L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

L'obiettivo generale di questo test con biosensore conduttimetrico è quello di rilevare le interazioni biomolecolari, utilizzando la tecnologia ibrida beta-lattamasi. Descriviamo un metodo per rilevare le interazioni anticorpo-antigene, utilizzando una proteina chimerica beta-lattamasi. Il principio di questo metodo si basa sul rilevamento del legame misurando il rilascio di protoni dell'attività della beta-lattamasi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto agli immunosensori convenzionali è l'uso di una beta-lattamasi chimerica, che rende i saggi sensoriali più economici e veloci utilizzando una proteina ibrida per rilevare gli analiti. A dimostrare la procedura sarà Mathieu Dondelinger, un ricercatore laureato. Iniziare questa procedura con il campione di proteine e la preparazione della soluzione come descritto nel protocollo di testo. Preparare l'elettrodo riutilizzabile immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di soluzione di preparazione dell'elettrodo per due minuti mescolando delicatamente a temperatura ambiente.

Ripeti questo passaggio tre volte. Quindi, sciacquare gli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di acqua distillata per due minuti con una miscelazione delicata a temperatura ambiente. Per rigenerare gli elettrodi, immergere le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di soluzione di rigenerazione durante la notte a quattro gradi Celsius o un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, eseguire tre lavaggi degli elettrodi immergendo le punte in pozzetti di piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di soluzione salina tamponata con fosfato. Eseguire ogni lavaggio per due minuti mescolando delicatamente a temperatura ambiente. Rivestire il lisozima di gallina-albume d'uovo sulla superficie di polianilina dell'elettrodo depositando sulla superficie dell'elettrodo una goccia da 15 microlitri di 40 microgrammi per millilitro di HEWL preparato in tampone fosfato.

Incubare l'elettrodo per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire tre lavaggi degli elettrodi con tampone fosfato immergendo le parti dell'elettrodo dei chip del sensore in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di tampone fosfato. Eseguire ogni lavaggio per due minuti mescolando delicatamente a temperatura ambiente.

Saturare gli elettrodi aggiungendo una goccia da 30 microlitri della soluzione bloccante sulla superficie dell'elettrodo. Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, lavare tre volte come prima.

Diluire le soluzioni BlaP-cAb-Lys3 o BlaP a 20 microgrammi per millilitro nel tampone legante. Quindi, applicare una goccia da 15 microlitri di questa soluzione diluita sugli elettrodi. Incubare gli elettrodi per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo la reazione antigene-nanocorpo, lavare gli elettrodi tre volte con una soluzione di lavaggio. Quindi, lavare gli elettrodi del sensore nel tampone di rilevamento immergendo gli elettrodi in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di tampone di rilevamento. E incubare brevemente per un minuto.

Per il rilevamento, collegare il multimetro digitale al computer. Quindi, collegare il chip del sensore al multimetro digitale tramite la parte del circuito in rame. Avviare la risposta del sensore applicando una goccia da 50 microlitri di soluzione di benzilpenicillina da quattro millimolari sugli elettrodi marcati positivamente.

Applicare una goccia da 50 microlitri della soluzione di rilevamento sugli elettrodi marcati con il negativo per fungere da controllo negativo. Monitorare i valori conduttometrici con il multimetro digitale collegato per 30 minuti. Visualizza i dati in tempo reale direttamente sullo schermo o esporta i dati digitali come file di testo.

Questi dati grezzi possono essere tracciati per creare un output grafico che rappresenta le misure delle variazioni di conducibilità tra l'elettrodo di riferimento e quello del campione in funzione del tempo. Per costruire la proteina chimerica, la beta-lattamasi di classe A BlaP è stata utilizzata come proteina trasportatrice. Qui, i residui catalitici sono presentati in rosso.

Il sito di inserimento situato in un'ansa esposta al solvente è indicato in giallo. Il frammento di anticorpo camelide denominato cAb-Lys3 è stato inserito in BlaP. La proteina chimerica risultante, BlaP-cAb-Lyse3, è in grado di legare HEWL mentre l'attività della beta-lattamasi viene mantenuta.

HEWL è stato immobilizzato su un elettrodo codificato in polianilina prima di caricare BlaP-cAb-Lys3. Il rilascio di protoni durante l'idrolisi della benzilpenicillina da parte della proteina chimerica immobilizzata induce cambiamenti di conducibilità che possono essere interpretati dall'utente. I sensori contengono otto chip organizzati come quattro coppie.

Ogni chip include tre elettrodi, un elettrodo di lavoro rivestito di polianilina, un elettrodo di riferimento e un controelettrodo. Per ogni coppia, il chip etichettato come negativo corrisponde a un controllo negativo, mentre il chip etichettato come positivo corrisponde al campione testato. Qui sono mostrate le misure di conduttanza che mostrano l'interazione specifica di BlaP-cAb-Lys3 con HEWL.

Le variazioni di conducibilità derivano dal rilascio di protoni indotto dall'idrolisi antibiotica da parte della beta-lattamasi chimerica immobilizzata. Non è stato possibile rilevare alcun legame per il controllo negativo, la beta-lattamasi nativa BlaP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 1/2 giornata se eseguita correttamente e le condizioni sperimentali sono ottimizzate.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'inserimento di un frammento di anticorpo in BlaP è impegnativo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità dei dati generati dipenderà dalla funzionalità della beta-lattamasi chimerica. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi che consentono la quantificazione dell'interazione rilevata al fine di determinare la costante di associazione di equilibrio di questa interazione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei biosensori immunitari per esplorare le interazioni molecolari in vari campioni che vanno dagli organismi viventi a diversi ambienti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla rilevazione di numerose biomolecole poiché la tecnologia chimerica della beta-lattamasi è uno strumento versatile per funzionalizzare qualsiasi anticorpo o frammento proteico nella rete. Pertanto, potrebbe essere utilizzato per sviluppare strumenti diagnostici economici e veloci in numerosi campi, come la salute umana e animale.