Name: Visualizzando langiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Scopri la visualizzazione dell'angiogenesi in vivo mediante microscopia multiphoton in impalcature 3D-PLGA/nHAp per la rigenerazione ossea. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale dei vasi sanguigni nel modello murino di difetto critico calvarico.

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Questo studio è stato sostenuto dal programma di pavone di Shenzhen, Cina (No. 110811003586331), il programma di ricerca base di Shenzhen (No. JCYJ20150401150223631, no. JCYJ20150401145529020 e no. JCYJ20160331190714896), il Guangdong ricerca e sviluppo di capacità speciale programma pubblico (n. 2015A020212030), la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (No. 81501893), il programma di ricerca di base maggiore nazionale della Cina (2013CB945503) e la Programma di innovazione SIAT per eccellenti giovani ricercatori (Y5G010).

la cura degli animali era in conformità con la guida per la cura e l'uso di laboratorio animali della provincia di Guangdong. Tutte le procedure sono state eseguite sotto la supervisione e l'approvazione del comitato etico per Animal Research, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Accademia cinese delle scienze.
 1. produzione di vettori lentivirali (LV) <ol><li>Clone cDNA in un vettore di espressione lentivirali (pLenti6/5-eGFP o LV-eGFP) un multiplo-clonazione personalizzata pdgf-b sito a valle del promotore del citomegalovirus usando Spe io e Sal I siti di restrizione per costruire il plasmide pLenti6/5-PDGFB-eGFP (LV - pdgfb) 25.</li>
	<li>Produrre particelle lentivirali (LV - pdgfb) dalle cellule HEK - 293 FT di co-trasfezione con plasmidi di imballaggio virus (pLP1, pLP2 e pVSV-G) utilizzando il metodo standard del fosfato di calcio con la clorochina (concentrazione finale: 25 µM) 25.</li> <li>dopo 48 h di transfezione, raccogliere e filtrare 500 mL contenenti virus surnatante con un filtro (0,45 µm). Successivamente, concentrare le particelle virali mediante ultracentrifugazione a 89.000 x g per 2 h. Risospendere in 200 µ l di tampone fosfato salino (PBS), aliquota e conservare a -80 ° C.</li>
	<li>Per determinare il titolo di lentivirus, incubare le cellule HEK293T con vettori lentivirali in serie diluito per 24 h e calcolare il titolo lentivirale, come descritto in precedenza 25.</li>
</ol> 2. Realizzazione di ponteggi PLGA/nHAp 3D-stampato e l'immobilizzazione di LV materiale <ol><li>sciogliere 20 g di PLGA (poli D, L-lattide-co-glicolide) in 20 mL di 1,4-diossano per formare una soluzione omogenea. Aggiungere 2 g di saccaridica polvere HAp (nano-hydroxyapatide) (PNHA) alla soluzione; il PLGA: nHAp rapporto dovrebbe essere 10:1 (w/w).</li>
	<li>Agitare energicamente la soluzione mista (velocità di agitazione: 1.500 giri/min) a temperatura ambiente per 16 h con un agitatore magnetico per formare una pasta uniforme. Fabbricare in poroso PLGA/nHAp impalcature, utilizzando una stampante 3D di bassa temperatura con un ugello computerizzato che deposita il basso strato dopo strato, incolla verso l'alto, secondo un modello predefinito 26; le dimensioni dei pori di impalcature vanno da 200 a 400 µm.</li>
	<li>Vuoto liofilizzare i ponteggi per 48 h rimuovere il solvente completamente come possibile. Immergere i ponteggi in soluzione di etanolo di 75% per 1 h per la sterilizzazione e lyophilize per ottenere scaffold neutro, asettico. 
	Nota: I parametri principali per liofilizzazione sottovuoto includono la temperatura di condensazione (° C) e il grado di vuoto (Pa). Sotto un grado di vuoto di 45 Pa, l'impalcature PLGA/nHAp erano vuoto liofilizzato a-78 ° C per 48 h rimuovere completamente il solvente.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di particelle di LV (4,5 x 10 5) per ogni PLGA/nHAp impalcatura (4 x 4 x 2 mm) e incubare le impalcature per 2 h a 37 ° C in un incubatore per consentire adsorbimento.</li>
	<li>Dopo immobilizzazione, sciacquare i ponteggi due volte con PBS per rimuovere le particelle di LV non associate. Snap-congelare le impalcature rivestite con particelle di LV in azoto liquido, lyophilize nuovamente e conservare a-80 ° C per un uso futuro.</li>
</ol> 3. In Vitro Cinetica del rilascio di particelle di LV da impalcature e analisi di attività di trasduzione LV <ol><li>Incubare scaffold 3D (4 x 4 x 2 mm) che trasportano LV-della proteina fluorescente verde (LV-eGFP, 4.5 x 10 particelle di 5 LV) in 1 mL di DMEM completo in 2,0 mL criogenico fiale a 37 ° C con agitazione per 5 giorni.</li>
	<li>Prendere un campione di 1 mL ogni 12 h da 12 h di post-incubazione 120 h e sostituire il mezzo. In ogni momento, aggiungere 1 mL di terreno nuovo invece di 1 mL di medium di incubazione.</li>
	<li>Utilizzare i supporti raccolti per trasdurre HEK293T cellule mediante co-incubazione per 48 h. misura il numero di particelle di LV bioattivi determinando il numero di GFP-positive HEK293T cellule tramite flusso cytometry 27.
	<ol><li>Prima di trasduzione delle cellule di HEK293T, rimuovere il terreno di coltura e sciacquare le cellule HEK293T due volte con PBS. Aggiungere i supporti raccolti contenenti lentivirus rilasciato dalle impalcature per il pozzo (1 mL/pozzetto) e della coltura con le cellule HEK293T per 48 h a 37 ° C in un incubatore.</li>
	</ol></li></ol> 4. In Vitro Valutazione della migrazione di MSC (BMSC) derivate da midollo osseo <ol><li>prima del saggio di migrazione, preparare BMSCs che esprimono la proteina fluorescente di pomodoro (BMSC-T) e PDGF-BB proteina (BMSC-P) 28.</li>
	<li>Eseguire l'analisi di migrazione BMSC con una camera di Boyden utilizzando una piastra a 24 pozzetti e filtri in policarbonato con un diametro dei pori di 8 µm.
	<ol><li>Place 0,5 mL di BMSCs (5 x 10 4) transfected con LV che esprimono la proteina fluorescente di pomodoro (BMSC-T) nelle camere superiori. Posizionare 0,5 mL di BMSCs (2 x 10 5) transfected con LV che esprimono la proteina di PDGF-BB (BMSC-P) nelle camere inferiori.</li>
	</ol></li> <li>Includono sei gruppi in questo esperimento e aggiungere 500 µ l per il vano inferiore di ciascun pozzetto. 
	R. blank controllo, privo di siero medio solo controllo di B. FBS, medium supplementato con 10% FBS controllo C. PDGF-BB, 4 ng/mL PDGF-BB in medium senza siero D. PDGF-BB grippare gruppo, PDGF-BB (4 ng/mL) e l'anticorpo policlonale anti-PDGF-BB (4 ng/mL) in medium senza siero gruppo BMSC E., 2 x 10 5 BMSCs in medium senza siero gruppo F. BMSCs-P, 2 x 10 5 BMSCs-P in mezzo libero del siero.</li>
	<li>Incubare per 48 h a 5% CO 2 e 37 ° C in un incubatore. In seguito, rimuovere le cellule migrate sul lato inferiore della camera e raccoglierli per la quantificazione del numero di BMSC-T tramite flusso cytometry.
	<ol><li>Rimuovere cellule migrate sulla parte inferiore della camera laterale con un raschietto in cella e risospendere le cellule migrate con 2 mL di PBS. Quantificare il numero di migrazione BMSCs-T di flusso cytometry 29.</li>
	</ol></li></ol> 5. Istituzione di un modello di critica Calvarial murino di difetto osseo e trapianto di Scaffold Nota: topi BALB/c maschio (7 settimane) sono stati acquistati da Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Guangdong, Cina).
<ol><li>Registra un totale di 42 topi maschi per il difetto dell'osso calvarial esperimento. Dividere in modo casuale i topi in tre gruppi, con quattordici in ogni gruppo che ricevono i seguenti trattamenti: gruppo A, senza protesi; Del gruppo B, PH ponteggi impiantato (PLGA/nHAp); e del gruppo C, PHp ponteggi impiantati (PLGA/nHAp/LV-pdgfb).</li>
	<li>Anestetizzare gli animali con la somministrazione intraperitoneale di sodio pentobarbital (50 mg/kg). Pelliccia con pasta depilatoria di rimuovere e pulire la pelle di testa con soluzione di alcool di 75% prima di effettuare la prima incisione. Fissare la testa di ogni mouse con uno strumento stereotactic per tenerlo ancora durante la chirurgia.</li>
	<li>Fare un'incisione iniziale con un bisturi e poi ingrandirla witore forbici per creare un'incisione cutanea lineare 1-cm. Raschiare il periostio dall'osso del cranio per rivelare la superficie dell'osso del cranio usando un tampone di cotone sterile.</li>
	<li>Utilizzare una bava di trapanazione per creare un difetto di dimensione critica di 4 mm di diametro sul lato sinistro del calvaria 30. L'impalcatura del trapianto nel sito del difetto osseo. 
	Nota: Difetti di dimensione critica (CSDs) originalmente sono stati definiti come &#34; la più piccola dimensione intraossea della ferita in un particolare dell'osso e la specie di animale che non guariranno spontaneamente durante la vita dell'animale. &#34; In questo esperimento, il difetto di 4 mm di diametro è un difetto dell'osso di dimensione critica, secondo la precedenza studiare 31 , 32.</li>
	<li>Utilizzare forcipe oftalmico per riportare il periostio delicatamente per coprire il sito chirurgico. Suturare la pelle incisa con tre punti per cm.</li>
	<li>Eseguire cure postoperatorie. Amministrare la buprenorfina analgesica (0,1 mg/kg) per alleviare il dolore. Mantenere la temperatura corporea con un rilievo di riscaldamento fino a quando l'animale si risveglia. Successivamente, nutrire gli animali con cibo e acqua e registrare le loro attività ogni giorno fino alla fine del test. Nota: L'Analgesia può essere somministrato prima della procedura a seconda della vostra orientamenti di comitato locale cura degli animali.</li></ol> 6. In Vivo Imaging dell'angiogenesi nel difetto osseo con MPM Nota: coniugato FITC 250 kD destrano (10 mg/mL) in soluzione salina per via endovenosa è stato iniettato in topi per ottenere alta-SNR (signal-to-noise ratio) immagini di nuovi vasi sanguigni secondo un precedente studio 33. Siete pregati di notare che si tratta di una procedura di sopravvivenza. <ol><li>assemblare il sistema di microscopia multifotonica (MPM) per due-fotone eccitato fluorescenza (TPEF) e di seconda generazione armonica segnale (SHG) imaging.</li>
	<li>Anestetizzare gli animali con un'iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (50 mg/kg) e immobilizzare gli animali su una piastra riscaldante per mantenere la loro temperatura corporea a 37 ° C in tutto gli esperimenti. Utilizzare gas isoflurano 3,0% a 100% di ossigeno per mantenere soddisfacente anestesia e analgesia durante il processo di imaging. Intraperitonealmente iniettare soluzione fisiologica (200 µ l/animale) per prevenire la disidratazione prima imaging.</li>
	<li>Tune il laser a femtosecondi Ti-Sapphire a 860 nm. Creare un'area di 512 x 512 µm campionamento da una coppia di specchi galvo di scansione e utilizzare NA1.0 obiettivo di immersione in acqua a fascio di eccitazione focusthe nel campione e di raccogliere il segnale TPEF/SHG retrodiffuso. 
	Nota: L'imaging è stata eseguita su un casa-costruire multifotonica microscopico sistema di imaging (MPM). Durante la formazione immagine, un laser a femtosecondi Ti-Sapphire era sintonizzato a 860 nm come lunghezza d'onda di eccitazione ottimale. Il raggio laser è stato raster analizzati attraverso un piano di esempio utilizzando una coppia di specchi galvanometro. Dopo il passaggio attraverso uno specchio dicroico di 685 nm, il fascio è stata focalizzata sull'esemplare da un obiettivo di NA1.0 X 20. I segnali TPEF e SHG indotti sono stati raccolti dall'obiettivo stesso. I segnali sono stati spaccati del laser di eccitazione dallo specchio dicroico di cui sopra e depurata da un filtro passa-breve di 680 nm. I segnali TPEF e SHG sono stati raccolti da un fascio di fibre ottiche e condotto ad uno spettrografo. Il rilevatore sullo spettrografo era un array lineare di tubi di fotomoltiplicatore (PMT). La combinazione di spettrografo e allineamento lineare PMTs offerto la possibilità di registrare il segnale in 16 bande spettrali consecutivi, da 400 nm a 600 nm, a intervalli di 12,5 nm. Pertanto, i segnali TPEF e SHG erano rilevati allo stesso tempo e separati in domini spettrale. Inoltre, per l'imaging 3D, un motore assiale è stato utilizzato per controllare la profondità di imaging. L'area di ogni immagine è stato impostato a 512 x 512 µm, e l'intervallo di profondità è stato impostato a 2 µm (gruppo di controllo, 5 µm). In particolare, 5 siti su ogni difetto erano imaged per raccogliere dati statisticamente significativi, e i siti di formazione immagini selezionati sono stati distribuiti uniformemente e in modo casuale lungo il difetto.</li>
	<li>Scan 5 siti su ogni difetto per raccogliere dati statisticamente significativi per misurare la formazione del vaso.
	<ol><li>Uso siti di scansione in modo uniforme e casualmente distribuiti lungo il difetto. Per il gruppo di controllo, hanno il campo di vista (FOV) copertina sia la zona dell'osso originale e il bordo del difetto, ma per i gruppi di PH e PHp, hanno il FOV sul patibolo impiantato.</li>
		<li>Fare un'incisione cutanea lineare 1 cm usando un bisturi e suturare la pelle aperta alla fissazione per rivelare il sito di trapianto. Utilizzare una siringa per mettere una goccia di acqua tra l'obiettivo ad immersione e trapianti per formare un bicchiere d'acqua.</li>
	</ol></li> <li>Acquisisci immagine impila ogni 12 s oltre un ora 2 periodo di imaging. Visualizzare e analizzare dati volumetrici utilizzando un programma personalizzato di MATLAB e quantificare le aree di vaso sanguigno con software ImageJ 34 , 35.</li>
</ol> 7. Analisi dell'espressione genica di geni correlati all'angiogenesi di RT-qPCR e pdgf-b Nota: PCR è stata effettuata seguendo la procedura usuale: 95 ° C per 30 s, 40 cicli di 95 ° C per 5 s e 60 ° C per 30 s. Post-PCR fusione le curve ha confermato la specificità dell'amplificazione del singolo-obiettivo, e il cambiamento di piega del gene di interesse rispetto al β-actina è stato determinato. La reazione per ogni campione è stata testata tre volte.
<ol><li>Harvest impiantato scaffolds e tessuti da topi sperimentali a 2, 4 e 8 settimane post-operazione 36; gruppo campioni di controllo (n = 4), presi allo stesso tempo punti, dovrebbe essere da tessuto osseo adiacente. 
	Nota: In ogni punto del tempo (2, 4 e 8 settimane), eutanasia i topi con inalazione di CO 2. Sezionare il calvaria e, successivamente, rimuovere e raccogliere le impalcature impiantate da calvaria.</li>
	<li>Utilizzare un reagente commerciale per estrarre il RNA totale da ogni campione secondo il produttore &#39; protocollo s. Utilizzare il Kit di trascrizione d'inversione per invertire-trascrivere il RNA in cDNA seguendo il produttore &#39; protocollo s.</li>
	<li>Eseguire quantitative PCR in tempo reale utilizzando il sistema di rilevamento di SYBR Green; i primers sono elencati nella tabella 1.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td colspan="8"> Primer(5&#39;&#8211;3&#39;)</td></tr> <tr><td colspan="2" rowspan="1"> Gene</td>
			<td colspan="2" rowspan="1"> Avanti</td>
			<td colspan="4" rowspan="1"> Reverse</td></tr>
		<tr><td>pdgfb</td> <td colspan="3"> CATCCGCTCCTTTGATGATCTT</td> <td colspan="4"> GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT</td></tr>
		<tr><td>sindrome di Raynaud</td> <td colspan="3"> CTCTTTGGGGACGACTTCATC</td> <td colspan="4"> TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC</td></tr>
		<tr><td>VEGFR2</td> <td colspan="3"> GAAATGACACTGGAGCCTACA AG</td> <td colspan="4"> TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G</td></tr>
		<tr><td>β-actina</td> <td colspan="3"> GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG</td> <td colspan="4"> GCAGTACATAATTTACACAGAAG CAAT</td></tr></tbody>
</table> tabella 1: insiemi Pimer.
 8. MicroCT analisi della rigenerazione ossea <ol><li>Euthanize topi con l'inalazione di CO 2 al post-funzionamento 8 settimane. In un ambiente ben ventilato, delicatamente luogo ogni mouse in una gabbia pulita del mouse e pompa gas CO 2 nella gabbia per anestetizzare i topi prima il euthanasia.</li>
	<li>Sezionare il cranio per formazione immagine microCT della regione di difetto dell'osso. Utente i seguenti parametri negli esperimenti di scansione: 9 µm risoluzione, Al filtro di 0,5 mm, 50 kV tensione e corrente 142 µA.</li>
	<li>Reconstruct tutti i dati di imaging utilizzando software commerciali forniti dalla società. Calibrare le scansioni utilizzando la funzione di calibrazione di un software CTAn. 
	Nota: Inserire un'unità di Hounsfield (HU) sotto i topi in ogni scansione.</li>
</ol>

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

L'osso è un tessuto altamente vascularized con una singolare capacità di guarire e rimodellare tutta la durata di un singolo1continuamente. Il livello di vascolarizzazione è importante per la riparazione di osteogenesi e difetto. Bassa vascolarizzazione limita l'applicazione clinica larga dell'osso tessutale. Costruire un osso altamente vascularized tessutale secondo la teoria di biomimetica è diventato uno strumento per la riparazione di difetti ossei grande segmento. Vari tipi di ponteggi sono s...

L'osso è un tessuto altamente vascularized che continua a rimodellare durante la vita di un singolo1. La rigenerazione ossea rapida ed efficace di difetti ossei grande derivanti dal trauma, non sindacale, resezioni del tumore o malformazioni craniofacciali è un processo fisiologico complesso. Tradizionali approcci terapeutici utilizzati per la riparazione di difetti dell'osso includono l'impianto autologo e allogenico, ma il loro uso comporta diversi problemi e limitazioni, quali disponibilità limitata, morbilità del sito donatore significativo, un alto rischio di infezione, e ospitare il rigetto immunitario2,3. Tuttavia, gli innesti di osso artificiale offrono un'alternativa efficiente per ovviare a queste limitazioni. Può essere realizzate in materiali biodegradabili, sono facili a essere fabbricare con un diametro dei pori adatto e può essere geneticamente4,5.
Attualmente, vari ponteggi ingegneria del tessuto sono stati impiegati nello sviluppo di ingegneria tissutale ossea6,7. Per indurre la rigenerazione e riparazione ossea in modo più efficace, biomateriali ingegnerizzati combinati con fattori di crescita sono emerse e raggiunto buoni risultati8,9. Purtroppo, il tempo di dimezzamento breve, facile perdere attività e supraphysiological dosaggio di fattori di crescita per l'efficacia terapeutica limitare loro applicazione clinica10. Per superare questi problemi, la consegna dei geni del fattore di crescita invece di fattori di crescita è stata dimostrata come un approccio efficace per sostenere la bioattività per il trattamento dei difetti ossei e malattie11,12. Vettori virali sono promettente consegna strumenti per la rigenerazione dei tessuti a causa della loro alta efficienza13di esprimere.
Tra i fattori di crescita, fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-BB) è stato selezionato in questo studio perché è non solo un mitogeno e fattore chemiotattico per le cellule mesenchimali e osteogeniche, ma anche uno stimolante per l'angiogenesi14,15 . Precedenti studi preclinici e clinici hanno mostrato che PDGF-BB potrebbe promuovere in modo sicuro ed efficace riparazione ossea in difetti osseous peridentali16,17. Studi recenti hanno rivelato che PDGF-BB stimola l'angiogenesi di motivante delle cellule endoteliali migrazione e proliferazione in vivo18,19. Inoltre, PDGF-BB può anche rendere cellule staminali mesenchimali (MSCs) in grado di differenziarsi in cellule endoteliali20e questo ulteriore mette in evidenza il ruolo potenziale delle MSC in neovascolarizzazione. Di conseguenza, inducendo la formazione del de novo del sistema vascolare in impalcature con PDGF-BB è un passo importante per la riparazione del tessuto coltivato in impalcature in ingegneria del tessuto osseo.
La guarigione del difetto osseo è un processo morfogenetico tessuto dinamico che richiede osteogenesi coordinata e l'angiogenesi del riparazione posizioni21. La neoangiogenesi in impalcature tessutale impiantate è un prerequisito essenziale per la fornitura di cellule con sostanze nutritive e ossigeno per la crescita e la sopravvivenza e per la rimozione delle scorie metaboliche. Comunemente utilizzati metodi di imaging, tra cui x-ray micro-computato tomografia (microCT), la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), microscopia elettronica a scansione (SEM), tomografia a coerenza ottica (OCT) e laser confocale microscopia, sono applicati invece esame istologico per ottenere l'angiogenesi informazioni22,23. Tuttavia, questi metodi devono affrontare vari ostacoli nella visualizzazione e nella misurazione neovasculature in 3D impalcature in ingegneria del tessuto osseo. La microscopia multifotonica (MPM) è una tecnica di bio-imaging comparativamente Novella che ha il vantaggio di contemporaneamente visualizzare cellule, matrice extracellulare e che circondano reti vascolari in vivo. Possiede un'intrinseca capacità di imaging tridimensionale per la penetrazione dei tessuti profondi e causa basso photodamage. Quindi, nell'ultimo decennio, MPM ha guadagnato molta attenzione in studi biomedici24, compresi in neuroscienze, immunologia e dinamiche della cellula formativa. Tuttavia, è a malapena usato nella ricerca ortopedica.

<table><tbody><tr><td>Poli(D,L-lattide-co-glicolide) (PLGA)</td><td>Sigma</td><td>P1941</td><td>Rapporto L/G 75:25, MW 66000-107000</td></tr><tr><td>Nanoparticelle di idrossiapatite</td><td>Sigma</td><td>702153</td><td>Diametro medio < 200 nm</td></tr><tr><td>Sale di clorochina difosfato</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>destrano 250 kD coniugato FITC</td><td>Sigma</td><td>FD250S</td><td></td></tr><tr><td>1,4-diossano</td><td>lingfeng, Filtri</td> Stericup Shanghai <td></td><td>da 0,45 micron</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB Cdna</td><td>Sino Biological, Inc</td><td>Anticorpo policlonale di topo anti-PDGF-BB MZ50801-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>. BioVision, Inc</td><td>5489-30T</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB proteina</td><td></td> ricombinante <td>4489-50</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di trasfezione calcio-fosfato</td><td>Promega Corporation</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>L-DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina, Liquid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Transwell&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>topi maschi BALB / c</td><td>Guangdong Medical Laboratory Animal Center&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital di sodio&nbsp;</td><td>Microscopia</td><td></td> multifotone Merck 1063180500 <td></td></tr><tr><td>A fatto in casa negli Istituti di tecnologia avanzata di Shenzhen per rilevare la fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF) e il segnale di generazione della seconda armonica (SHG).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Keyuan, Shandong</td><td>401750169</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td><td>Takara</td><td>RR420B</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina ed eosina</td><td>Beyotime</td><td>C0105</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Leica& nbsp;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga OPtima L-100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Stampante a bassa temperatura&nbsp;</td><td>Università di Tsinghua</td><td></td><td>Un fatto in casa nell'università di Tsinghua</td></tr><tr><td>LightCycler 480 strumento&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td></td></tr><tr><td>microCT</td><td>Bruker</td><td>1176</td><td></td></tr><tr><td>software commerciale</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica in vivo in geneticamente 3d-plga/nhap impalcatura per calvarial riparazione di difetti ossei critici

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

La ricostruzione di difetti ossei criticamente dimensioni rimane un grave problema clinico a causa della scarsa angiogenesi all'interno di impalcature tessutale durante la riparazione, che dà luogo a una mancanza di sufficiente apporto di sangue e causa la necrosi dei tessuti nuovi. Rapida vascolarizzazione è un prerequisito indispensabile per la sopravvivenza del tessuto nuovo e integrazione con esistente tessuto ospite. La generazione del de novo del sistema vascolare in impalcature è uno dei passi più importanti nel rendere più efficiente, permettendo la riparazione del tessuto di crescere in un'impalcatura rigenerazione ossea. Per affrontare questo problema, la modificazione genetica di un ponteggio di biomateriale viene utilizzata per accelerare l'angiogenesi e l'osteogenesi. Tuttavia, visualizzazione e monitoraggio in vivo la formazione del vaso sanguigno in tempo reale e in impalcature tridimensionali (3D) in o nuovo tessuto osseo è ancora un ostacolo per l'ingegneria tissutale ossea. La microscopia multifotonica (MPM) è una modalità novella di bio-imaging che può acquisire dati volumetrici da strutture biologiche in modo minimamente invasivo e ad alta risoluzione. L'obiettivo di questo studio era di visualizzare l'angiogenesi con microscopia multifotonica in vivo in un'impalcatura di 3D-PLGA/nHAp geneticamente modificata per la riparazione del difetto di osso calvarial critico. PLGA/nHAp ponteggi sono stati funzionalizzati per la consegna continua di un gene di pdgf-b di fattore di crescita che trasportano vettori lentivirali (LV -pdgfb) al fine di facilitare l'angiogenesi e migliorare la rigenerazione ossea. In un osso di critico calvarial impalcatura-impiantati difetto modello murino, le aree di vaso sanguigno (BVAs) in PHp impalcature erano significativamente superiori a PH impalcature. Inoltre, l'espressione di geni in relazione con l'angiogenesi, sindrome di Raynaud e VEGFR2e pdgf-b aumentato corrispondentemente. MicroCT analisi ha indicato che la nuova formazione dell'osso nel gruppo PHp notevolmente migliorato rispetto agli altri gruppi. A nostra conoscenza, questa è la prima volta microscopia multifotonica era usata in ingegneria dei tessuti dell'osso per studiare l'angiogenesi in un 3D impalcatura bio-degradabile, in vivo e in tempo reale.

Cilindrica porosa PLGA/nHAp ponteggi 0,6 mm di altezza e 4 mm di diametro sono stati fabbricati con una stampante 3D. Le morfologie di impalcature sono state analizzate tramite microscopia elettronica e microCT. Figura 1A Mostra la fotografia dell'impalcatura impiantato. MicroCT di esame ha rivelato che più dell'85% dei pori aveva dimensioni che vanno da 200 a 400 µm (Figura 1B). Formazione immagine SEM ha dimostrato che la superficie dello scaffold aveva...

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare formazione del vaso sanguigno in vivo e in tempo reale in 3D impalcature da microscopia multifotonica. Angiogenesi in impalcature geneticamente è stato studiato in un modello di difetto critico calvarial murino dell'osso. Più nuovi vasi sanguigni sono stati rilevati nel gruppo di trattamento rispetto ai controlli.

Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è visualizzare in tempo reale la formazione di vasi sanguigni in vivo all'interno di scaffold tridimensionali mediante microscopia a fotoni multipli. Queste misurazioni riguardano questioni fondamentali nel campo della rigenerazione ossea, come ad esempio come neutralizzare e tracciare in tempo reale la formazione di vasi sanguigni in vivo all'interno di scaffold tridimensionali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette di neutralizzare simultaneamente CERES, le matrici extracellulari e le reti molecolari circostanti in vivo.Per iniziare, preparare una soluzione omogenea contenente 20 grammi di PLGA e 20 millilitri di 1,4-diossano. Quindi, aggiungere due grammi di nHAP in polvere alla soluzione. Utilizzando un agitatore magnetico, mescolare vigorosamente la sospensione a 1500 rpm a temperatura ambiente per 16 ore per ottenere una pasta uniforme che verrà utilizzata per la stampa di scaffold porosi di PLGA/nHAP.Dopo la stampa, liofilizzare gli scaffold per 48 ore per rimuovere completamente qualsiasi solvente. Successivamente, sterilizzarli in etanolo al 75 percento per un'ora. In seguito, liofilizzarli nuovamente per ottenere un materiale neutro e antisettico.Successivamente, aggiungere 4,5 × 10⁵ particelle lentivirali a ciascun scaffold e lasciare assorbire le particelle in un incubatore umidificato a 37 °C per due ore. Ora che le particelle lentivirali sono state assorbite sui scaffold, lavare i scaffold due volte con 2 mL di PBS per rimuovere eventuali residui non legati. Congelare rapidamente i scaffold lavati in azoto liquido.E dopo averli sottoposti nuovamente a liofilizzazione, conservarli a meno 80 gradi Celsius per ulteriori studi. Trasferire gli scaffold 3D precedentemente rivestiti con quattro virgola cinque per dieci alla quinta particelle lentivirali portanti la proteina fluorescente verde in vial criogenici da due virgola zero millilitri contenenti un millilitro di DMEM completo e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione per cinque giorni. Ogni dodici ore di incubazione, prelevare campioni da un millilitro del mezzo contenente le particelle lentivirali rilasciate dagli scaffold e sostituirli con un millilitro di mezzo fresco.Per trasdurre le cellule HEK293T, rimuovere prima il mezzo dalle cellule HEK293T coltivate in una piastra a 12 pozzetti e lavare le cellule due volte con PBS. Quindi, aggiungere un millilitro del mezzo precedentemente raccolto alle cellule HEK293T lavate e incubare la piastra per 48 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato. Dopo 48 ore di incubazione, misurare il numero di cellule HEK293T positive per GFB mediante citometria a flusso per determinare il numero di particelle lentivirali bioattive.Per iniziare, dividere in modo casuale i topi C57 black six in tre gruppi di trattamento: controllo, PH e PHp, ciascuno composto da 14 animali. Depilare la cute sulla testa di un topo anestetizzato e disinfettare la superficie con tintura di iodio e successivamente con una soluzione al 75 percento di alcol. Posizionare la testa del topo in uno strumento stereotassico e praticare un'incisione lineare di un centimetro con un bisturi e quindi con le forbici.Utilizzando un bastoncino sterile di cotone, raschiare il periostio dall'osso cranico per esporne la superficie. Quindi, sul lato sinistro del cranio, creare con una fresa a trapano un difetto di dimensione critica di quattro millimetri di diametro. Trapiantare l'impalcatura nel lato del difetto osseo.Utilizzare pinze oftalmiche per coprire delicatamente la sede chirurgica con il periostio. Successivamente, chiudere la ferita applicando tre punti per ogni centimetro di incisione. Infine, somministrare l’analgesico buprenorfina per controllare il dolore post-operatorio e mantenere l’animale su un tappetino riscaldante per conservarne la temperatura corporea fino al risveglio.Quando il topo riprende conoscenza, fornirgli cibo e acqua e monitorarne l'attività quotidiana fino al termine dell'esperimento. Dopo aver assemblato il sistema di microscopia multifotone per le immagini TPEF e SHG, regolare il laser a femtosecondi al titanio sapphio su 860 nanometri. Per visualizzare i vasi sanguigni neoformati, iniettare nel topo per via endovenosa 200 microlitri di una soluzione di destrano 10 milligrammi per millilitro in soluzione salina, quindi, utilizzando lo strumento stereotassico, immobilizzare l'animale anestetizzato su una piastra riscaldata per mantenere la sua temperatura corporea a 37 gradi celsius.Somministrare al topo 200 microlitri di soluzione salina per via intraperitoneale per prevenire la disidratazione. Infine, fornire all'animale una miscela al tre percento di isoflurano in ossigeno al cento percento per mantenere un'adeguata anestesia e analgesia durante l'imaging. Per iniziare l'imaging, scansionare una coppia di specchi galvanometrici per creare un'area di campionamento di 512 per 512 micrometri.Quindi, utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua NA 1,0, focalizzare il fascio di eccitazione sul campione e raccogliere il segnale retrodiffuso di TPEF HSG. Impostare il campo visivo in modo da includere l'area ossea normale e il margine del difetto nel gruppo di controllo, mentre solo lo scaffold impiantato durante l'acquisizione dell'animale appartenente al gruppo PH o PHp. Successivamente, scansionare cinque siti diversi del difetto.Acquisire pile di immagini ogni 12 secondi per un periodo di acquisizione di due ore. Qui viene presentata una fotografia del supporto preparato mediante la tecnica di stampa 3D, insieme a un'immagine di micro-TC che mostra la porosità complessiva del materiale preparato. La struttura microporosa del supporto è mostrata in un'immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) acquisita a un ingrandimento di 5000 volte.Come mostrato, le cellule HEK293T trattate con mezzo contenente particelle lentivirali rilasciate dagli scaffold hanno espresso in modo efficiente la proteina fluorescente verde. Come stimato mediante citometria a flusso, il numero totale di particelle rilasciate ha raggiunto circa il 40 percento. L'effetto di rilascio più marcato è stato osservato entro le prime 24 ore dello studio e ha mostrato un progressivo calo nel tempo, confermando che le particelle lentivirali depositate sugli scaffold mantengono la loro attività biologica fino a 96 ore.L'analisi in vivo dei vasi sanguigni formati all'interno di un difetto osseo calvarico ha mostrato che i nuovi vasi sanguigni, sebbene non rilevabili nel gruppo di controllo di topi, erano chiaramente visibili in entrambi i gruppi PH e PHp otto settimane dopo il trapianto dello scaffold. Inoltre, mentre in entrambi i gruppi PH e PHp sono stati rilevati numerosi siti di deposizione del collagene, solo nel gruppo PHp si è osservato un numero crescente di vasi più piccoli che penetravano negli scaffold, e l'area totale dei vasi sanguigni era significativamente diversa. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se effettuata correttamente.Nel corso di questa procedura, è importante ricordare di immobilizzare la testa del topo per mantenerla ferma durante la scansione ed evitare eventuali artefatti. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'imaging fotoacustico, al fine di ottenere dati aggiuntivi, ad esempio immagini di tessuti profondi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione ossea per studiare l'angiogenesi nei trapianti.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare in tempo reale la formazione del plasma in vivo all'interno di impalcature tridimensionali e della microscopia a microfotoni.

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Vascolarizzazione è la chiave per approcci in ingegneria dei tessuti successo. Pertanto, tecnologie affidabili sono necessari per valutare lo sviluppo di reti vascolari in tessuto-costrutti. Qui vi presentiamo un metodo semplice e conveniente per visualizzare e quantificare vascolarizzazione in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

L'impianto di innesti ossei autologhi e allogenici costituiscono accettato approcci per trattare la perdita di massa ossea cranio-facciale. Eppure l'effetto della composizione trapianto sull'interazione tra neovascolarizzazione, la differenziazione cellulare e la formazione delle ossa non è chiaro. Vi presentiamo un protocollo di imaging multimodale mira a chiarire l'interdipendenza angiogenesi-osteogenesi in prossimità dell'innesto.

Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l&#39;integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti

Viene presentato un metodo per creare e vivere immagini diverse nicchie di midollo osseo umanizzato nei topi. Sulla base della nicchia di supporto creata da cellule mesenchimali umane, l'aggiunta di cellule endoteliali umane induce la formazione di vasi umani, mentre l'aggiunta di rhBMP-2 induce la formazione di tessuto osseo chimerico maturo umano-mouse.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

I lembi ingegnerizzati richiedono una rete vascolare funzionale incorporata. In questo protocollo, presentiamo un metodo per fabbricare un lembo di tessuto stampato in 3D contenente una rete vascolare gerarchica e le sue anastomosi microchirurgiche dirette all'arteria femorale di ratto.

Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D

Un modello in vitro della nicchia vascolare del midollo osseo viene stabilito seminando cellule mesenchimali ed endoteliali su idrogel PEG 3D prefabbricati. Le reti endoteliali, i componenti della ECM e l'attività ALP delle nicchie variano a seconda del fattore di crescita utilizzato. La piattaforma può essere utilizzata per modelli avanzati di cancro.

Semplice creazione di una nicchia vascolarizzata del midollo osseo osteogenico utilizzando idrogel prefabbricati di poli(glicole etilenico) (PEG) in una micropiastra di imaging

Questo studio presenta il saggio bidimensionale (2D) di migrazione della ferita da graffio e il saggio tridimensionale (3D) di germinazione degli sferoidi, insieme ai rispettivi metodi di analisi a valle, tra cui l'estrazione dell'RNA e l'immunocitochimica, come saggi adatti per studiare l'angiogenesi in vitro.

Indagine sull'angiogenesi a livello funzionale e molecolare sfruttando il saggio di migrazione della ferita da graffio e il saggio di germinazione sferoidale

La microscopia intravitale consente lo studio di processi biologici dinamici come la rigenerazione dei tessuti e lo sviluppo del tumore. Il midollo osseo calvariale, un tessuto altamente dinamico, offre informazioni sull'emopoiesi e sulla funzione vascolare. L'utilizzo di un impianto di fissazione della testa biocompatibile stampato in 3D consente l'imaging longitudinale ripetitivo, migliorando la nostra comprensione delle dinamiche dei tessuti e del microambiente tumorale.

Imaging longitudinale intravitale della dinamica vascolare nel midollo osseo calvariale

L'angiogenesi da germoglio, fondamentale per lo sviluppo e la malattia, coinvolge complessi processi molecolari e meccanici. Presentiamo un versatile modello ex vivo 2.5D che analizza la germinazione cellulare dalle arterie carotidi suine, rivelando l'angiogenesi rigida-dipendente e la distinta meccanica delle cellule leader-follower. Questo modello aiuta a far progredire le strategie di ingegneria tissutale e gli approcci alla terapia del cancro.

Modello 2.5D per la caratterizzazione meccanica ex vivo dell'angiogenesi da germogliamento in tessuto vivente

Scopri la visualizzazione dell'angiogenesi in vivo mediante microscopia multiphoton in impalcature 3D-PLGA/nHAp per la rigenerazione ossea. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale dei vasi sanguigni nel modello murino di difetto critico calvarico.

Visualizzando langiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici (Video) | JoVE Journal

Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici

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