Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati
23 marzo 2017
Qui mostriamo come analizzare dendritica instradamento dei neuroni midollo Drosophila in colonne e strati. Il flusso di lavoro comprende una tecnica di imaging dual-view per migliorare la qualità delle immagini e strumenti computazionali per tracciare, registrare mandrini dendritiche alla matrice di colonna di riferimento e per analizzare le strutture dendritiche nello spazio 3D.
L'obiettivo generale di questo protocollo è analizzare il percorso dendrico dei neuroni adulti del midollo di drosophila in colonne e strati per caratterizzare i modelli dendrici, determinare i tipi di cellule in base alla morfologia e identificare i mutanti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, tra cui la mappatura dei circuiti cerebrali e la comprensione del meccanismo di cablaggio del dendrite. Il vantaggio principale di questa tecnica è che trasmette le proprietà dendritiche nello spazio tridimensionale, migliorando così la comprensione della logica e delle funzioni del cablaggio dendritico.
L'obiettivo di questa procedura è quello di acquisire due pile di immagini dei neuroni di interesse in due orientamenti ortogonali, orizzontali e frontali. Utilizzando le tecniche standard, colorare i cervelli di mosca sezionati con anti-GFP di coniglio e un anticorpo che marca, gli assoni dei fotorecettori, gli anticorpi primari. Quindi etichettare gli anticorpi primari con anticorpi secondari fluorescenti e liberare il cervello con glicerolo al 70% e 1X PBS.
Per montare il cervello con orientamento orizzontale, trasferire un cervello eliminato con glicerolo in una goccia da 20 microlitri di terreno di montaggio antisbiadimento depositato centralmente sul vetrino del microscopio. Quindi, su un vetrino coprioggetti, attacca piccole macchie di argilla ai quattro angoli per evitare che il vetrino schiaccia il cervello. Ora, sotto un microscopio da dissezione, posizionare il cervello in posizione ventrale verso l'alto.
Usa la superficie dorsale convessa del cervello come punto di riferimento per identificare l'orientamento del campione cerebrale. Questo fornirà una visione orizzontale del neurone. Quindi attacca il vetrino coprioggetti.
Utilizzando un microscopio confocale, idealmente equipaggiato con rivelatori GaAsP, è possibile ottenere la pila di immagini di visualizzazione orizzontale con un obiettivo ad alta apertura numerica e uno zoom digitale di 2,5. Acquisisci almeno 180 sezioni ottiche, avere 512 pixel quadrati e una dimensione del passo di 2 micron. Dopo aver scattato la prima pila di immagini, rimuovere il vetrino coprioggetti dal vetrino e riposizionare il cervello nella posizione anteriore verso l'alto che fornisce una vista frontale.
Quindi, utilizzando la stessa tecnica, crea una nuova pila di immagini della vista frontale degli stessi neuroni ripresi nella vista orizzontale. Assicurati di registrare anche la posizione del neurone di interesse rispetto al neuropalo midollare. L'identificazione degli stessi neuroni è fattibile con un ingrandimento inferiore.
Tuttavia, se il segnale viene perso perché il tessuto è profondo, basta visualizzare la metà ventrale del cervello. Verificare inoltre se il campione si è spostato durante l'acquisizione delle immagini esaminando le pile di immagini. L'immagine di convoluzione e la combinazione di immagini sono dettagliate nel protocollo di testo.
L'obiettivo di questa procedura è quello di rintracciare i neuriti e di assegnare punti di riferimento per la registrazione. Per prima cosa apri il file immagine ricombinato. Quindi vai su modifica.
Quindi mostra la regolazione del display e disattiva il canale del fotorecettore, che è rosso. Quindi, visualizza l'immagine in modalità supera. Se il computer è dotato di un sistema stereografico, attivare lo stereo e utilizzare la modalità quad buffer per visualizzare le immagini 3D.
Aggiungi nuovi filamenti, vai su surpass, quindi filamenti e fai clic sulla scheda con l'etichetta salta creazione automatica, modifica manualmente. Quindi fare clic sulla scheda di disegno e selezionare AutoDepth. Quindi, seleziona le impostazioni.
Attiva o disattiva l'opzione della linea e inserisci il numero di pixel appropriato per una migliore visualizzazione. Quindi attiva o disattiva Mostra dendriti, punto iniziale e punto di ramificazione e imposta la qualità di rendering su 100%Ora seleziona la scheda di disegno e inizia a tracciare i neuriti. Inizia con l'assone, quindi passa ai dendriti.
L'assone e i dendriti dei neuroni transmidollari dovrebbero essere facili da differenziare. Dopo aver tracciato i neuriti, torna alle impostazioni e deattiva sia il punto iniziale che il punto di ramificazione. Quindi vai a superare, quindi esporta.
Seleziona l'oggetto e salva il filamento come file inventore. Il passo successivo consiste nell'assegnare i punti di riferimento. Per iniziare, selezionare Mostra regolazione display e attivare entrambi i canali di imaging.
Poi vai a superare, poi a misurare. E nella scheda di modifica, attiva o disattiva un canale specifico e seleziona il canale del fotorecettore in questo caso. Ora assegna i punti di riferimento per il livello superiore.
Seleziona il superamento, quindi i punti di misurazione e contrassegna l'inizio dello strato m1 come strato superiore. Utilizzare la funzione del piano di ritaglio per facilitare l'assegnazione dei punti. L'ordine dei punti è equatoriale, equatoriale anteriore, anteriore, ventrale anteriore, ventrale, ventrale posteriore, posteriore, equatoriale posteriore e centrale.
Per trovare il fotorecettore centrale, è quello associato ai processi più dendritici. Quindi assegna i punti di riferimento per i livelli R8 e R7 utilizzando la stessa tecnica. Dopo aver definito ogni insieme di punti di riferimento, esportare le coordinate.
Selezionare le statistiche, quindi i valori dettagliati e specifici e la posizione. Quindi selezionare l'esportazione delle statistiche nella visualizzazione della scheda su file e salvare le coordinate come file CSV. Quindi, apri i tre file CSV in un editor di fogli di calcolo.
Copia e incolla le coordinate dei 27 punti di riferimento in un nuovo file, seguendo l'ordine di top, R8 e poi R7. Procedere seguendo il protocollo di testo per la standardizzazione della registrazione non lineare del corpo rigido e del TPS alla configurazione ventrale destra nel calcolo delle frequenze di ramificazione e terminazione dendritiche. In definitiva, i dati vengono utilizzati per creare vari grafici informativi. Utilizzando la procedura di imaging a doppia vista qui presentata, un cervello di mosca contenente neuroni tm 20 scarsamente marcati è stato ripreso in due direzioni ortogonali.
La ricombinazione delle immagini migliora la risoluzione assiale. L'immagine ricombinata ha una risoluzione migliore rispetto a quelle delle immagini con vista orizzontale e frontale. Dopo aver consultato i modelli 3D, le tracce dendritiche sono state raccolte da 15 neuroni tm 20 e confrontate con tracce dendriche da 15 neuroni tm 2.
Sono state analizzate le probabilità di ramificazione e terminazione di questi neuroni. Entrambi i tipi erano simili per segmenti inferiori a 4 micron. L'analisi layer-specific della terminazione dendritica ha mostrato che i due tipi di neuroni si distribuiscono in modi distinti e specifici per strato.
I dendriti Tm 2 ricevono input in m2 e in m5. Mentre i dendriti tm 20 terminano nello strato da m1 a m3. L'analisi planare mostra che i dendriti tm 2 si proiettano anteriormente, mentre i dendriti tm 20 si proiettano posteriormente.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire due delle tue immagini confocali. Leggi i tuoi voti di studio sui file di imaging ed estrai le proprietà dendritiche da queste immagini. Durante il tentativo di questa procedura, è importante contrassegnare correttamente il campione prima dell'imaging confocale.
Poiché la combinazione di imaging fallirà se il campione si muove durante l'imaging.
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Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo per analizzare il routing dendritico dei neuroni della medulla di Drosophila adulta in colonne e strati. Utilizza tecniche di imaging a doppia vista e strumenti computazionali per migliorare la qualità delle immagini e analizzare le strutture dendritiche nello spazio 3D.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Neuroanatomia
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Il routing dendritico è cruciale per comprendere i circuiti cerebrali.
- La caratterizzazione dei modelli dendritici aiuta a determinare i tipi di cellule.
- L'identificazione dei mutanti può fornire informazioni sulla funzione neurale.
- L'analisi 3D migliora la comprensione della logica del cablaggio dendritico.
Obiettivo dello studio
- Analizzare il routing dendritico nei neuroni della medulla di Drosophila.
- Caratterizzare i modelli dendritici e determinare i tipi di cellule.
- Identificare i mutanti che influenzano la morfologia dendritica.
Metodi utilizzati
- Acquisire due stack di immagini dei neuroni in orientamenti ortogonali.
- Colorare i cervelli di mosca dissecati con anticorpi specifici.
- Etichettare gli anticorpi primari con anticorpi secondari fluorescenti.
- Rendere trasparente il cervello utilizzando glicerolo e PBS per l'imaging.
Principali risultati
- Le tecniche di imaging migliorate potenziano l'analisi delle strutture dendritiche.
- La mappatura 3D rivela il cablaggio intricato dei dendriti.
- La caratterizzazione dei tipi di cellule basata sulla morfologia viene realizzata.
- L'identificazione dei mutanti fornisce informazioni sullo sviluppo neurale.
Conclusioni
- Questo metodo avanza significativamente la comprensione del routing dendritico.
- Facilita la mappatura dei circuiti cerebrali in Drosophila.
- Gli studi futuri possono sfruttare questa tecnica per applicazioni più ampie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-resolution 3D analysis of dendritic architecture in defined neural circuits, supporting target validation in neuropharmacology by linking structural phenotypes to genetic perturbations. By quantifying layer-specific termination and planar projection of dendritic arbors, it provides mechanistic de-risking for CNS drug discovery through improved predictive confidence in neuronal circuit models. The workflow facilitates identification of cell-type-specific defects, aiding in translational biomarker alignment and preclinical model refinement for neuropsychiatric indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating dendritic morphology with genetic or pharmacological manipulations in defined neuronal subtypes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative assessment of dendritic branching and termination frequencies as functional readouts.
- Predictive Value: Enhances target confidence by establishing structure-function relationships in medulla neuron circuits relevant to conserved neurodevelopmental pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible 3D dendritic tracings registered to a reference columnar framework for consistent morphological scoring.
- Quantitative Output: Delivers layer-specific termination frequencies and planar projection metrics enabling high-content analysis of dendritic patterning.
- Platform Utility: Utilizes open-source MIPAV and MATLAB toolboxes, supporting scalability and cross-lab reproducibility in neuroanatomy-focused screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maps dendritic defects to specific layers (e.g., m1–m3 for tm20 vs. m2/m5 for tm2), enabling alignment with translational biomarkers of circuit dysfunction.
- Preclinical Continuity: Provides a disease-relevant system for evaluating genetic mutants affecting neuronal wiring, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic De-risking: Clarifies wiring logic defects in neurodevelopmental models, reducing ambiguity in target engagement studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by converting imaging data into quantifiable dendritic features that inform lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via 3D dendritic tracing and layer-specific analysis to clarify neuronal identity and circuit logic.
- Screening: Enables assay standardization through reference-based registration and automated tracing of dendritic arbors across genetic backgrounds.
- Analytics: Derives branching and terminating frequencies as quantitative readouts for comparing conditions in mutant vs. wild-type analyses.
- Translational Research: Connects dendritic layer preferences to putative homologs in vertebrate cortex, supporting cross-species translational continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline for systematic phenotyping of neuronal mutants in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal phenotyping by providing spatially resolved dendritic architecture data.
- Operational Value: Ensures reproducibility through dual-view image recombination and standardized reference point assignment across layers.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling objective, morphology-based stratification of neuronal subtypes.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on structural fidelity of dendritic models in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, 3D image registration, and neuronal morphology analysis.
- Dependent on high-NA objectives, GaAsP detectors, and computational platforms supporting MIPAV and MATLAB-based tracing.
- Necessitates cross-team standardization for consistent staining, clearing, and imaging protocols across laboratories.
- Adaptation to other model systems may require modification of reference frameworks and layer definitions.
- Practical limitations include signal loss in deep tissues and sensitivity to sample movement during dual-view acquisition.
