Utilizzo In Vitro cellule vive di Imaging per esplorare chemioterapici consegnato da nanoparticelle di basata sui lipidi
1 novembre 2017
Formazione immagine della vivere-cella è un potente strumento per la visualizzazione di processi dinamici. L'esame delle cellule fisse fornisce solo immagini statiche, che possono portare a interpretazioni erronee e confusione circa il processo. Questo lavoro presenta un metodo per studiare l'assorbimento, rilascio di farmaci e localizzazione intracellulare di nanoparticelle liposomiale in cellule viventi.
L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging su cellule vive è quello di seguire i processi cellulari come l'assorbimento e la distribuzione di agenti chemioterapici senza la necessità di fissazione. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro, come ad esempio: come gli agenti chemioterapici, in forma libera o incapsulati in nanoparticelle, vengono assorbiti dalle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che stiamo visualizzando cellule viventi, prevenendo così gli artefatti di fissazione e consentendo una valutazione dinamica in tempo reale.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato che le nanoparticelle si rompevano durante la fissazione, il che portava a un'interpretazione errata della somministrazione del farmaco. Per assemblare la camera di imaging, posizionare un vetro di copertura da 25 millimetri nella parte inferiore della camera e avvitare la parte superiore nella parte inferiore. Non stringere troppo forte, poiché il vetro può rompersi.
Autoclavare l'intera camera. Per piastrare le cellule, rimuovere la camera di imaging dalla sacca di sterilizzazione in una cappa a flusso laminare. Serrare accuratamente la camera e metterla in una capsula di Petri.
Rivestire il vetro della camera di imaging con un millilitro di gelatina sterile allo 0,1% per 20 minuti a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica. Dopo aver rimosso il terreno dai matracci di coltura cellulare, lavare le cellule una volta con 1x PBS e staccare le cellule utilizzando lo 0,25% di tripsina. Inattivare la tripsina aggiungendo un terreno di coltura cellulare.
Quindi, raccogli le cellule e girale a 1.100 g per cinque minuti. Risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno di coltura cellulare. Dopo aver contato le cellule come descritto nel protocollo di testo, aspirare la gelatina e impiattare le cellule in una diluizione che consenta una copertura massima del 70% entro 24 ore.
Lasciare che le celle aderiscano al cinque percento di anidride carbonica e a 37 gradi Celsius per 24 ore. Eseguire una valutazione delle cellule al microscopio per la confluenza, la morfologia cellulare e la contaminazione. Quindi, accendi il microscopio confocale, la luce fluorescente e il computer.
Collegare il riscaldatore dell'obiettivo all'obiettivo e impostarlo a 35 gradi. Preparare l'unità di incubazione come mostrato nel protocollo di testo. Posizionare l'unità di incubazione sul tavolino del microscopio e collegare il tubo di anidride carbonica in entrata e in uscita.
Aprire la valvola principale dell'anidride carbonica e accendere il controller dell'anidride carbonica. Verificare che il controller sia impostato al cinque percento di anidride carbonica. Condizioni adeguate di coltura cellulare come temperatura, CO2, pH, umidità e sterilità sono fondamentali per l'imaging cellulare a lungo termine.
Quindi, per ogni incubatrice, questo deve essere adeguatamente testato. Imposta la temperatura del palco a 37 gradi Celsius. Lasciare che l'unità di incubazione raggiunga la temperatura e la percentuale di anidride carbonica selezionate.
Prelevare la camera di imaging dall'incubatore principale di anidride carbonica e trasportarla in una capsula di Petri fino alla sala di microscopia. Posizionare la camera di imaging in un supporto per tavolino da 35 millimetri di diametro e chiudere la camera con un coperchio di chiusura su misura. Aprire l'unità di incubazione, e lavorare il più velocemente possibile per evitare il raffreddamento delle cellule; Sostituire il cerotto rosso con la camera di imaging e quindi chiudere l'unità.
Assicurarsi che non vi siano cavi incastrati tra il tavolino e il microscopio. Lasciare acclimatare l'unità per 30 minuti. Quindi, apri il software e accendi il laser.
Crea un nuovo database facendo clic su Nuovo"sotto la scheda File. Assegna un nome e salva il database. Imposta la configurazione facendo clic su Config"sotto la scheda Acquisisci.
Selezionare Modalità canale"e Traccia singola" per valutare un singolo fluoroforo. Seleziona Multi Track" per diversi fluorofori. Quindi, scegli i filtri band-past appropriati, corrispondenti al fluoroforo.
Selezionare il canale di campo chiaro in una delle tracce. La scansione è compromessa tra il segnale fluorescente dei composti e la qualità dell'immagine. La sovraesposizione, il fotosbiancamento, il rapporto segnale/rumore, la qualità delle cellule, i composti aggiunti sono tutti fattori che possono influenzare i risultati e devono essere adeguatamente testati.
Imposta il controllo di scansione facendo clic su Scansione"sotto la scheda Acquisisci. Quindi fare clic su Modalità"per impostare le dimensioni del fotogramma, la velocità di scansione, la direzione di scansione e la media di scansione. Fare clic su Canali"per impostare il foro stenopeico, il guadagno e l'offset e la potenza del laser.
Salva queste impostazioni facendo clic su Config"nella scheda Configurazione e salvale nel database di configurazione. Imposta il time-lapse facendo clic su Muti TimeX" nella scheda Macro. Fare clic su Posizione singola.
Applicare la configurazione salvata facendo clic su Traccia singola"e scorrere fino alla configurazione richiesta nel database di configurazione. Impostare l'intervallo di tempo e il numero di scansioni. Caricare la configurazione facendo clic su Load Conf.
Assegna un nome al time-lapse nel nome del file di base e seleziona il database facendo clic su Image Data Base"per salvare il time-lapse. Imposta una cartella temporanea facendo clic su Cartella immagine temporanea"Quindi, apri l'unità di incubazione, solleva l'anello di imaging, aggiungi una goccia di olio da immersione all'obiettivo e chiudi l'unità il più velocemente possibile. Mettere a fuoco e selezionare una posizione nella camera di imaging.
Nella cabina a flusso laminare, diluire il farmaco libero o le nanoparticelle a una concentrazione di cinque microgrammi per millilitro di farmaco o 0,05 micromoli di lipidi nel terreno di coltura cellulare. Filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron se il farmaco o le nanoparticelle non sono sterili. Aprire la camera di incubazione e sollevare il coperchio del soffitto.
Quindi, rimuovere il terreno dalle cellule, aggiungere un millilitro di farmaco diluito o nanoparticelle e chiudere l'unità il più velocemente possibile. Concentrati sulle celle ed esegui una scansione veloce facendo clic su Singolo"nella scheda Controllo scansione. Quando l'immagine in campo chiaro mostra le celle focalizzate, avviare il time-lapse facendo clic su Ora di inizio" nella macro Multi TimeX.
Il numero di ripetizioni e il tempo rimanente sono mostrati nella Macro e nelle immagini. Controllare regolarmente se le celle sono ancora a fuoco o utilizzare l'autofocus. Il programma salva automaticamente il time-lapse nel database.
Non chiudere il database mentre il programma è in esecuzione. Si tratta di un time-lapse di tre ore di cellule esposte alla doxorubicina libera. Osservare l'assorbimento e la traslocazione immediata della doxorubicina fluorescente rossa nel nucleo.
Qui, le cellule vengono incubate per tre ore con doxorubicina incapsulata. Il segnale fluorescente è molto più basso e si trova nel citoplasma. Il segnale è appena visibile nel nucleo.
Trasportando questi filmati time lapse all'immagine J, è possibile disegnare una regione di interesse attorno al nucleo e misurare la densità dei pixel. Il grafico qui presentato mostra la differenza nell'assorbimento nucleare nel tempo nelle cellule incubate con Doxorubicina libera o incapsulata. Qui sono mostrate cellule incubate con doxorubicina incapsulata, mostrate in rosso.
Il segnale viola rappresenta il portatore e i lisosomi sono colorati con un marcatore verde di cellule vive. Il confronto tra i due tipi di cellule mostra una differenza nella distribuzione lisosomiale. I lisosomi nelle cellule B16BL6 sono distribuiti in tutto il citoplasma.
Considerando che, i lisosomi nelle cellule BLM si trovano vicino al nucleo. Tuttavia, entrambe le linee cellulari mostrano un'elevata colocalizzazione del segnale rosso e viola nei lisosomi, indicando che la doxorubicina e il suo vettore sono intrappolati in questi organelli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare l'assorbimento di agenti chemioterapici e altri marcatori fluorescenti nelle cellule viventi per diverse ore o addirittura giorni.
Panoramica
Questo studio presenta una tecnica di imaging su cellule vive per visualizzare in tempo reale l'assunzione e la distribuzione di agenti chemioterapici. Evitando gli artefatti da fissazione, il metodo consente un'osservazione accurata dei processi di somministrazione del farmaco in cellule vive.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Cellulare
- Neuroscienze
- Ricerca sul Cancro
Sfondo
- L'immagine in tempo reale su cellule vive fornisce informazioni dinamiche sui processi cellulari.
- L'immagine su cellule fissate può portare a interpretazioni errate dei meccanismi di somministrazione dei farmaci.
- I nanoparticelle possono degradarsi durante la fissazione, complicando l'analisi.
- L'acquisizione d'immagini in tempo reale è essenziale per comprendere le interazioni farmacologiche nella terapia del cancro.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per monitorare l'assunzione di agenti chemioterapici in cellule vive.
- Valutare la distribuzione di nanoparticelle senza artefatti da fissazione.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di somministrazione dei farmaci nelle cellule tumorali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una camera per imaging per l'osservazione di cellule vive.
- Coltura cellulare in condizioni controllate (temperatura, CO2, umidità).
- Utilizzo della microscopia confocale per monitorare i processi cellulari.
- Acquisizione di immagini in lapse temporale per catturare i cambiamenti dinamici nel tempo.
Risultati principali
- Visualizzazione con successo dell'assorbimento e della distribuzione del farmaco in tempo reale.
- Dimostrati i vantaggi dell'imaging su cellule vive rispetto ai metodi su cellule fissate.
- Forniti approfondimenti sul comportamento dei nanoparticelli all'interno di cellule vive.
- Consentita l'osservazione delle risposte cellulari all'esposizione al farmaco.
Conclusioni
- L'immagineggiatura di cellule vive è uno strumento prezioso per lo studio dei meccanismi di somministrazione dei farmaci.
- Il metodo riduce il rischio di interpretazioni errate associate alla fissazione.
- Applicazioni future potrebbero migliorare le strategie di trattamento del cancro.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
L'immagine in tempo reale di cellule vive permette il tracciamento in tempo reale dell'assorbimento di nanoparticelle chemioterapiche e del loro traffico intracellulare, affrontando una lacuna critica nello sviluppo di farmaci oncologici in cui gli artefatti da fissazione oscurano gli eventi dinamici di rilascio del farmaco e di translocazione nucleare. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico fornendo dati quantitativi risolti nel tempo sulla cinetica di rilascio del farmaco e sulla localizzazione subcellulare, informando direttamente l'ottimizzazione del composto leader e la selezione del candidato preclinico. Visualizzando il destino dei nanocarrier a base lipidica all'interno di cellule tumorali vive, il metodo aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, riducendo l'abbandono tardivo dovuto a meccanismi d'azione mal compresi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'osservazione diretta del rilascio dell'agente chemioterapico dai nanocarrier e della successiva translocazione nucleare, chiarificando il legame meccanicistico tra somministrazione e attività biologica.
- Valore operativo: Elimina gli artefatti indotti dalla fissazione che alterano l'integrità dei nanoparticelle e la distribuzione del farmaco, garantendo un'interpretazione accurata dei profili di assorbimento e rilascio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera misurazioni quantitative dell'intensità di fluorescenza nel tempo, consentendo il confronto tra la cinetica di farmaci liberi e di farmaci incapsulati in un contesto fisiologicamente rilevante.
- Valore operativo: Stabilisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per la valutazione di sistemi di somministrazione di farmaci a base di nanoparticelle in condizioni di cellule vive, favorendo la scalabilità del saggio e il riutilizzo tra diversi progetti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la degradazione del nanocarrier e il rilascio del farmaco alla colocalizzazione lisosomiale e all'accumulo nucleare, fornendo un biomarcatore traslazionale per la disponibilità intracellulare del farmaco.
- Valore operativo: Facilita decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo, visualizzando se i farmaci incapsulati raggiungono un'adeguata consegna al nucleo necessaria per indurre gli effetti farmacologici previsti, riducendo l'incertezza meccanicistica nei modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della molecola bersaglio fino all'identificazione del composto attivo, in cui la visualizzazione in tempo reale del rilascio del farmaco e della distribuzione subcellulare fornisce informazioni per stabilire relazioni struttura-attività e ottimizzare la progettazione dei nanoveicoli prima dei test di efficacia preclinica.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo alla stabilità dei nanocarrier, alla cinetica di rilascio del farmaco e ai percorsi di traffico intracellulare, consentendo l'osservazione diretta della translocazione della doxorubicina dal citoplasma al nucleo.
- Screening: Fornisce letture quantitative pronte per saggi sull'assorbimento del farmaco e sull'accumulo nucleare nel tempo, permettendo il confronto diretto di variabili formulative in condizioni cellulari vive identiche.
- Analisi: Fornisce dati di intensità fluorescente in funzione del tempo provenienti da regioni di interesse definite (ad esempio, nucleo, lisosomi), consentendo il confronto statistico dell'efficienza di consegna del farmaco tra agenti liberi e agenti incapsulati in nanoparticelle.
- Ricerca Translazionale: Collega il comportamento dei nanocarrier in cellule vive agli esiti farmacologici successivi, correlando i modelli di traffico lisosomiale con la disponibilità del farmaco nel nucleo, sostenendo decisioni di avanzamento allineate ai biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Rappresenta una capacità di imaging modulare applicabile su diverse piattaforme di nanoparticelle e agenti chemioterapici, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante e consentendo screening meccanicistici su tutta la linea di prodotti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva sul meccanismo d'azione del farmaco rivelando il rilascio in tempo reale del farmaco e la sua translocazione nucleare, riducendo l'ambiguità nell'interazione con il bersaglio e nell'attivazione delle vie metaboliche.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità attraverso la preparazione standardizzata delle camere, il controllo ambientale e parametri di acquisizione delle immagini, minimizzando la variabilità negli studi longitudinali su cellule vive.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale identificando precocemente i nanoveicoli non funzionali, evitando investimenti in sistemi di somministrazione che non rilasciano il farmaco attivo nel sito d'azione.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei candidati nanoveicoli sulla base del dimostrato rilascio intracellulare del farmaco e della sua consegna al nucleo, allineando lo sviluppo alla validità meccanicistica.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging di cellule vive, nella microscopia confocale e nell'acquisizione temporale per mantenere la vitalità cellulare e l'integrità del segnale per periodi prolungati.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi sistemi di incubazione con controllo di temperatura e CO2, laser confocali e rivelatori sensibili per il tracciamento di nanoparticelle a basso segnale.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nelle procedure di preparazione delle cellule, nei dosaggi farmacologici e nei protocolli di imaging, al fine di garantire la comparabilità tra studi e sedi differenti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse linee cellulari, dimensioni delle nanoparticelle ed etichette fluorescenti, poiché i rapporti segnale-rumore e le soglie di fototossicità variano in base alle condizioni sperimentali.
- I limiti pratici includono il rischio di fotodegradazione durante l'imaging a lungo termine e la necessità di un'accurata ottimizzazione della potenza del laser e della velocità di scansione per bilanciare qualità del segnale e salute cellulare.
