Name: Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Scopri l'analisi computazionale della morfologia dendritica in colonne e strati utilizzando tecniche di imaging dual-view su neuroni della medulla di Drosophila. Questo metodo avanzato migliora la comprensione del cablaggio cerebrale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, l&#39;Istituto Nazionale di Eunice Kennedy Shriver delle saluti infantili e dello sviluppo umano (concessione HD008913 a C.-HL), e il Centro per l&#39;Information Technology (PGM, NP, ESM , e MM).

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<li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).</li>
<li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe%3A+the+input+terminals+to+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla.</a> J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).</li>
<li>Takemura, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+circuits+integrate+neighboring+visual+signals+in+a+Drosophila+motion+detection+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway.</a> Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li>
<li>Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+NeuronJ+tracing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of NeuronJ tracing data.</a> Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
<li>Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Measure%3A+a+web-accessible+tool+for+the+analysis%2C+comparison+and+search+of+digital+reconstructions+of+neuronal+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies.</a> Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+Estimation+from+Incomplete+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22JASA%22%5BJournal%5D)">Nonparametric Estimation from Incomplete Observations.</a> JASA. 53, 457-481 (1958).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, mostriamo come immagine e analizzare pergole dendritiche di neuroni midollo Drosophila. La prima sezione, dual-view di imaging, descrive la deconvoluzione e la combinazione di due pile di immagine in una pila alta risoluzione. La seconda sezione, dendriti tracciamento e la registrazione, descrive il tracciamento e la registrazione dei dendriti dei neuroni midollo nella matrice colonna di riferimento. La terza sezione, analisi dendritica, descrive l&#39;uso di script personalizzati per analizzare i modelli ...

Durante lo sviluppo, i neuroni dendriti elaborati in complesse ma stereotipati modelli ramificati per formare sinapsi con i loro partner presinaptici. modelli di ramificazioni dendritiche correlano con l&#39;identità e le funzioni dei neuroni. Le posizioni di pergole dendritiche determinano il tipo di ingressi presinaptiche che ricevono, mentre il dendritica ramificazione complessità e dimensioni del campo governano il numero di input. Così, dendritiche proprietà morfologiche sono fattori determinanti per la connettività sinaptica e computazione neuronale. In molte regioni del cervello complessi, come le mosche lobi ottici e retina dei vertebrati, circuiti sinaptici sono organizzati in colonne e strati per facilitare l&#39;elaborazione delle informazioni 1, 2. In una tale organizzazione colonna e strato, neuroni presinaptici di un distinto assoni progetto modalità per terminare a un livello specifico (cosiddetto targeting specifico-layer) e per formare un ordinato matrice bidimensionale (i called mappa topografica), mentre i neuroni postsinaptici estendono dendriti di dimensioni adeguate a livelli specifici per ricevere gli ingressi presinaptici dei tipi e dei numeri corretti. Mentre assonale mira a strati e le colonne è stato ben studiato 3, 4, e tanto meno si sa su come dendriti vengono indirizzati a livelli specifici e si espandono opportunamente dimensionate campi recettivi per formare connessioni sinaptiche con la corretta partner presinaptica 5. La difficoltà di imaging e quantificare dendritiche mira a strati e le colonne ha ostacolato lo studio dello sviluppo dendritiche nelle strutture cerebrali colonnari e laminati. Drosophila neuroni midollo sono un modello ideale per lo studio di routing dendritiche e montaggio del circuito in colonne e strati. Il neuropil mosca midollare è organizzato come un reticolo 3D di 10 strati e circa 750 colonne. Ogni colonna è innervato da un insieme di afferenze, tra cui photoreceptors R7 / R8 e neuroni lamina L1 - L5, i cui terminali assonale formare le mappe topografiche in maniera specifica strati 6. Circa 38 tipi di neuroni midollo sono presenti in ogni colonna di midollo e dendriti elaborati in strati specifici e con adeguati dimensioni del campo per ricevere input da queste afferenze 7. I circuiti sinaptici nel midollo sono state ricostruite a livello microscopico elettronico; in tal modo, le partnership sinaptiche sono ben stabiliti 7, 8. Inoltre, strumenti genetici per l&#39;etichettatura di vari tipi di neuroni midollo sono disponibili 9, 10, 11. Esaminando tre tipi di transmedulla (TM) neuroni (Tm2, TM9 e TM20), abbiamo già individuato due-specifica delle cellule di tipo attributi dendritiche: (i) i neuroni proiettano Tm dendriti in entrambe le direzione anteriore o posteriore (Proj planareezione direzione), a seconda dei tipi di cellule e (ii) dendriti dei neuroni midollo terminare in strati midollo specifici in un modo specifico tipo cellulare (terminazione specifico layer) 12. Planar direzione di proiezione e terminazione specifici strati sono sufficienti per differenziare questi tre tipi di neuroni Tm, mentre le mutazioni che sconvolgono le risposte TM per spunti di livello e colonna riguardano aspetti distinti di questi attributi. Qui, vi presentiamo un flusso di lavoro completo per l&#39;esame della patterning dendritica dei neuroni midollo Drosophila in colonne e strati (Figura 1). Innanzitutto, mostriamo un metodo di imaging dual-view, che utilizza software personalizzato per unire due immagine confocale pile per generare immagini isotrope alta qualità. Questo metodo richiede solo la microscopia confocale convenzionale per generare immagini di alta qualità che consentono la tracciabilità affidabile di rami dendritici, senza ricorrere alla microscopia super-risoluzione, ad unas STED (emissione stimolata Depletion) o l&#39;illuminazione strutturale. In secondo luogo, vi presentiamo un metodo per tracciare pergole dendritiche e per registrare le tracce dei neuriti conseguenti ad una matrice di colonna di riferimento. Terzo, mostriamo i metodi di calcolo per estrarre informazioni sulla direzione di proiezione planare e terminazione specifico strato di dendriti, nonché per derivare stime per frequenze ramificazione e terminazione dendritiche. Insieme, questi metodi consentono la caratterizzazione di modelli dendritiche in 3D, la classificazione di tipi cellulari basate su morfologie dendritiche, e l&#39;identificazione di potenziali difetti nei mutanti.

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>versione 16.05</td><td>per la deconvoluzione delle immagini (https://svi.nl).&nbsp; software commerciale</td></tr><tr><td>MIPAV</td><td></td><td>versione 7.3.0</td><td>per la ricombinazione e la registrazione delle immagini (http://mipav.cit.nih.gov/); plugin MIPAV freeware</td></tr><tr><td>: PlugInDrosophila Plug-in</td><td>MIPAV freeware</td>RetinalRegistration.class<td></td><td></td></tr><tr><td>: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class</td><td></td><td></td><td>freeware</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>per il tracciamento di neuriti e l'assegnazione di punti di riferimento per la registrazione delle immagini (http://www.bitplane.com); software commerciale</td></tr><tr><td>Vaa3D</td><td></td><td></td><td>per la visualizzazione di file swc ( https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2014b</td><td>per l'analisi morfometrica dei dendriti (http://www.mathworks.com); software commerciale</td></tr><tr><td>Matlab toolbox: TREES1.14</td><td></td><td>v1.14</td><td>per l'analisi dei parametri morfometrici dendritici (http://www.treestoolbox.org/download.html);</td></tr><tr><td>freeware Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox</td><td></td><td>v1.0</td><td>Per il calcolo dei parametri morfometrici (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sample files</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWC http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html di definizione</td><td></td><td></td><td>del</td></tr> <tr><td>fileI codici e i file di esempio per la combinazione di immagini e la registrazione</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration</td></tr><tr><td>esempio di punto di riferimento&nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sistema informatico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Windows Windows 7 x64 o Macintosh OS X 10.7 o successivo</td><td></td><td></td><td>Processore quad-core a 64 bit da 3 GHz, RAM 16G (minima)</td></tr><tr><td>Opzionale: Quadro4000&nbsp; Scheda grafica (o superiore)</td><td>Nvidia</td><td></td><td>per la visualizzazione stereografica dei dendriti.</td></tr><tr><td>Opzionale: NVIDIA 3D vision2</td><td>Nvidia</td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html</td></tr><tr><td>Opzionale: display LCD a 120 Hz per NVIDIA 3D vision2</td><td></td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagenti per l'imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24B10 anticorpo</td><td>The Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Antibody</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A21124</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Montaggio Antifade Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Montaggio&nbsp; Argilla&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>S04179</td><td></td></tr><tr><td>70% glicerolo in 1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Occhiali, alte prestazioni, D = 0,17&nbsp; mm</td><td>Zeiss</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr></tbody></table>

analizzando dendritiche morfologia in colonne e strati

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In molte regioni del sistema nervoso centrale, come le mosche lobi ottici e corteccia vertebrato, circuiti sinaptici sono organizzati in strati e colonne per facilitare il cablaggio cervello durante lo sviluppo e l&#39;elaborazione delle informazioni in animali sviluppati. neuroni post-sinaptici dendriti elaborati nei modelli specifici del tipo a livelli specifici di sinapsi con opportuni terminali presinaptici. Il neuropil mosca midollare è composto da 10 livelli e circa 750 colonne; ogni colonna è innervato dal dendriti di oltre 38 tipi di neuroni midollo, che corrispondono con i terminali degli assoni di alcuni 7 tipi di afferenze in maniera specifica per tipo. La presente relazione illustra le procedure per l&#39;immagine e analizzare dendriti dei neuroni midollo. Il flusso di lavoro prevede tre sezioni: (i) la sezione di imaging dual-view combina due pile immagine confocale raccolti a orientamenti ortogonali ad alta risoluzione di immagini 3D di dendriti in; (Ii) il dendrite tracciamento e la sezione di registrazione tracce dendritichepergole in 3D e registri tracce dendritiche nella matrice colonna di riferimento; (Iii) la sezione di analisi dendritica analizza i modelli dendritiche rispetto alle colonne e strati, tra cui la direzione di terminazione e la proiezione planare specifico strato di gazebo dendritiche, e deriva stime di frequenze ramificazione e terminazione dendritiche. I protocolli utilizzano plug-in personalizzati costruiti sulla MIPAV open-source (Medical Imaging elaborazione, l&#39;analisi e la visualizzazione) di piattaforma e personalizzati toolbox nella lingua di laboratorio della matrice. Insieme, questi protocolli forniscono un flusso di lavoro completo per analizzare l&#39;instradamento dendritica di Drosophila neuroni midollo in strati e colonne, per identificare i tipi di cellule, e determinare difetti di mutanti.

Utilizzando la procedura di imaging dual-view qui presentato, un cervello mosca contenente neuroni TM20 scarsamente etichettati è stato ripreso in due direzioni ortogonali. Prima di imaging, il cervello era macchiato di appropriati anticorpi primari e secondari per la visualizzazione GFP e fotorecettori assoni membrana-tethered. Per l&#39;imaging, il cervello è stato montato prima secondo un orientamento orizzontale (Figura 2A, B). Un neurone TM20 GFP-etichettati e le ci...

Qui mostriamo come analizzare dendritica instradamento dei neuroni midollo Drosophila in colonne e strati. Il flusso di lavoro comprende una tecnica di imaging dual-view per migliorare la qualità delle immagini e strumenti computazionali per tracciare, registrare mandrini dendritiche alla matrice di colonna di riferimento e per analizzare le strutture dendritiche nello spazio 3D.

Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è analizzare il routing dendritico dei neuroni della lamina del drosophila melanogaster adulto all'interno di colonne e strati, al fine di caratterizzare i modelli dendritici, determinare i tipi cellulari in base alla morfologia e identificare mutanti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come la mappatura della circuitria cerebrale e la comprensione del meccanismo di connessione dei dendriti. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella capacità di tracciare le proprietà dendritiche nello spazio tridimensionale, migliorando così la comprensione della logica e delle funzioni del cablaggio dendritico.Lo scopo di questa procedura è acquisire due serie di immagini dei neuroni di interesse in due orientamenti ortogonali, orizzontale e frontale. Utilizzando tecniche standard, colorare i cervelli di moscerino dissezionati con anticorpo primario coniglio anti-GFP e un anticorpo che etichetta gli assoni dei fotorecettori. Successivamente, etichettare gli anticorpi primari con anticorpi secondari fluorescenti e chiarificare il cervello in glicerolo al 70% e PBS 1X.Per montare il

analyzing-dendritic-morphology-in-columns-and-layers

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Numerosi studi recenti hanno identificato mutazioni di proteine ​​sinaptiche associate a patologie cerebrali. Colture di neuroni corticali primarie offrono una grande flessibilità in sede di esame gli effetti di queste malattie proteine ​​associate spine dendritiche sulla morfologia e la motilità.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

I neuroni sensoriali arborizzazione dendritica...

Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

Presentiamo un protocollo che permette di visualizzare e valutare quantitativamente la morfologia dell'albero dendritico delle cellule di Purkinje singole coltivate in culture fetta organotipiche cerebellari. Questo protocollo ha lo scopo di promuovere gli studi sui meccanismi di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje.

L&#39;analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

Fonte: Ting, C., et al., Analisi della morfologia dendritica in colonne e strati. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra la procedura di preparazione di un cervello di Drosophila, l'acquisizione di pile di immagini orizzontali e frontali di dendriti midollari marcati con GFP sotto un microscopio confocale e la creazione di una ricostruzione 3D per analizzare la loro morfologia attraverso strati e colonne.

Analisi della morfologia dendritica negli strati e nelle colonne di Drosophila medulla

Descriviamo due metodi per la visualizzazione e la quantificazione dell'arborizzazione dendritica nell'ippocampo di modelli murini: imaging in tempo reale e con profondità di campo estesa. Mentre il primo metodo consente un sofisticato tracciamento topografico e la quantificazione dell'estensione della ramificazione, il secondo consente una rapida visualizzazione dell'albero dendritico.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Questo protocollo è centrato sull'analisi quantitativa della complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila, che può essere utilizzato per gli studi della morfogenesi dendritica.

Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

Vi presentiamo un protocollo per etichettare e analizzare i neuroni piramidali, che è fondamentale per valutare potenziali alterazioni morfologiche nei neuroni e nelle spine dendritiche che possono essere alla base di anomalie neurochimiche e comportamentali.

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

La morfologia dendritica neuronale è spesso alla base della funzione. In effetti, molti processi patologici che influenzano lo sviluppo dei neuroni si manifestano con un fenotipo morfologico. Questo protocollo descrive un metodo semplice e potente per analizzare i pergole dendritiche intatte e le loro spine associate.

Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing

Presentato è uno strumento computazionale che consente la misurazione automatica semplice e diretta degli orientamenti dei rami dendritici neuronali da immagini di fluorescenza 2D.

Identificazione automatica dei rami dendritici e loro orientamento

Le spine dendritiche sono compartimenti post-sinaptici della maggior parte delle sinapsi eccitatorie. Le alterazioni della morfologia della colonna vertebrale dendritica si verificano durante lo sviluppo neurologico, l'invecchiamento, l'apprendimento e molti disturbi neurologici e psichiatrici, sottolineando l'importanza di un'analisi affidabile della colonna vertebrale dendritica. Questo protocollo descrive la quantificazione della morfologia della spina dendritica in modo accurato e...

Quantificazione della spina dendritica utilizzando un software di ricostruzione automatica dei neuroni tridimensionali

Scopri l'analisi computazionale della morfologia dendritica in colonne e strati utilizzando tecniche di imaging dual-view su neuroni della medulla di Drosophila. Questo metodo avanzato migliora la comprensione del cablaggio cerebrale.

Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

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