Name: Espressione di citochine esogene in Xenografts derivati da pazienti mediante iniezione con una linea cellulare stromalica trasdotta a citocina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Scopri come esprimere citochine esogene in xenografts derivati da pazienti mediante iniezione di una linea cellulare stromalica trasdotta. Questo metodo avanzato permette di studiare l'ematopoiesi normale e maligna senza creare nuove linee transgeniche costose.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, una borsa di studio Hyundai Hope on Wheels Hope, il Dipartimento di Patologia e Anatomia Umana, il Dipartimento di Scienze di Base e il Centro per le Disparità Sanitarie e la Medicina Molecolare presso la Loma Linda University School of Medicine e da una sovvenzione per promuovere la ricerca collaborativa e traslazionale della Loma Linda University (KJP). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del NIH.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo manoscritto descrive un metodo semplice, veloce e relativamente conveniente per progettare PDX per esprimere la citochina umana esogena. La strategia qui descritta si basa su iniezioni intraperitoneali settimanali di una linea cellulare stromale trasfusa per esprimere la citocina umana, TSLP. Prima di eseguire i metodi qui descritti, sono stati generati stromi progettati per esprimere livelli elevati della citochina di interesse (TSLP) e dello stroma di controllo simile. Nei protocolli qui presentati, lo stroma v...

I xenografts derivati ​​da pazienti (PDX) sono un potente modello in vivo per studiare la produzione di cellule ematopoietiche normali e maligne in un ambiente mammifero nativo. Più spesso, PDX è prodotto produrre iniettando o trapiantando le cellule umane in topi immunitari deficienti. La produzione di PDX utilizzando normali cellule staminali ematopoietiche umane consente studi in vivo di sangue umano normale e sviluppo di cellule immunitarie. PDX prodotto da leucemia o da altre cellule tumorali consente di studiare meccanismi oncogeni e di identificare terapie efficaci nel contesto della gamma di paesaggi genetici e mutazioni presenti nella popolazione umana. 1 Di conseguenza, PDX è l&#39;attuale standard oro per la ricerca biomedica di traduzioni per identificare terapie efficaci e un importante strumento per comprendere i meccanismi della progressione del cancro. I modelli PDX sono uno strumento essenziale per aiutare la ricerca sulle disparità di salute malattie dovute a specifiche<html> Lesioni genetiche o qualsiasi malattia in cui le variazioni del paesaggio genetico di un paziente possano contribuire sostanzialmente all&#39;operazione di oncogenesi e trattamento. I modelli PDX del mouse-umano sono possibili perché molti citochine del mouse adeguatamente imitano i loro analoghi umani nell&#39;attivare i recettori delle cellule umane mentre sono all&#39;interno del mouse. Ad esempio, l&#39;interleuchina-7 (IL-7) fornisce un segnale critico per lo sviluppo di cellule B umane. 2 In questo caso, il mouse IL-7 ha sufficiente omologia con l&#39;umano IL-7 che la citocina del mouse stimola i percorsi di segnalazione nei precursori di cellule B umani. 2 , 3 , 4 Tuttavia, questo non è il caso del linfopoetina stromale tromico (TSLP), 5 , 6 che tra le altre citochine (IL-3, fattore stimolante colonia del granulocyte-macrofago (GM-CSF), fattore di cellule staminali (SCF) ,Ref &quot;&gt; 7 è importante per la produzione di cellule ematopoietiche umane normali e maligne Quando le citochine del mouse e dell&#39;uomo mostrano una bassa omologia le citochine del mouse non attivano i rispettivi recettori sulle cellule umane Per superare questo ostacolo sono state utilizzate varie strategie Per progettare l&#39;espressione di citochine umane nei topi PDX, tra cui l&#39;iniezione di citochine umane ricombinanti, l&#39;iniezione idrodinamica del DNA, l&#39;espressione lentivirale, l&#39;espressione transgenica e la sostituzione del gene knockin.7 Questo rapporto descrive un metodo per la progettazione di PDX per la produzione di citochina umana tramite stromal media Citochine ( Figura 1 ). Nel metodo mostrato qui, i topi PDX sono progettati per esprimere la citocina umana, TSLP, o per servire come controlli negativi per la citochina. PDX che esprimono TSLP sono ottenute mediante iniezioni intraperitoneali settimanali di cellule stromali che sono state trasdotte per esprimere elevati livelli di TSLP umani.I topi di controllo &quot;PDX&quot; negativi per citochine sono costruiti similmente; Sebbene lo stroma di controllo venga trasduzione con un vettore di controllo. Questo metodo raggiunge i normali livelli fisiologici del TSLP umano in topi PDX iniettati con lo stroma TSLP +. Nessun TSLP rilevabile è osservato nei topi PDX che ricevono lo stroma citochina-negativo. Abbiamo scelto la linea cellulare HS-27A per i nostri studi, perché cresce robustamente in coltura e presenta un livello molto basso di produzione di citochine che non supporta la proliferazione di cellule progenitrici isolate nelle coculture. 8 Per l&#39;espressione TSLP umana, lo stroma è stato trasdritto con un vettore lentivirale auto-inattivo di una generazione avanzata derivato da una spina dorsale precedentemente descritta 9 e comprende l&#39;elemento cPPT / cts e l&#39;elemento regolatore post-trascrizionale dell&#39;epatite di legno (WPRE) per aumentare l&#39;espressione di transgene. Il gene TSLP umano è stato costruito in questo vettore sotto il controllo del fattore di allungamento-1(EF-1) alfa promotore per ottenere un&#39;espressione robusta, costitutiva e a lungo termine. L&#39;ingegnerizzazione di questo modello PDX migliorato per via umana-citochina è costituito da 4 fasi principali. Innanzitutto, lo stroma transdurato viene ampliato in vitro e valutato mediante un test immunosorbente enzimatico (ELISA) per una stabile produzione di citochine ad alto livello. In secondo luogo, l&#39;attività della citochina umana prodotta dalle cellule stromali trasdurate (e la mancanza di attività di citochine da uno stroma di controllo) viene verificata usando citometria a fosfo-flusso. Le linee cellulari note per essere sensibili alla citochina di interesse (in questo caso, TSLP) vengono incubate con il surnatante di cellule stromali e sono state analizzate per la fosforilazione indotta da citocina. In terzo luogo, i topi vengono iniettati con lo stroma umano trasduttore e poi il plasma del topo viene valutato mediante ELISA per livelli di citochina umana su base settimanale. Quarta, le cellule ematopoietiche umane vengono trapiantate e gli effetti funzionali in vivo della citochina umana vengono valutati su un bersaglio noto ( <em&gt; Ad esempio. Popolazione cellulare). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Figura 1: Modello PDX progettato per produrre citochina umana esogena nei topi. ( 1A ) Eseguire esperimenti di progettazione e ottenere cellule stromali umane trasdurate ( 1B ) Ottenere cellule umane (cellule staminali ematopoietiche, cellule di leucemia, ecc .) Per generare PDX (topi derivanti da xenograft). ( 2A ) Iniettare lo stroma progettato e ( 2B ) trapianto di cellule umane in topi immuni deficienti secondo il programma sperimentale. ( 3A-B ) Monitorare le concentrazioni di citochine nel supernatante dello stroma e nel plasma del topo mediante ELISA. ( 4 ) Raccogliere le cellule umane e valutare gli effetti funzionali in vivo della citochina umana presente nel PDX. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Per favore clicca qui</a>Per visualizzare una versione più grande di questa figura. La consegna della citochina umana tramite cellule stromali offre vantaggi e svantaggi rispetto ad altri metodi di erogazione / produzione di citochine umane nei topi PDX. 7 Rispetto all&#39;iniezione della citochina umana ricombinante, la somministrazione di stroma-mediata è generalmente meno costosa (il costo della coltura cellulare stromale è minore del costo della citochina ricombinante) e meno intensivo di lavoro (una iniezione a settimana rispetto a più iniezioni a settimana). Anche il problema della breve emivita di citochine è mitigato dal momento che lo stroma produce continuamente la citochina esogena. La somministrazione di citochina tramite iniezione idrodinamica del DNA può essere meno costosa della consegna tramite lo stroma. Tuttavia, è allo stesso modo transitorio e può richiedere più abilità tecnica rispetto alla semplice iniezione intraperitoneale settimanale richiesta per la somministrazione di stroma-mediata. L&#39;espressione genica lentivirale nel topo può fornire una traccia minoreMetodo nsient di consegna della citochine; Tuttavia, nelle nostre mani non sono stati raggiunti livelli fisiologici di TSLP. Inoltre, questo metodo è intenso per il lavoro, che richiede la produzione continua di vettore lentivirale. I topi transgenici o knock-in offrono una stabile espressione a lungo termine della citochina e possono essere progettati per un&#39;espressione specifica del tessuto, che può essere un vantaggio. D&#39;altra parte, l&#39;espressione transgenica del gene citocinico umano sullo sfondo del mouse immunitario deficiente richiesto per i topi PDX richiede un investimento immenso di risorse prima che il valore del modello sia stato stabilito. Inoltre, i modelli transgenici in genere non consentono l&#39;opzione di variare la tempistica dell&#39;iniziazione della citochina o del livello della produzione di citochine in vivo . Questi possono essere ottenuti con consegna mediata da stroma semplicemente cambiando il punto di tempo per l&#39;inizio dell&#39;iniezione di cellule stromali o la dose di cellule stromali iniettate. Metodo di somministrazione della citocina mediata dalle cellule stromaliOd dettagliata qui è stata usata per sviluppare PDX per valutare il ruolo di TSLP nello sviluppo normale delle cellule B umane 4 e 6 e nella leucemia linfoblastica acuta a cellule B ad alto rischio. 6 Questo metodo fornisce un metodo alternativo di somministrazione della citocina per l&#39;impiego nella generazione di modelli simili con citochine umane diverse da TSLP. Questo modello può anche essere utile per la generazione di dati preliminari che possano aiutare a determinare se il valore di un modello PDX di tipo cromosomico o citochinico per citochine sarebbe degno dell&#39;investimento sostanziale del tempo e del denaro.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti da laboratorio umidi&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, capacità di 7 ml, area di coltura di 25 cm&sup2;</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, capacità di 250 mL, area di coltura di 75 cm& sup2; e tappo ventilato</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Pallone trattato per colture tissutali T-150 Falcon, capacità 600 mL, 150 cm&sup2; area culturale & Tappo ventilato</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 10 mL Falcon</td><td></td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche in polipropilene da 15 mL</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polistirene a fondo tondo da 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche in polipropilene da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>fiale criogeniche da 2,0 mL, filettati esternamente</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette da 1 mL</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L puntali per pipette&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L puntali per pipette</td> Unità filtranti monouso sterili <td>Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>con membrana SFCA, Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp; </td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calicium e magnesio, 1&</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% acido acetico con blu di metilene</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>"Tripsina" 1x 0,25% Tripsina 2,21 mM EDTA in HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>" R10" terreno di coltura cellulare, % del volume totale (per 565 ml)</forte></td><td>-</td><td><forte>-</forte></td><td><forte>Ricetta di laboratorio</forte></td></tr><tr><td>RPMI, 88,5% (500 ml)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 9,9% (56 ml)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina, 0,99% (5,6 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina, 0,50% (2,8 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo, 0,10% (560 &; L)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td>" R20" terreno di coltura cellulare, % del volume totale (per 195 ml)</forte></td><td>-</td><td>-</td><td><forte>Ricetta di laboratorio</forte></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RPMI, 76,84% (150&nbsp; mL)</td><td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; FBS, 20,49% (40 ml)</td><td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2 mM di L-glutammina, 1,02% (2 mL)</td> <td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td></td></tr> <tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM di Na piruvato, 1,02% (2 mL</td>) <td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td></td></tr> <tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Penicillina-Streptomicina,&nbsp; 0,51% (1 ml)</td><td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2-mercaptoetanolo, 0,10% (0,1 M),&nbsp; 0,10% (200 &micro; L)</td><td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td></td></tr><tr><td><forte>" Mezzo di congelamento", % del volume totale</forte></td><td>-</td><td><forte>-</forte></td><td><forte>Ricetta di laboratorio</forte></td></tr><tr><td>" R10" medio, 45%</td><td>vedi ricetta "R10"</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 20%</td><td>vedi sopra</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-Trealosio diidrato, 5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Catolog Number </td><td>Commenti</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>"HS-27" HS-27A linea stromale umana</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>"CALL-4" MHH-CALL-4 linea cellulare, leucemia precursore delle cellule B umane</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr><tr><td>" Topi NSG" ANNUIRE. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, maschio o femmina, età 6 &ndash; 8 settimane</td><td>JAX Mice&nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare MUTZ-5, leucemia umana da precursore delle cellule B</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>Proteina TSLP umana ricombinante</td><td>R & D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Catolog Numero</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow cytomery antibodies (clone)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (nome alternativo è IL-7R&alpha;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC (8G12)</td><td>BD Biosciences</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp; (HI30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD" Colorante di vitalità fissabile&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig &kappa; catena leggera FITC&nbsp; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig &lambda; catena leggera FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; topo anti-STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Azienda</td><td>Catolog Numero</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Altri materiali e attrezzature&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transponder nano impiantabile per animali con canula</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>Crema anestetica alla lidocaina EMLA (ottenere per prescrizione presso la struttura per la cura degli animali)</td><td>prescrizione</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD &frac12; cc LO-DOSE U-100 Siringa da insulina 28G&frac12; &nbsp;</td><td>BD</td><td>#329461</td><td></td></tr><tr><td>BD Provette Microtainer con K2EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td>Alegra X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari FisherBrand (eparinizzati)</td><td>Emocitometro Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Gabbia per torta di topo</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore di coda di topo Recinto</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>Impianto Impugnatura Pistola</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>IM-300 (1,25)</td><td></td></tr> <tr><td>& micro; Quant&nbsp;</td><td>Strumenti Bio-Tek Inc.</td>Software di analisi per citometria a flusso <td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo FlowJo</td><td>, LLC</td><td>Versione 10</td><td></td></tr><tr><td>*Tutti gli anticorpi sono anti-umani se non diversamente specificato.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

espressione di citochine esogene in xenografts derivati ​​da pazienti mediante iniezione con una linea cellulare stromalica trasdotta a citocina

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

I topi xenograft (PDX) derivati ​​dal paziente vengono prodotti trapiantando le cellule umane in topi immunitari deficienti. Questi modelli sono uno strumento importante per studiare i meccanismi di ematuria normale e maligna e sono il gold standard per identificare le chemioterapie efficaci per molte malattie maligne. I modelli PDX sono possibili perché molte delle citochine del mouse agiscono anche sulle cellule umane. Tuttavia, questo non è il caso di tutte le citochine, tra cui molti che sono critici per lo studio di ematuria normale e maligna nelle cellule umane. Le tecniche che ingegneranno i topi per produrre citochine umane (modelli transgenici e knock-in) richiedono una significativa spesa prima che sia stata dimostrata l&#39;utilità del modello. Altre tecniche sono labor intensive (iniezione di citochine ricombinanti o lentivirus) e in alcuni casi richiedono elevati livelli di competenza tecnica (iniezione idrodinamica del DNA). Questo rapporto descrive un metodo semplice per la generazione di topi PDX che presentano una via umana esogenaTokine (TSLP, linfopoietina stromale stromico) mediante iniezione intraperitoneale settimanale di stroma che sono state trasdotte per sovraespressione di questa citochina. L&#39;uso di questo metodo fornisce una sorgente in vivo di produzione continua di citochine che raggiunge livelli fisiologici della citochina umana circolante nel topo. I livelli plasmatici della citochina umana possono essere variati in base al numero di cellule stromali iniettate e la produzione di citochine può essere avviata in qualsiasi punto dell&#39;esperimento. Questo metodo comprende anche i topi di controllo negativo di citochine che sono prodotti analogamente, ma attraverso l&#39;iniezione intraperitoneale di stroma trasfusa con un vettore di controllo. Abbiamo dimostrato in precedenza che le cellule di leucemia raccolte da PDL che esprimono TSLP, rispetto al controllo PDX, presentano un modello di espressione genica più simile al campione originale del paziente. Insieme i topi PDX produttori e citochine-negativi prodotti da questo metodo forniscono un sistema di modello che abbiamo utilizzato con successo per studiareRuolo del TSLP in ematuria normale e maligna.

Una panoramica del modello è mostrata in Figura 1 . Una volta ottenuti la produzione di citochine (TSLP + stroma) e lo stroma di controllo, vengono ampliati nella coltura. Prima dell&#39;iniezione di stroma nei topi, il supernatante di cellule stromali viene valutato mediante ELISA per verificare la produzione di citochine ( Figura 2 ) e la citometria a fosfocondensazione (protocollo n. 3) per verificare l&#39;attività della citochina prodotta dallo stro...

Di seguito è descritto un metodo per produrre citochine esogene nei topi xenograft (PDX) derivanti dal paziente mediante iniezione intraperitoneale settimanale di una linea cellulare stromale trasfusa da citochine. Questo metodo amplia l&#39;utilità di PDX e fornisce l&#39;opzione per la consegna transiente o sostenuta della citochine esogena in una moltitudine di modelli PDX.

Espressione di citochine esogene in Xenografts derivati ​​da pazienti mediante iniezione con una linea cellulare stromalica trasdotta a citocina

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre topi con trapianti eterologhi che presentano citochine umane in circolo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori dell'oncologia e dell'emopoiesi, ad esempio: qual è il ruolo di una specifica citochina nello sviluppo dei linfociti normali e maligni? Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli sperimentatori possono regolare le concentrazioni circolanti di citochina esogena nei loro animali con trapianto eterologo in base alle esigenze del loro esperimento.Questo elimina la necessità di produrre nuove linee di topi transgenici costose. Questa tecnica sarà utile per la ricerca di nuove terapie contro il cancro, poiché questo modello preclinico può essere utilizzato per testare farmaci antitumorali, in modo simile a quanto viene fatto in ambito clinico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'ematopoiesi normale, può anche essere impiegato per studiare malattie specifiche come la leucemia.Ho sviluppato per primo questa idea quando avevamo bisogno di un modello in vivo per valutare il ruolo della citochina TSLP nella produzione di cellule B umane normali e maligne. Iniziare seminando lo stroma di controllo appena scongelato, transdotto con vettore vuoto, in cellule produttrici di citochine in cinque millilitri di mezzo R-10 in singole fiasche T25. Per la loro coltura, a 37 gradi Celsius in una concentrazione del cinque percento di CO2 per 24-48 ore.Quando gli stromi sono confluenti, staccare le cellule con tripsina in EDTA per il reimpiego in fiaschi di coltura T150 per un periodo di tre o quattro giorni. Quando gli stromi raggiungono la confluenza nei fiaschi T150, raccogliere i supernatanti e congelarli a 80 gradi Celsius per una successiva valutazione della produzione di citochine mediante ELISA. Successivamente, trasferire ogni coltura da un fiasco T150 in tre nuovi fiaschi T150 per la coltura fino alla confluenza.Per conservare le cellule dopo il numero appropriato di passaggi, trasferire le sospensioni cellulari raccolte in un tubo conico per la centrifugazione e risospendere i pellet in un mezzo di congelamento. Successivamente, trasferire aliquote di 1,5E6 cellule in tubi per conservazione a lungo termine da stoccare in azoto liquido. Per validare il surnatante prodotto dallo stroma ingegnerizzato, scongelare i campioni di surnatante raccolti dal controllo nello stroma esprimente citochine e seminare tre pozzetti di linee cellulari di leucemia per ogni condizione in mezzo Au-20 a una concentrazione di 2E5 cellule per pozzetto in una piastra da coltura tissutale a 96 pozzetti.Incubare le cellule per due ore a 37 gradi Celsius per consentire la perdita della fosforilazione derivante dalla coltura precedente. Trasferire quindi le cellule da ogni pozzetto in provette individuali da quattro millilitri e raccoglierle mediante centrifugazione. Risospendere i pellet in 600 microlitri per ogni condizione sperimentale.Piastrare 200 microlitri di cellule per pozzetto per ogni condizione in triplice replicato. Incubare le cellule per il periodo appropriato in base al saggio fosfo-specifico commerciale specifico. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione.Etichettare le cellule mediante colorazione con citometria a flusso fosfo-specifica seguendo il protocollo del produttore. Successivamente, analizzare le cellule mediante citometria a flusso utilizzando protocolli standard di analisi citofluorimetrica per verificare che la citochina presente nel sopranatante dello stroma fosforili le cellule leucemiche. Dopo un minimo di tre passaggi post-scongelamento, trasferire le sospensioni cellulari stromali raccolte in provette coniche individuali per il conteggio.Centrifugare le cellule per formare un pellet e risospendere delicatamente in volumi appropriati di PBS sterile per l'iniezione. Mantenere le cellule a quattro gradi Celsius fino immediatamente prima dell'iniezione, momento in cui la sospensione deve essere riscaldata almeno alla temperatura ambiente. Quando le cellule sono pronte, mescolare delicatamente il primo campione per inversione e aspirare 200 microlitri di cellule in una siringa tubercolina.Quindi immobilizzare il primo animale e iniettare le cellule nella cavità peritoneale utilizzando tecniche standard di iniezione intraperitoneale. Per raccogliere un campione di sangue periferico, posizionare delicatamente il topo in un dispositivo di contenimento per piccoli animali disinfettato e fissare il tubo per minimizzare i movimenti dell'animale. Successivamente, detergere la coda con alcol isopropilico fresco, seguito dall'applicazione di una crema anestetica topica.Utilizzando forbici chirurgiche molto affilate, tagliare circa da 5 a 1 millimetro dalla punta della coda e raccogliere circa 80 microlitri di sangue periferico in capillari eparinizzati. Utilizzare una pipetta con pallina di gomma per trasferire i campioni di sangue in provette microtainer contenenti EDTA potassico etichettate e capovolgere la provetta 20 volte per prevenire la coagulazione. Dopo aver centrifugato le provette per il prelievo del sangue seguendo le istruzioni del produttore, raccogliere con attenzione lo strato di plasma e conservare le aliquote a 20 gradi Celsius, frazionando il plasma per la conservazione a 20 gradi Celsius.Nel giorno dell'ELISA, scongelare i campioni di plasma murino congelati e diluire in modo seriale lo standard dell'ELISA in volumi di 120 microlitri. Piastrare ora 40 microlitri di ogni standard in triplice replicato nelle pozzette appropriate della piastra per ELISA, seguito dall'aggiunta di 40 microlitri di ciascun campione di plasma murino nelle pozzette appropriate. Completare quindi l'analisi ELISA seguendo le istruzioni del produttore.24 ore dopo l'irradiazione dei topi, preparare le cellule ematopoietiche umane per il trapianto xenogenico. Quando si risospendono le cellule ematopoietiche in PBS sterile, è consigliabile prepararne circa il 15-20 percento in più, nel caso si verifichi una fuoriuscita durante il trapianto. Mantenere le cellule a quattro gradi Celsius fino al trapianto e trasferire il primo animale ricevente in una gabbia riscaldata per almeno cinque minuti, al fine di favorire la dilatazione della vena della coda.Riscaldare ora le cellule a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e aspirare 200 microlitri in una siringa tubercolinica. Posizionare il topo nel dispositivo di contenimento e disinfettare la coda con alcol isopropilico.Iniettare le cellule in una vena laterale della coda. Successivamente, monitorare il topo per almeno cinque minuti per confermare l'assenza di effetti avversi legati al trapianto. Gli animali con xenotrapianto derivato da paziente, o PDX, iniettati con stroma di controllo mostrano costantemente livelli di timic stromal lymphopoietin umano, o TSLP, nel plasma del topo al di sotto della soglia di rilevamento dell'ELISA.I livelli plasmatici di TSLP umano nei topi PDX iniettati con stroma trasdotto con TSLP sono proporzionali alla quantità di cellule stromali TSLP iniettate durante le due settimane precedenti. Nonostante venga eseguita in singolo campione, questa valutazione settimanale dei livelli plasmatici di TSLP mediante ELISA modificato fornisce risultati che, in generale, risultano consistenti nel tempo. È stato dimostrato che TSLP aumenta la produzione di precursori di cellule B umane normali.Effettivamente, le cellule della linea B sono significativamente aumentate nei topi TSLP-plus rispetto agli animali PDX di controllo già a partire dalla fase di precursore delle cellule B, suggerendo che la TSLP umana prodotta negli animali PDX TSLP-plus esercita gli effetti funzionali in vivo previsti sulle popolazioni di cellule bersaglio. Una volta ottimizzate, queste procedure possono generare topi con xenotrapianti in cui si rilevano livelli di citochine umane nel giro di tre o quattro settimane. È importante monitorare nel tempo la concentrazione delle citochine nel sopranatante delle cellule stromali.Questo garantisce che la produzione di citochine sia sostenuta nella stroma produttrice di citochine e assente nella stroma di controllo. I topi PDX possono essere utilizzati per studi preclinici volti a rispondere ad ulteriori domande, ad esempio: come l'efficacia di un farmaco specifico di interesse viene modificata variando i livelli fisiologici di una citochina sperimentale di interesse in vivo? Questo modello innovativo offre un nuovo approccio ai ricercatori nei campi dell'ematoncologia per studiare il ruolo della TSLP nello sviluppo e nella progressione della leucemia, nonché il suo ruolo nell'ematopoiesi normale.A condizione che si abbia accesso a linee cellulari trasdotte con citochine, è possibile utilizzare le tecniche dimostrate in questo video per fornire qualsiasi citochina esogena a modelli di malattia di trapianto eterologo derivati da pazienti, impiegando una vasta gamma di ceppi di topi immunodeficienti. Non dimenticare che lavorare con cellule ematopoietiche umane può presentare rischi. È necessario adottare sempre precauzioni per evitare la trasmissione di agenti patogeni trasmessi con il sangue durante la manipolazione di questi fluidi e cellule.

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Espressione di citochine esogene in Xenografts derivati ​​da pazienti mediante iniezione con una linea cellulare stromalica trasdotta a citocina (Video) | JoVE Journal

Espressione di citochine esogene in Xenografts derivati ​​da pazienti mediante iniezione con una linea cellulare stromalica trasdotta a citocina

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