Name: Luso di unanalisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Scopri un biosensore conduttimetrico basato su β-lattamasi ibrida per rilevare interazioni antigene-anticorpo. Questo metodo misura il rilascio di protoni per studiare interazioni biomolecolari in modo rapido ed economico.

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Gli autori riconoscono la regione vallona del Belgio, nel quadro dei progetti di ricerca SENSOTEM e NANOTIC nonché la nazionale fondi per la ricerca scientifica (f.r.s.-F.N.R.S) per il loro sostegno finanziario.

1. preparazione del campione proteina
<ol><li>Produrre e purificare la proteina ibrida BlaP-cabina-Lys3 come riportato nel nostro precedente studio15. Memorizzare la proteina in 50 mM tampone fosfato pH 7.4 con la seguente composizione: 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 disciolto in 800 mL di acqua distillata difficoltà il pH della soluzione a 7.4 prima regolazione del volume finale della soluzione a 1 L. filtro sterilizzare la soluzione della proteina.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di gallina albume lisozima (HEWL). Sciogliere 100 mg (40.000 unità/mg) di HEWL acquistato in commercio in 10 mL di soluzione fisiologica di tampone fosfato (PBS Vedi punto 2.1.1). Sterilizzare la soluzione della proteina di filtrazione con filtri con un cutoff di 0.22 μm.</li>
</ol>2. biosensore saggi
<ol><li>
Preparazione soluzione e buffer
	<ol>
<li>Preparare 50 mM PBS sciogliendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4e 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH 7.4 con 1 N HCl o NaOH N 1 prima di regolare il volume della soluzione a 1 L. filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare una soluzione di saturazione/blocco da sciogliere 3 g di idrolizzato di caseina in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare una soluzione di associazione sciogliendo 1 g di idrolizzato di caseina in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare una soluzione di lavaggio (0.1% Tween - PBS) aggiungendo 100 μL di Tween 20 (100%) in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare una soluzione di preparazione dell'elettrodo (1% Triton X-100-PBS) aggiungendo 1 mL di Triton X-100 (100%) in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare una soluzione di rigenerazione di elettrodo (3.5 M KCl) sciogliendo 26 g di KCl in acqua distillata fino ad un volume finale 100 mL. Filtro sterilizzato e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare una 5 mM NaCl soluzione sciogliendo 0,29 g di NaCl in acqua distillata ad un volume finale di 1 L. filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. Quindi, preparare una soluzione di rilevamento (4 mM benzilpenicillina) sciogliendo 26,7 mg di benzilpenicillina in 20 mL di soluzione NaCl di 5 mM. Filtro sterilizzare e conservare a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rigenerazione e preparazione del sensore Nota: Il polyaniline rivestito sensore chip sono stati sviluppati e gentilmente fornito da Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof. ssa Y. Glupczynski (cattolico Università di Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La descrizione del sensore, nonché i protocolli di electro-polimerizzazione polyaniline utilizzati per sintetizzare questi sensori sono dettagliati nel loro precedente lavoro17. Brevemente, questo sistema utilizza sensori riutilizzabili di otto chip individuali che sono state prodotte da tecniche di classico circuito stampato (PWB). Singolo chip sono composti da tre elettrodi macchie tonde. Quella in alto è l'elettrodo di lavoro il quale polyaniline era electro-sintetizzato. Quella centrale è l'elettrodo di riferimento e l'elettrodo inferiore costituisce il controelettrodo. Il riferimento sia gli elettrodi contatore sono funzionalizzati con amalgama di Ag/AgCl solido sopra lo strato di carbonio.<ol>
<li>Effettuare 3 lavaggi degli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione di preparazione di elettrodi (Vedi Triton X-100-PBS, 1% passo 2.1.5.). Eseguire ogni lavaggio per 2 min con miscelazione delicata a temperatura ambiente.</li>
		<li>Sciacquare gli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di acqua distillata per 2 min con miscelazione delicata a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rigenerare gli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione di rigenerazione (3.5 M KCl, vedi punto 2.1.6) overnight a 4 ° C o 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Effettuare 3 lavaggi degli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato (v. punto 2.1.1). Eseguire ogni lavaggio per 2 minuti con miscelazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di associazione eseguita sul sensore
	<ol>
<li>Cappotto HEWL sulla superficie dell'elettrodo PANI (polianilina) depositando una goccia di 15 µ l di 40 µ g/mL HEWL preparato in PBS sulla superficie dell'elettrodo. Incubare per una notte a 4 ° C o 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Eseguire tre lavaggi degli elettrodi con soluzione salina tampone fosfato (Vedi punto 2.1.1) immergendo le parti elettrodo dei chip sensore nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato. Eseguire ogni lavaggio per 2 min con miscelazione delicata a temperatura ambiente.</li>
		<li>Saturare gli elettrodi con l'aggiunta di una goccia di 50 µ l di soluzione bloccante (Vedi punto 2.1.2) sulla superficie dell'elettrodo. Incubare per 1 h a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte come descritto nel precedente passo (vedere il punto 2.3.2).</li>
		<li>Diluire la soluzione di BlaP-cabina-Lys3 a 20 µ g/mL in soluzione di associazione (Vedi punto 2.1.3) e applicare una goccia di 15 µ l di questa soluzione diluita sugli elettrodi. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la reazione antigene-nanobody, lavare tre volte come descritto nel passaggio precedente utilizzando la soluzione di lavaggio (Vedi punto 2.1.4). Quindi sciacquare l'elettrodo una volta con PBS (Vedi punto 2.1.1).</li>
		<li>Per il rilevamento, collegare il chip sensore tramite la parte di circuiti di rame di un multimetro digitale. Quindi, avviare la risposta del sensore applicando una goccia di 50 µ l di soluzione di rilevamento (Vedi punto 2.1.7) sugli elettrodi positivi e applicando una goccia di 50 µ l di soluzione di NaCl 5 mM sugli elettrodi negativi (Vedi punto 2.1.7). Incubare per 30 min a temperatura ambiente. Monitorare la conduttanza con un multimetro digitale. Nota: Il multimetro è stato fornito da Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof. ssa Y. Glupczynski (cattolico Università di Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Questo potenziostato è controllato dal computer tramite una porta USB e analizza le otto diversi chip del sensore simultaneamente. Il software creato da Yunus e colleghi17 crea un plot in tempo reale che rappresenta le misure della differenza conduttanza tra gli elettrodi di riferimento e campione contro il tempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li>
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<li>Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+BYG+Carba+Test%2C+a+New+Electrochemical+Assay+for+Rapid+Laboratory+Detection+of+Carbapenemase-Producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).</li>
<li>Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+under+electrical+stimulation+of+neural+probe+coated+with+polyaniline%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).</li>
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<li>Khatkhatay, M. I., Desai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+performances+of+four+enzymes+used+in+ELISA+with+special+reference+to+beta-lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay%22%5BJournal%5D)">A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase.</a> J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).</li>
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<li>Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+allosteric+protein+switches+by+domain+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Engineering allosteric protein switches by domain insertion.</a> Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).</li>
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<li>Zhang, D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+and+bioelectronics+on+smartphone+for+portable+biochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection.</a> Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).</li>
<li>Nemiroski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+mobile+electrochemical+detector+designed+for+use+in+resource-limited+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.gsma.com/connectedliving/wp-content/uploads/2013/06/Socio-economic_impact-of-mHealth_EU_14062013V2.pdf">Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union</a>. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo lavoro presentiamo un metodo per funzionalizzare un nanobody utilizzando il β-lactamase BlaP come una proteina carrier e mostriamo che possiamo implementare con successo la proteina ibrida risultante in un'analisi di sensore potenziometrico. L'aspetto di innovazione principale del nostro lavoro rispetto ad altri dosaggi di biosensore è l'accoppiamento covalente della parte dell'anticorpo per l'attività enzimatica che genera il segnale elettrico. Questa tecnologia di inserimento della cosiddetta proteina present...

Biosensori sono dispositivi analitici che combinano un'interazione bio-molecolari con dispositivi di segnalazione fisiche o chimiche denominate trasduttori1. Segnali registrati possono quindi essere interpretati e convertiti per monitorare le interazioni tra i partner immobilizzati e gratuiti. La maggior parte dei biosensori implicano l'uso di un anticorpo per rilevare analiti come ormoni o agente patogeno differente marcatori2. Formati di sensore diverso possono essere utilizzati e includono biosensori basati su massa, magnetici, ottici o elettrochimici. Quest'ultimo è tra i più comuni sensori utilizzati e funzione di conversione di un evento di associazione in un segnale elettrico. Le prestazioni e la sensibilità di tutti i biosensori basati su anticorpi sono fortemente dipendenti essenzialmente due parametri: i) la qualità dell'anticorpo e ii) le proprietà del sistema utilizzato per generare il segnale2.
Gli anticorpi sono proteine dimeriche massa molecolarità (150 – 160 kDa) che sono composte da due catene pesanti e due catene leggere. L'interazione tra le catene leggere e pesanti per la maggior parte è stabilizzata da interazioni idrofobiche, come pure un legame disolfuro conservato. Ogni catena include un dominio variabile che interagisce con l'antigene essenzialmente tramite tre regioni ipervariabili denominato complementari determinare regioni (CDR1-2-3). Nonostante i numerosi progressi nel settore, l'espressione su larga scala di anticorpi full-length con sistemi di espressione di basso costo (ad es., Escherichia coli) spesso porta alla produzione di proteine instabili e aggregate. Ecco perché vari frammenti di anticorpo sono stati progettati come catena singola variabile frammenti3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Sono costituiti da domini variabili di rispettivamente uno pesante e uno catene leggere che sono legati covalentemente da una sequenza di amminoacido sintetico. Tuttavia, questi frammenti spesso visualizzare una scarsa stabilità e hanno la tendenza ad aggregare, poiché espongono una grande parte delle loro regioni idrofobiche a solvente4. In questo contesto, frammenti di anticorpo camelide singola catena, indicati come nanobodies o VOX, sembrano essere ottime alternative a ScFvs. Questi domini corrispondono ai domini variabili degli anticorpi di camelide catena singola. In contrasto con gli anticorpi convenzionali, camelide anticorpi sono privi di catene chiare e contengono solo due catene pesanti5. Pertanto, nanobodies sono i frammenti di anticorpo monomerico più piccoli (12 kDa) in grado di legarsi a un antigene con un'affinità simile a quella di anticorpi convenzionali6. Inoltre, presentano una maggiore stabilità e solubilità rispetto ad altri anticorpi Full-Length o frammenti di anticorpo. Infine, le piccole dimensioni e loro estesi cicli CDR3 permettono loro di riconoscono epitopi criptici e si legano a siti attivi dell'enzima7,8. Al giorno d'oggi, questi domini stanno ricevendo una notevole attenzione e sono stati combinati per la tecnologia dei biosensori. Ad esempio, Huang et al. hanno sviluppato un biosensore basato su nanobody per la rilevazione e la quantificazione di umano antigene prostatico specifico (PSA)9.
Come sopra accennato, un parametro importante nelle analisi di biosensore è l'efficienza del sistema utilizzato per generare il segnale elettrico. Per questo motivo, biosensori elettrochimici basati su enzima hanno attirato l'attenzione crescente e sono stati ampiamente utilizzati per varie applicazioni quali sanità, sicurezza alimentare e monitoraggio ambientale. Questi biosensori affidano l'idrolisi catalitica di un substrato di un enzima per generare il segnale elettrico. In questo contesto, β-lattamasi sono stati indicati per essere più specifici, più sensibile e più facile da implementare sperimentalmente rispetto a molti altri enzimi come la fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano10. Β-lattamasi sono enzimi che sono responsabili della resistenza batterica agli antibiotici β-lattamici idrolizzando li. Sono monomerici, molto stabile, efficiente e di piccole dimensioni. Inoltre, gli inserimenti di dominio/peptide in β-lattamasi generano proteine chimeriche bi-funzionali che sono state indicate per essere strumenti efficaci per studiare le interazioni proteina-ligando. Infatti, recenti studi hanno dimostrato che inserimento di variabile frammenti anticorpali nei risultati del β-lactamase TEM1 in una proteina chimerica che rimane in grado di legarsi con alta affinità per l'antigene bersaglio. È interessante notare che, l'associazione dell'antigene è stato indicato per indurre la regolazione allosterica di TEM1 attività catalitica11,12. Inoltre, abbiamo dimostrato in diversi studi che l'inserzione di dominio della proteina in un ciclo permissivo del Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase genera proteine chimeriche funzionali che ben si adattano per monitorare le interazioni proteina-ligando13 ,14. Recentemente abbiamo inserito un nanobody, denominato cAb-Lys3, in questo sito di inserimento permissiva di BlaP15. Questo nanobody è stato indicato da associare alla gallina albume lisozima (HEWL) e di inibire la sua attività enzimatica16. Abbiamo mostrato che la proteina ibrida generato, denominata BlaP-cabina-Lys3, mantenuto un'alta specificità / affinità contro HEWL mentre l'attività β-lactamase è rimasto invariato. Poi con successo abbiamo combinato la tecnologia di β-lactamase ibrida di un biosensore elettrochimico e ha mostrato che la quantità di segnale elettrico generato era dipendente dell'interazione tra BlaP-cabina-Lys3 e HEWL immobilizzati su un elettrodo. Infatti, l'idrolisi degli antibiotici β-lattamici BlaP induce un rilascio di protoni che può essere convertito in un segnale elettrico quantitativo. Questa combinazione della tecnologia ibrida β-lactamase con un biosensore elettrochimico è veloce, sensibile e quantitativa e permette di misurare in tempo reale il segnale generato. Questa metodologia è descritto qui.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2</sotto>PO<sotto>4</sotto></td><td>Sigma-Aldricht</td><td>V000225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>1551128</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris&ndash; HCl</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>alanina</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>HClO4</td><td>Fluka</td><td>34288</td><td>1M HClO4 soluzione, distributore : Sigma-Aldricht</td></tr><tr><td>caseina idrolizzato</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>22090</td><td></td></tr><tr><td>benzilpenicillina sodica</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>B0900000</td><td></td></tr><tr><td>lisozima albume d'uovo di gallina</td><td>Roche</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>eptano</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di idrossido di ammonio</td><td>Sigma-Aldricht 380539</td><td></td><td>28% NH3&nbsp; in H2O, purificato mediante doppia distillazione (concentrato?)</td></tr><tr><td>Materiali di consumo da laboratorio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657165</td><td>CELLSTAR 6 pozzetti Piastra</td></tr> <tr><td>EquipmentMisuratore di</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pH</td><td>WTW</td><td>1AA110</td><td>Misuratore di pH da laboratorio inoLab pH 7110</td></tr><tr><td>Sistema di vuoto e filtrazione</td><td>Nalgene</td><td>NALG300-4100</td><td>Portafiltri con ricevitore, distributore:</td></tr><tr><td>chip</td><td></td><td></td> sensore potenziometrico VWR <td>prodotti da Yunus e colleghi (ref 16)</td></tr><tr><td>PGSTAT30 Autolab</td><td>Metrohm Autolab</td><td></td><td>fuori produzione, successore Autolab PGSTAT302N</td></tr><tr><td>multimetro digitale, METRAHit 22M</td><td>Gossen Metrawatt</td><td></td><td>fuori produzione, successore Metrahit Base</td></tr></tbody></table>

l'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensori stanno diventando sempre più importante e implementata in vari campi quali rilevamento del patogeno, diagnosi molecolare, monitoraggio ambientale e controllo della sicurezza alimentare. In questo contesto, abbiamo usato il β-lattamasi come enzimi reporter efficiente in diversi studi di interazione proteina-proteina. Loro capacità di accettare gli inserimenti di peptidi o proteine/domini strutturati fortemente incoraggia inoltre l'uso di questi enzimi per generare proteine chimeriche. In uno studio recente, abbiamo inserito un frammento di anticorpo di singolo dominio il Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Questi piccoli domini, chiamati anche nanobodies, sono definiti come i domini di antigene-leganti degli anticorpi di singola catena da camelidi. Come comune doppia catena anticorpi, essi mostrano elevata affinità e specificità per i loro obiettivi. La proteina chimerica risultante ha esibito un'alta affinità contro il bersaglio mantenendo l'attività β-lattamasi. Ciò suggerisce che le moiety nanobody e β-lactamase rimangono funzionali. Nel lavoro attuale, segnaliamo un protocollo dettagliato che combina il nostro sistema di β-lactamase ibrido per la tecnologia dei biosensori. Il grippaggio specifico di nanobody al suo target può essere rilevato grazie a una misurazione conduttimetriche dei protoni rilasciato dall'attività catalitica dell'enzima.

Design e ingegneria della proteina chimerica BlaP-cabina-Lys3
Figura 1 rappresenta l'inserimento di cabina-Lys3 in un ciclo permissivo della BalP classe A β-lactamase da Bacillus licheniformis. L'inserimento è stato effettuato fra i residui Asp198 e Lys199. Un sito di clivaggio della trombina è stata introdotta su ciascun lato della cabina-Lys3. Cellule trasformate con un plasmide di espressione costitutiva che codifica pe...

In questo lavoro, segnaliamo un nuovo metodo per studiare le interazioni proteina-proteina usando un biosensore conduttimetriche basato sulla tecnologia ibrida β-lattamasi. Questo metodo si basa sul rilascio di protoni all'idrolisi di β-lattami.

L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

L'obiettivo generale di questo saggio con biosensore condimetrico è rilevare interazioni biomolecolari, utilizzando la tecnologia ibrida della beta-lattamasi. Descriviamo un metodo per rilevare interazioni tra anticorpi e antigeni, impiegando una proteina chimerica di beta-lattamasi. Il principio di questo metodo si basa sul rilevamento del legame mediante la misurazione del rilascio di protoni derivante dall'attività della beta-lattamasi.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai tradizionali immunosensori è l'uso di una beta-lattamasi chimerica, che permette di effettuare saggi analitici più economici e rapidi mediante una proteina ibrida per rilevare gli analiti. La procedura sarà illustrata da Mathieu Dondelinger, un ricercatore laureato. Iniziare questa procedura con la preparazione del campione proteico e delle soluzioni, come descritto nel protocollo testuale. Preparare l'elettrodo riutilizzabile immergendo le punte in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di soluzione per la preparazione dell'elettrodo, per due minuti, con mescolamento delicato a temperatura ambiente.Ripetere questo passaggio tre volte. Quindi, risciacquare

the-use-lactamase-based-conductimetric-biosensor-assay-to-detect

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Descriviamo un metodo di analisi sensore elettrochimico per la rilevazione rapida di batteri e di identificazione. Il saggio comporta una serie di sensori funzionalizzato con DNA oligonucleotide sonde di cattura per RNA ribosomiale (rRNA) sequenze specie-specifici. Sandwich ibridazione del target rRNA con la sonda di cattura e di una perossidasi-coniugati DNA sonda rivelatore oligonucleotide rafano produce una corrente amperometrico misurabile.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Fonte: Barber, A. E., et al. Preparazione e applicazione di un nuovo biosensore batterico per la rilevazione presuntiva di residui di arma da fuoco. J. Vis. Exp. (2019).Questo video mostra la rilevazione di analiti specifici utilizzando un biosensore batterico. Viene prelevata una coltura batterica che trasporta un plasmide con un gene della proteina fluorescente rossa (RFP) sotto un promotore sensibile all'analita. Dopo aver pulito accuratamente la superficie del test, una piccola sezione...

Rilevamento di un analita target utilizzando un biosensore batterico

Questo video mostra un test di biosensore conduttimetrico per studiare l'interazione di un anticorpo con un antigene bersaglio immobilizzato su un chip trasduttore. Il biosensore è progettato per avere una proteina chimerica bifunzionale, un enzima β-lattamasi con un sito catalitico funzionale fuso a un nanocorpo per legarsi all'antigene bersaglio immobilizzato. Dopo il legame, l'idrolisi catalitica di un substrato antibiotico da parte dell'enzima β-lattamasi genera un segnale elettrico,...

Saggio con biosensore conduttimetrico basato su β-lattamasi per le interazioni proteina-proteina

Acquisita la resistenza agli antibiotici è un problema sanitario pubblico ed è attualmente classificato dall'OMS come una delle più grandi minacce alla vita umana. Qui si descrive l'uso della tecnologia a sbalzo per quantificare la resistenza antibatterica, fondamentale per la scoperta di nuovi farmaci e potenti contro multidrug batteri resistenti.

Nanomeccanica di interazioni farmaco-bersaglio e di rilevamento di resistenza antibatterica

I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε.

Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

Descriviamo qui Protocolli per la misurazione di anticorpo-antigene affinità e cinetica usando quattro piattaforme biosensore comunemente utilizzati vincolante.

Determinazione di alta affinità antigene-anticorpo cinetica del legame con quattro piattaforme biosensore

Una piattaforma di biosensore microfluidica è stata progettata e fabbricato con tecnologia photoresist film asciutto low-cost per la quantificazione rapida e sensibile di vari analiti. Questo sistema monouso consente la lettura elettrochimica di on-chip-immobilizzata analisi enzima-collegata mediante la tecnica della stop-flow.

Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione delle molecole abbondanti bassi in soluzioni complesse utilizzando molecolare imprinting in combinazione con un biosensore di capacitanza.

Ultrasensibile rilevazione di biomarcatori utilizzando un Imprinting molecolare basato biosensore capacitivo

Qui presentiamo un protocollo per controllare il montaggio e lo smontaggio della tossina antrace tramite interferometria biolayer (BLI). A seguito di montaggio/smontaggio sulla superficie del biosensore, i complessi di grande proteina vengono rilasciati dalla superficie per la visualizzazione e l'identificazione dei componenti dei complessi utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa, rispettivamente.

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

Questo articolo descrive un protocollo per lo studio delle interazioni DNA-proteina utilizzando un sistema di interferometria a biostrato (BLI) basato su streptavidina. Delinea i passaggi e le considerazioni essenziali per l'utilizzo della cinetica di legame di base o avanzata per determinare l'affinità di legame all'equilibrio (KD) dell'interazione.

Analisi delle interazioni DNA-proteina con l'interferometria a biostrato basata su streptavidina

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standard ad alta produttività per lo screening dei microrganismi industriali. Consiste nella costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi ARTP, nell'esecuzione di screening positivo delle gocce con microfluidica automatizzata, e successivamente nella verifica dei risultati. L'affidabilità del flusso di lavoro è stata convalidata tramite lo screening di ceppi ad alta resa di B. coagulans .

Screening ad alta produttività dei mutanti di Bacillo coagulante iperproduttore di acido lattico L-lattico utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce

Scopri un biosensore conduttimetrico basato su β-lattamasi ibrida per rilevare interazioni antigene-anticorpo. Questo metodo misura il rilascio di protoni per studiare interazioni biomolecolari in modo rapido ed economico.

L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

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