Rilevamento e l'arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l'analisi del fenotipo e funzione

L'obiettivo generale di questa procedura semplice ma efficace è isolare e arricchire le cellule B leganti l'antigene raro dal sangue periferico umano utilizzando nanoparticelle magnetiche per la loro analisi fenotipica e funzionale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia riguardanti il fenotipo e la biologia delle cellule B leganti l'antigene raro, sia prima che dopo l'incontro con l'antigene in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ovvia ai problemi associati alla geometria, in particolare quando si utilizza una lastra di stirene o un cordone di grandi dimensioni.

E ovvia ai problemi associati alla velocità di flusso quando si isolano le cellule mediante citometria a flusso per isolare cellule rare in popolazioni cellulari iniziali piuttosto grandi. Immediatamente dopo aver raccolto da 30 a 50 millilitri di sangue intero in provette per la raccolta del sangue eparinizzate, mescolare il sangue in un rapporto 1:1 con magnesio sterile a temperatura ambiente e PBS privo di calcio. Quindi, sovrapporre la miscela di sangue su 10 millilitri di soluzione a gradiente di densità a temperatura ambiente in una provetta conica sterile da 50 millilitri utilizzando una pressione di attivazione lenta e costante della pipetta.

Separare le celle mediante centrifugazione. Scartare lo strato superiore contenente plasma e piastrine e utilizzare una pipetta sterile per trasferire il buffy coat del contenitore di cellule mononucleate in una nuova provetta sterile da 50 millilitri. Riempire la provetta con un massimo di 50 millilitri di PBS per il lavaggio delle celle mononucleate mediante centrifugazione.

Quindi, risospendere il pellet in 10 millilitri di PBS fresco per il conteggio e risospendere le cellule a una concentrazione di 1x10^7 cellule per millilitro in PBS fresco su ghiaccio. Per colorare le cellule per il legame con le biglie magnetiche, trasferire prima 1-2x10^6 aliquote di cellule in provette di polistirene da cinque millilitri per ogni compensazione della fluorescenza e controllo Fluorescence Minus One, a seconda dei casi. Successivamente, raccogliere il resto del campione di cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet a una concentrazione di 3-6x10^7 cellule per millilitro in tampone FACS freddo filtrato sterile.

Dividere la soluzione cellulare in parti uguali in quattro provette FACS su ghiaccio e aggiungere il reagante bloccante del recettore Fcgamma umano a queste quattro frazioni di campione sperimentali. Al termine dell'incubazione con blocco di legame aspecifico, aggiungere gli appropriati anticorpi di colorazione della superficie cellulare coniugati a fluorescenza alle cellule in tutte e quattro le frazioni del campione. Quindi, aggiungere l'antigene biotinilato appropriato alle frazioni A e D seguito dall'aggiunta di un volume sufficiente di antigene non marcato alla frazione B in modo tale che la maggior parte dei recettori con un'affinità di almeno 1x10^6 molari siano bloccati.

Incubare tutti i campioni per 30 minuti su ghiaccio, seguiti da un'incubazione di 30 minuti della frazione B con l'antigene biotinilato appropriato. Al termine delle incubazioni, lavare le cellule due volte in un millilitro di tampone FACS ghiacciato per 5x10^7 cellule. E risospendere i pellet in un millilitro di formaldeide al 2% per 5x10^7 celle per cinque minuti al buio sul ghiaccio.

Dopo il fissaggio, lavare le celle altre due volte come appena dimostrato. E risospendere i pellet in un millilitro di tampone FACS fresco ghiacciato per 5x10^7 cellule. Quindi etichettare le cellule con uno o due microgrammi dell'anticorpo coniugato alla streptavidina secondaria appropriato per 20 minuti al buio su ghiaccio e lavare le cellule altre due volte.

Per l'arricchimento basato su nanoparticelle magnetiche, risospendere le frazioni di cellule A, B e C in un millilitro di tampone di separazione freddo per 5x10^7 cellule e filtrare le cellule attraverso singoli filtri da 40 microlitri per eliminare eventuali grumi. Successivamente, aggiungere le nanoparticelle di colorante fluorescente alla concentrazione appropriata per 10 minuti al buio a quattro gradi Celsius con rotazione e lavare i campioni due volte in un millilitro di tampone di separazione freddo. Risospendere i pellet in un millilitro di tampone di separazione freddo per 5x10^7 celle.

Quindi equilibrare tre colonne magnetiche sui loro magneti di dimensioni adeguate con tre millilitri di tampone di separazione ciascuna, consentendo all'intero volume di tampone di separazione di scorrere attraverso ciascuna colonna in un contenitore di rifiuti. Ora posiziona una provetta conica da 15 millilitri etichettata sotto ogni colonna e aggiungi le celle etichettate con particelle magnetiche alle rispettive colonne. Quando l'intero volume di ciascuna frazione cellulare è passato attraverso ciascuna colonna, aggiungere tre millilitri di tampone di separazione ghiacciato fresco alla sommità di ciascuna colonna, raccogliendo gli effluenti nelle provette etichettate.

Dopo che il secondo lavaggio è stato completamente drenato attraverso le colonne, posizionare le provette delle cellule selezionate negativamente da ciascuna frazione sul ghiaccio e trasferire le colonne in nuove provette da 15 millilitri per ciascuna frazione. Riempire ogni colonna con circa sei millilitri di tampone di separazione fresco e immergere immediatamente il tampone attraverso le colonne per raccogliere le celle legate magneticamente. Quindi raccogliere sia la frazione cellulare positiva che quella negativa mediante centrifugazione e risospendere i pellet nella soluzione appropriata per l'analisi pianificata a valle.

In questi grafici, la frequenza delle cellule B reattive al tossoide tetanico di un individuo che è stato vaccinato per l'ultima volta contro il tetano più di un decennio fa dimostra la capacità di questo metodo di essere utilizzato per arricchire le cellule leganti il tossoide tetanico di circa sette volte con una purezza di circa il 4%L'aggiunta di un eccesso di 50 volte di tossoide tetanico non marcato alle cellule di un soggetto che è stato vaccinato circa tre anni prima del prelievo di sangue. Prima dell'aggiunta dell'antigene biotinilato, il legame tetano-tossoide è diminuito dell'83%, dimostrando la specificità del legame con l'antigene. Quando l'antigene biotinilato viene omesso dalla procedura, solo lo 0,2% delle cellule B si lega ancora, presumibilmente, riflettendo il legame di un antigene non tetanico nell'assorbente.

Questi grafici dimostrano come la frequenza delle cellule B naive specifiche per il tossoide tetanico da un campione di sangue prelevato sette giorni dopo la vaccinazione di richiamo di un soggetto sano, diminuisca dall'84% al 64% dopo il richiamo. Mentre la percentuale di popolazioni di memoria e plasmablasti aumenta rispettivamente dal 16% al 36% e da zero al 40%. Inoltre, i dati rappresentativi di ELISPOT da un campione di sangue periferico ottenuto sette giorni dopo il boost da un soggetto sano illustrano l'arricchimento di quattro volte della frequenza cellulare secernente anticorpi tetano-tossoide osservato nelle cellule B isolate leganti il tetano-tossoide.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa tre o quattro ore con tutti i controlli adeguati. Il metodo può essere combinato con saggi secondari, ad esempio il trasferimento di cellule in riceventi adottati per successivi studi sul destino e la funzione cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e arricchire le cellule B leganti l'antigene raro dal sangue periferico umano utilizzando i controlli adeguati.