare l'imaging, scansionare una coppia di specchi galvo per creare un'area di campionamento di 512 x 512 micrometri.

Quindi, utilizzando una lente obiettivo a immersione in acqua NA a un punto O, focalizzare il fascio di eccitazione sul campione e raccogliere il segnale TPEF HSG retrodiffuso posteriore. Impostare il campo visivo in modo che copra l'area ossea normale e il bordo del difetto nel gruppo di controllo, ma solo l'impalcatura impiantata quando si esegue l'imaging dell'animale del gruppo PH o PHp. Quindi, scansiona cinque diversi siti del difetto.

Acquisisci stack di immagini ogni 12 secondi per un periodo di imaging di due ore. Qui viene presentata una fotografia dell'impalcatura preparata con la tecnica di stampa 3d, insieme a un'immagine micro-CT che mostra la porosità complessiva del materiale preparato. La struttura microporosa dell'impalcatura è mostrata in un'immagine SEM acquisita a un ingrandimento di 5000 volte.

Come mostrato, HEK293T cellule trattate con terreni contenenti particelle lentivirali rilasciate dagli scaffold esprimevano in modo efficiente la proteina fluorescente verde. Come stimato dalla citometria a flusso, il numero totale di particelle rilasciate ha raggiunto circa il 40%. L'effetto di rilascio più robusto è stato osservato entro le prime 24 ore dallo studio ed è diminuito gradualmente nel tempo, confermando che le particelle lentivirali rivestite sugli scaffold mantengono la loro attività biologica fino a 96 ore.

L'analisi in vivo dei vasi sanguigni formati all'interno di un difetto osseo calvariale ha mostrato che i nuovi vasi sanguigni, sebbene non rilevabili nel gruppo di controllo dei topi, erano chiaramente visibili in entrambi i gruppi PH e PHp otto settimane dopo il trapianto di scaffold . Inoltre, mentre in entrambi i gruppi PH e PHp sono stati rilevati molti siti di deposizione di collagene, solo nel gruppo PHp è stato possibile osservare un numero crescente di vasi più piccoli che crescevano in scaffold e l'area complessiva dei vasi sanguigni era significativamente diversa. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di immobilizzare la testa del mouse per tenerla ferma durante la scansione per evitare artefatti. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'imaging fotoacustico, al fine di fornire dati aggiuntivi, come le immagini dei tessuti profondi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione ossea per studiare l'angiogenesi nei trapianti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare la formazione di plasma in vivo in scaffold 3D in tempo reale e la microscopia a microfotoni.