Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare un epitopo lineare di cellule B riconosciuto da un anticorpo monoclonale, utilizzando proteine ricombinanti troncate in modo progressivo e analisi peptidica mediante ibridazione dot-blot. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardanti l'interazione molecolare tra antigene e anticorpo. I principali vantaggi di questa tecnica sono la semplicità e l'efficienza.

L'epitopo identificato può quindi essere utilizzato in indagini più approfondite, come ad esempio in applicazioni terapeutiche e diagnostiche. A dimostrare la procedura sarà Chien-Wen Chen, un ricercatore post dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare le cellule ibridoma monoclonali murine RGM56 in un mezzo privo di siero ibrido.

Mantenere le colture cellulari in fiaschi T175 a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo cinque giorni di incubazione, raccogliere il mezzo di coltura quando ha assunto un colore giallo e centrifugare il sopranatante a 4.500 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, scartare il pellet di detriti cellulari per ottenere l'anticorpo in soluzione.

Successivamente, aggiungere due millilitri di sospensione al 50% di proteina G agarosica in una colonna da cinque millilitri ed equilibrare la resina con 10 millilitri di PBS ghiacciato, pari a 10 volumi di resina preripartita. Caricare 200 millilitri della soluzione anticorpale precedentemente preparata sulla colonna equilibrata e scartare la frazione che attraversa la colonna. Lavare la colonna due volte utilizzando 10 millilitri di PBS ghiacciato.

Infine, per eluire l'anticorpo dalla resina, aggiungere 10 millilitri di soluzione di glicerina millimolare a pH 2,7 sulla colonna. Raccogliere frazioni da 900 microlitri in provette per microcentrifuga precedentemente riempite con 100 microlitri di buffer di neutralizzazione 10X. Conservare l'anticorpo purificato in soluzione al 50% di glicerolo, integrata con azotide di sodio, a meno 20 gradi Celsius.

Preparare i costrutti e trasformare le cellule E.coli BL21 come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, trasferire una singola colonia in un tubo da 15 millilitri contenente tre millilitri di brodo LB integrato con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina, chiudendo il tubo con un tappo allentato. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 150 RPM.

Monitorare la densità ottica della coltura a 600 nanometri. Quando raggiunge un valore di circa 0,6, raffreddare la coltura a 25 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere IPTG a una concentrazione finale di 0,4 millimolare per indurre l'espressione della proteina ricombinante.

Incubare la coltura per ulteriori quattro ore a 25 gradi Celsius con agitazione a 200 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, trasferire un millilitro della coltura batterica in una provetta per microcentrifuga. Centrifugare le cellule a 12.000 ×g per un minuto e scartare il soprannatante.

Pipettando su e giù con una micropipetta, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di buffer di denaturazione. Mescolare quindi la sospensione ottenuta mediante vortexaggio vigoroso per ottenere un campione pronto all'uso di proteina ricombinante. Per proseguire con l'ibridazione dot-blot, sciogliere ciascun peptide sintetico in DMSO per ottenere soluzioni di 10 milligrammi per millilitro.

Quindi, attivare la membrana in PVDF nel metanolo per due minuti ed equilibrarla con il buffer di Towbin modificato per altri due minuti. Risciacquare un pezzo di carta da cromatografia con il buffer di Towbin modificato e posizionare la membrana in PVDF equilibrata su di esso. Lasciare riposare la membrana fino a quando il buffer non scompare dalla sua superficie.

Utilizzando una punta da 10 microlitri, aggiungere due microlitri di ciascun campione peptidico o proteico ricombinante sulla membrana e lasciare asciugare all'aria per 10 minuti. L'applicazione di un simbolo sulla membrana è il passaggio più critico di questo protocollo. Il caricamento di una quantità precisa di campione in un'area ridotta della membrana in PVDF richiede un'attenzione particolare.

Successivamente, bloccare la membrana in tampone TBST integrato con latte scremato al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata. Diluire l'anticorpo monoclonale RGM56 in tampone TBST integrato con latte scremato al 5%. Aggiungere quindi la soluzione anticorpale alla membrana.

Incubare la membrana a 37 gradi Celsius per un'ora con agitazione delicata. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare la membrana due volte in tampone TBST per cinque minuti con agitazione delicata.

Quindi, aggiungere alla membrana la soluzione dell'anticorpo secondario diluito nel buffer TBST con latte scremato al 5%. Incubare la membrana per un'ora a 37 gradi Celsius con agitazione delicata. Al termine dell'incubazione, scartare la soluzione di anticorpo e lavare la membrana due volte nel buffer TBST per cinque minuti ciascuna con agitazione delicata.

Successivamente, sviluppare la membrana con la soluzione del substrato a temperatura ambiente per 15 minuti al buio. Quando appare il segnale, arrestare la reazione lavando la membrana con acqua bidistillata. Dopo aver asciugato la membrana all'aria, acquisire l'immagine del dot blot mediante un sistema di imaging.

Infine, utilizzando un software di analisi dell'immagine, misurare l'intensità di ciascun punto del dot-blot. Qui viene presentata la proteina completa del virus della necrosi nervosa, costituita dagli amminoacidi da uno a 338, insieme alle sue versioni troncate in serie. Per confermare l'espressione delle proteine nelle cellule batteriche trasformate, è stato eseguito un dot-blot mediante anticorpo anti-6XHis, che ha mostrato la presenza di tutte le proteine oggetto di studio.

Successivamente, le proteine ricombinanti sono state analizzate mediante ibridazione dot-blot utilizzando l'anticorpo monoclonale RG-M56. L'analisi ha rivelato che l'epitopo proteico riconosciuto dall'anticorpo si trova nel peptide compreso tra i residui 195 e 338. Infine, un epitopo costituito da 20 o 8 residui amminoacidici è stato identificato mediante analisi peptidica.

L'analisi con sostituzioni di alanina ha mostrato che le sostituzioni dei residui di valina in posizione 197 e 199, nonché di una cisteina in posizione 201, aboliscono la capacità di legame dell'epitopo e l'ibridazione in dot-blot. Analogamente, una ridotta affinità di legame è stata osservata nell'analisi dell'intensità di legame, confermando che i residui identificati sono essenziali per il legame dell'epitopo con l'anticorpo monoclonale RGM56. Questa tecnica di identificazione di peptidi può essere utilizzata per sviluppare farmaci terapeutici a base di peptidi o medicinali peptidici.