Name: Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Impara a identificare epitopi lineari B-cell con anticorpi monoclonali mediante scanning peptidico e dot-blot hybridization. Questo metodo semplice ed efficiente facilita applicazioni terapeutiche e diagnostiche in immunologia.

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Gli autori ringraziano la signorina Ching-Chun Lin e la signorina Diana Lin della Core Facility dell'Istituto di Biologia Cellulare e Organismica (ICOB) dell'Academia Sinica per aver offerto la loro esperienza rispettivamente sulla sintesi dei peptidi e sul sequenziamento del DNA. Questo studio è stato sostenuto da Academia Sinica.

1. Preparazione di anticorpo monoclonale <ol><li> Cultura i monoclonali murini cellule di ibridoma RG-M56 2 in terreno privo di siero in fiaschi 175T a 37 ° C con 5% di CO 2 supplemento. Raccogliere il surnatante quando il colore del mezzo diventa giallo dopo cinque giorni di incubazione. NOTA: cellule di ibridoma sono state coltivate in terreno privo di siero per evitare la contaminazione di anticorpi da siero bovino fetale. </li><li> Centrifugare il surnatante a 4.500 xg per 30 minuti a 4 ° C e scartare il pellet residui cellulari. </li><li> Aggiungere 2 ml di agarosio proteina G (fornito come un impasto 50%) per una colonna di 5 ml ed equilibrare con 10 volumi di resina (10 ml) di PBS ghiacciato. </li><li> Carico 200 mL del supernatante anticorpi (passo 1.2) sulla colonna e scartare il pass-through. </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS ghiacciato alla colonna di lavarlo. Ripetere due volte. </li><li> Aggiungere 10 ml di 50 mM glicina, pH 2.7 alla colonna per eluire l&#39;anticorpo proteina G-associata. Colnare 900 microlitri frazioni in una provetta contenente 100 ml di 10x tampone di neutralizzazione (1 M Tris, 1,5 M di NaCl, e 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Conservare l&#39;anticorpo purificato nel 50% glicerolo con 0,03% NaN 3 a -20 ° C. </li></ol> 2. Costruzione ed espressione di serie troncati proteine ​​ricombinanti <ol><li> Preparare una miscela di reazione di PCR: 5 ml di 10x tampone Pfu, 0,2 mM di ogni dNTP, 0,2 micron primer forward 3, 0,2 micron inverso Primer 3, 2 mM MgSO 4, 1 ng di pET20b-1A59 DNA 3 plasmide, e 2,5 U ( unità) di polimerasi Pfu DNA; aggiungere DDH 2 O per un volume finale di 50 microlitri. <ol><li> campioni eseguito in un termociclatore automatica utilizzando i seguenti parametri: Ciclo 1 (94 ° C per 5 min); cicli di 2-36 (94 ° C per 30 s, 63 ° C per 30 s, e 72 ° C per 60 s); e il ciclo di 37 (72 ° C per 7 min). </li></ol></li><li> Estrarre la reazione a catena della polimerasi (PCR) prodotti utilizzando un kit di purificazione PCR 5 per facilitare la seguente digestione enzima di restrizione. </li><li> Digerire i frammenti di DNA PCR-amplificato con Nde I e Xho I enzimi di restrizione e legare ciascuno di questi frammenti di DNA in Nde I e Xho I enzima-spaccati PET-20b (+) vettoriale. Trasformare i costrutti in cellule di Escherichia coli DH-5alfa-competente 6. <ol><li> Preparare la miscela di digestione in un tampone di digestione (20 mM Tris-acetato, 10 mM Mg (CH 3 COO) 2, 50 mm KCH 3 COO, e 1 mM DTT, pH 7.9) con 1 mg di DNA PCR-amplificato o PET-20b (+) DNA vettoriale e 2 U di Nde I e Xho I di restrizione enzimi in un volume finale di 20 microlitri. </li><li> Mescolare la miscela di digestione delicatamente e far girare rapidamente verso il basso. Incubare a 37 ° C per 2 ore in un bagno asciutto per garantire il taglio completo della restrizione sedersies. </li><li> Estrarre i frammenti di DNA con enzimi di restrizione digerito usando un kit di purificazione PCR 5 per facilitare la seguente costruzione plasmide. </li><li> Preparare l&#39;impasto legatura in tampone legatura (66 mM Tris, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP, e 5 mm DTT, pH 7,5) con 100 ng di predigerito, DNA PCR-amplificato, 10 ng di predigerito PET-20b (+) DNA vettore, e 5 U di T4 DNA ligasi in un volume finale di 10 microlitri. </li><li> Mescolare il composto legatura delicatamente e girare rapidamente verso il basso. Incubare a 16 ° C per 18 ore in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Mettere 10 ml di campioni legatura in 100 ml di cellule DH-5α-competenti e mescolare delicatamente prima di mettere la provetta in ghiaccio per 30 min. Mettere la provetta in un bagno asciutto a 42 ° C per 90 s per indurre shock termico 7. trasferire immediatamente il tubo sul ghiaccio per 2 minuti. </li><li> Aggiungere 900 ml di Luria-Bertani (LB) brodo (1% Bacto triptone, 0,5% Bacto lievito estrat, e 0,5% NaCl, pH 7,0) al tubo. Incubare a 37 ° C con 150 rpm agitazione per 45 min. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 4.000 x g per 10 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet con 50 ml di brodo LB e diffondere ogni trasformazione su piastre LB pre-riscaldato contenenti 100 mg ampicillina / mL. Incubare le piastre a 37 ° C per 16 h. </li><li> Prendete una singola colonia utilizzando una punta di 200 microlitri e metterlo in 3 ml di brodo LB contenente 100 mg ampicillina / ml in un tubo 15 ml vagamente innevate. Incubare a 37 ° C con 150 rpm agitazione per 12 ore. </li><li> Estrarre il DNA plasmide 8 da ogni cultura e la sequenza usando promotore T7 e primer terminator T7 per confermare la sequenza di 9. </li></ol></li><li> Dopo la conferma di sequenza, di trasformare 10 ng di DNA da questi PET-20b (+) plasmidi con diverse lunghezze del gene della proteina di rivestimento YGNNV nel ceppo BL-21 (DE3) di E. coli da noiing il metodo shock termico 7. Seguire i passaggi 2.3.6-2.3.8 per eseguire la trasformazione. </li><li> Trasferire una singola colonia da ogni trasformata E. coli BL-21 cellule in 3 ml di brodo LB contenente 100 mg ampicillina / ml in un tubo 15 ml vagamente innevate. Incubare la cultura a 37 ° C con agitazione 150 rpm. </li><li> Raffreddare la coltura a 25 ° C quando la OD 600 della coltura è di circa 0,6 e aggiungere IPTG ad una concentrazione finale di 0,4 mM di indurre l&#39;espressione della proteina ricombinante. Incubare la cultura per un extra di 4 ore a 25 ° C con 200 giri al minuto agitazione. </li><li> Trasferire 1 ml di coltura in una provetta. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 12.000 xg per 1 min e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 100 ml di tampone di denaturazione (8 M urea, 20 mM sodio fosfato, e 0,5 M NaCl, pH 7,4) pipettando su e giù con una micropipetta. Mescolare nel vortex vigorosa. NOTA: Il sol campioneutions dovrebbero ora essere semi-trasparente, un po &#39;appiccicoso, e pronto per il saggio di ibridazione dot-blot. </li></ol> 3. Progettazione e sintesi di peptidi sovrapposti <ol><li> Progettazione e sintesi di 3 seriali peptidi 20-mer che ogni sovrapposizione con il suo successore da 10 residui aa dalla regione 195-338 aa della proteina di rivestimento YGNNV per restringere la regione epitopo di RG-M56 mAb da dot blotting. </li><li> Progettazione e sintetizzare peptidi 3 tre 8-Mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, e 199 VLCRWSVR 206) con una sovrapposizione di 6 residui aa sul prossimo peptide sintetico per ridurre l&#39;epitopo regione di 195-206 aa dal dot blotting. </li><li> Progettazione e sintetizzare 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 e 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, e 197 VSVLCR 202), e 5-mer peptidi (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, e 198 SVLCR 202), con una sovrapposizione di 6, 5 e 4 residui aa rispettivamente, sui loro peptidi vicini per minimizzare la regione epitopo dal dot blotting. </li></ol> 4. Dot-blot ibridazione <ol><li> Sciogliere ciascun peptide sintetizzato in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 10 mg / mL. NOTA: Per superare varie solubilità di peptidi sintetici, tutti i peptidi sintetici deve essere sciolto in DMSO. DMSO è un buon solvente per sciogliere completamente peptidi idrofobi o idrofili. </li><li> Immergere la membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) con metanolo per 2 min. NOTA: membrana PVDF è fino a resistente a DMSO 100%; altri possono non essere così. </li><li> Equilibrare la membrana PVDF con buffer modificato Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicina, e 0,1% SDS, pH 8,3) per2 min. NOTA: 10-20% (v / v) di metanolo può essere aggiunto al buffer Towbin modificato per migliorare i risultati di trasferimento. </li><li> Risciacquare un pezzo di carta cromatografica con tampone Towbin modificato. Posizionare la membrana PVDF sulla carta cromatografia. Attendere fino a quando il buffer Towbin modificato è scomparsa dalla superficie della membrana PVDF prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Aggiungere 2 ml di ogni campione peptide alla membrana con una punta di 10 microlitri. Far asciugare la membrana PVDF sulla carta cromatografia per 10 min. Aggiungere ciascun campione peptide lentamente e gradualmente sulla membrana per evitare troppa diffusione. </li><li> Bloccare la membrana in tampone TBST (0,05% (v / v) Tween-20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) con 5% di latte scremato per 30 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente. </li><li> Aggiungere RG-M56 mAb a una diluizione finale di 1: 1.000 in tampone TBST con 5% di latte scremato alla membrana. Incubare la membrana a 37 ° C per 1 ora agitando delicatamente. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo cosìluzione. Lavare la membrana in tampone TBST per 5 minuti agitando delicatamente. Ripetere due volte. </li><li> Aggiungere l&#39;anticorpo secondario (capra anti-IgG di topo, Fc, fosfatasi alcalina coniugata) a una diluizione finale di 1: 5.000 in tampone TBST con 5% di latte scremato alla membrana. Incubare la membrana a 37 ° C per 1 ora agitando delicatamente. </li><li> Scartare la soluzione di anticorpi. Lavare la membrana in tampone TBST per 5 minuti agitando delicatamente. Ripetere la fase di lavaggio due volte. </li><li> Sviluppare la membrana con soluzione di substrato BCIP / NBT a temperatura ambiente per 15 minuti al buio. Arrestare lo sviluppo lavando la membrana con DDH 2 O quando appare il segnale. </li><li> Asciugare la membrana e catturare l&#39;immagine dot-blot utilizzando un sistema di immagini. </li><li> Misurare l&#39;intensità di ogni macchia di punti utilizzando immagine software di analisi 3. </li></ol> 5. alanina scansione e Sostituzione <ol><li> Progettare e sintetizzare 3 alanina e methipeptidi sostituzione onine. Sostituire ogni residuo aa con alanina per la 8-mer peptide 195 VNVSVLCR 202 e sintetizzare peptidi 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, e 195 VNVSVLCA 202 . Sostituire leucina aa residuo 200 a metionina per creare la SJNNV genotipo epitopo peptide 195 VNVSVMCR 202. </li><li> Seguire Sezione 4 per eseguire la scansione e alanina sostituzione mutagenesi puntino assorbente. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo rapporto.

Questo protocollo offre una tecnica rapida e semplice per identificare un epitopo lineare MAB-riconosciuto. Prendendo in considerazione il costo di sintesi peptidica e l&#39;efficienza di produzione di peptidi sintetizzare, la regione antigenica della proteina di rivestimento del virus è stata ridotta di esprimere proteine ​​ricombinanti serialmente tronche prima dell&#39;analisi scansione peptide. Come tale, il sistema affidabile ed efficiente espressione di E. coli pET stato usato per produrre queste proteine...

Nel sistema immunitario, la ricombinazione di segmenti V, D, J e permette agli anticorpi di creare enormi variazioni di complementarietà determinazione regioni (CDR) per il legame ai vari antigeni per proteggere l&#39;host da infezione patogena. La difesa di neutralizzazione degli anticorpi contro gli antigeni dipende dalla complementarità spaziale tra i CDR degli anticorpi e gli epitopi degli antigeni. Pertanto, la comprensione di questa interazione molecolare aiuterà disegno vaccino profilattico e terapeutico sviluppo peptide farmaci. Tuttavia, questa interazione neutralizzazione può essere influenzato sia dalla più domini antigenici da un singolo antigene e da più CDR di anticorpi, che di conseguenza rendono il processo determinazione epitopo più complesso. Fortunatamente, lo sviluppo della tecnologia degli ibridomi, che fonde singole cellule produttrici di anticorpi con cellule di mieloma, consente un lotto costantemente dividendo di cellule secrete un anticorpo specifico, noto come un anticorpo monoclonale (mAb) 1. cellule di ibridoma producono questi puri, ad alta affinità anticorpi monoclonali di legarsi a un singolo dominio antigenica di un antigene specifico. Con il rapporto di antigene-anticorpo stabilito, diversi approcci, tra cui la scansione peptide, può essere utilizzato per determinare l&#39;epitopo di un antigene utilizzando il mAb corrispondente. I recenti sviluppi nella tecnologia peptide sintetico hanno reso la tecnica di scansione peptide più accessibile e più conveniente per effettuare. Brevemente, un insieme di sovrapposizione peptidi sintetici sono prodotti secondo una sequenza antigene bersaglio e sono associate ad una membrana solido supportato per mAb ibridazione. scansione Peptide non solo offre un modo semplice per mappare la regione di legame dell&#39;anticorpo, ma facilita anche aminoacidi (aa) mutagenesi tramite scansione residuo o di sostituzione per valutare l&#39;interazione vincolante tra ciascun residuo aa del peptide epitopo e REC dell&#39;anticorpo. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Qui, il presente studio descrive un protocollo per l&#39;identificazione efficiente della epitopo lineare della proteina di rivestimento giallo cernie virus della necrosi nervosa (YGNNV) utilizzando un neutralizzante mAb 2, 3, 4. Il protocollo include mAb la preparazione, la costruzione e l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti in serie tronche, sintetico disegno peptide sovrapposizione, dot-blot ibridazione, la scansione alanina, e la sostituzione mutagenesi. Considerando il costo elevato di sintesi peptidica, la fase di troncare serialmente le proteine ​​ricombinanti di una proteina bersaglio desiderato è stato modificato, e la regione antigenica è stata ridotta a circa 100 a 200 residui aa prima dell&#39;esecuzione del sintetico matrice peptide analisi dot-blot.

<table><tbody><tr><td>Ibrido-SFM medio</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbeccos (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu DNA polimerasi&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EP0502&nbsp;</td><td>Compresi i buffer</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>compresi i tamponi</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Compresi i tamponi</td></tr><tr><td>XhoI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Compresi i tamponi</td></tr><tr><td>pET-20b (+) vettore</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739<</td><td></td></tr><tr><td>em>E. coli DH-5&alpha; cellula competente</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL-21 (DE3) cellula competente</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>Brodo LB&nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>Isopropiltio-beta;-D-tiogalattoside (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Poliossietilene 20 Monolaurato di sorbitano (Tween-20)</td><td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-topo di capra, anticorpo frammento Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (fluoruro di polivinilidene, PVDF)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>proteina G Agarosio Flusso rapido</td><td>Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit di purificazione</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 Sistema di immagini</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi VisionWorks LS Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore MyCycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione di un epitopo lineare b-cell monoclonale riconosciuto peptide scansione-assistito

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

L&#39;identificazione di un epitopo antigenico da parte del sistema immunitario permette la comprensione del meccanismo di protezione di anticorpi neutralizzanti che possono facilitare lo sviluppo di vaccini e farmaci peptidici. scansione Peptide è un metodo semplice ed efficace che mappa semplicemente l&#39;epitopo lineare riconosciuto da un anticorpo monoclonale (mAb). Qui, gli autori presentano una metodologia di determinazione epitopi che coinvolge le proteine ​​ricombinanti in serie tronche, design peptide sintetico, e dot-blot ibridazione per il riconoscimento antigenico di proteina di rivestimento del virus della necrosi nervoso utilizzando un anticorpo monoclonale neutralizzante. Questa tecnica si basa sulla ibridazione dot-blot di peptidi sintetici e mAbs su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF). La regione minima antigenica di una proteina di rivestimento virale riconosciuta dalla RG-M56 mAb può essere ridotto passo-passo guarniti mappatura peptide su un peptide epitopo 6-mer. Inoltre, la scansione alanina mutagenesi e residui subsostituzioni con può essere effettuata per caratterizzare il significato di legame di ogni residuo di amminoacido costituente l&#39;epitopo. I residui che fiancheggiano il sito epitopi sono stati trovati a svolgere un ruolo critico nella regolazione del peptide conformazione. Il peptide epitopo identificata può essere usato per formare cristalli di epitopi complessi peptide-anticorpo per uno studio x-ray diffrazione e la concorrenza funzionali, o terapeutica.

L&#39;obiettivo di questo esperimento è stato quello di identificare un epitopo attraverso dot assorbente con anticorpo monoclonale. Per restringere rapidamente ed efficientemente giù regione antigenica riconosciuto dal mAb, l&#39;intera lunghezza e proteine di rivestimento ricombinante YGNNV serialmente troncati con un tag di fusione 6xHis al C-terminale sono stati espressi da un sistema di espressione di E. coli PET 10 (Figura 1A). Le p...

Qui, gli autori presentano un protocollo semplice ed efficiente per definire un epitopo antigenico lineare utilizzando un anticorpo monoclonale purificato e la scansione dei peptidi attraverso l'ibridazione dot-blot. L'epitopo identificato può quindi essere utilizzato in applicazioni terapeutiche e diagnostiche.

Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare un epitopo lineare di cellule B riconosciuto da un anticorpo monoclonale, utilizzando proteine ricombinanti troncate in modo progressivo e analisi peptidica mediante ibridazione dot-blot. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardanti l'interazione molecolare tra antigene e anticorpo. I principali vantaggi di questa tecnica sono la semplicità e l'efficienza.L'epitopo identificato può quindi essere utilizzato in indagini più approfondite, come ad esempio in applicazioni terapeutiche e diagnostiche. A dimostrare la procedura sarà Chien-Wen Chen, un ricercatore post dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare le cellule ibridoma monoclonali murine RGM56 in un mezzo privo di siero ibrido.Mantenere le colture cellulari in fiaschi T175 a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo cinque giorni di incubazione, raccogliere il mezzo di coltura quando ha assunto un colore giallo e centrifugare il sopranatante a 4.500 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, scartare il pellet di detriti cellulari per ottenere l'anticorpo in soluzione.Successivamente, aggiungere due millilitri di sospensione al 50% di proteina G agarosica in una colonna da cinque millilitri ed equilibrare la resina con 10 millilitri di PBS ghiacciato, pari a 10 volumi di resina preripartita. Caricare 200 millilitri della soluzione anticorpale precedentemente preparata sulla colonna equilibrata e scartare la frazione che attraversa la colonna. Lavare la colonna due volte utilizzando 10 millilitri di PBS ghiacciato.Infine, per eluire l'anticorpo dalla resina, aggiungere 10 millilitri di soluzione di glicerina millimolare a pH 2,7 sulla colonna. Raccogliere frazioni da 900 microlitri in provette per microcentrifuga precedentemente riempite con 100 microlitri di buffer di neutralizzazione 10X. Conservare l'anticorpo purificato in soluzione al 50% di glicerolo, integrata con azotide di sodio, a meno 20 gradi Celsius.Preparare i costrutti e trasformare le cellule E.coli BL21 come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, trasferire una singola colonia in un tubo da 15 millilitri contenente tre millilitri di brodo LB integrato con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina, chiudendo il tubo con un tappo allentato. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 150 RPM.Monitorare la densità ottica della coltura a 600 nanometri. Quando raggiunge un valore di circa 0,6, raffreddare la coltura a 25 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere IPTG a una concentrazione finale di 0,4 millimolare per indurre l'espressione della proteina ricombinante.Incubare la coltura per ulteriori quattro ore a 25 gradi Celsius con agitazione a 200 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, trasferire un millilitro della coltura batterica in una provetta per microcentrifuga. Centrifugare le cellule a 12.000 ×g per un minuto e scartare il soprannatante.Pipettando su e giù con una micropipetta, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di buffer di denaturazione. Mescolare quindi la sospensione ottenuta mediante vortexaggio vigoroso per ottenere un campione pronto all'uso di proteina ricombinante. Per proseguire con l'ibridazione dot-blot, sciogliere ciascun peptide sintetico in DMSO per ottenere soluzioni di 10 milligrammi per millilitro.Quindi, attivare la membrana in PVDF nel metanolo per due minuti ed equilibrarla con il buffer di Towbin modificato per altri due minuti. Risciacquare un pezzo di carta da cromatografia con il buffer di Towbin modificato e posizionare la membrana in PVDF equilibrata su di esso. Lasciare riposare la membrana fino a quando il buffer non scompare dalla sua superficie.Utilizzando una punta da 10 microlitri, aggiungere due microlitri di ciascun campione peptidico o proteico ricombinante sulla membrana e lasciare asciugare all'aria per 10 minuti. L'applicazione di un simbolo sulla membrana è il passaggio più critico di questo protocollo. Il caricamento di una quantità precisa di campione in un'area ridotta della membrana in PVDF richiede un'attenzione particolare.Successivamente, bloccare la membrana in tampone TBST integrato con latte scremato al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata. Diluire l'anticorpo monoclonale RGM56 in tampone TBST integrato con latte scremato al 5%. Aggiungere quindi la soluzione anticorpale alla membrana.Incubare la membrana a 37 gradi Celsius per un'ora con agitazione delicata. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare la membrana due volte in tampone TBST per cinque minuti con agitazione delicata.Quindi, aggiungere alla membrana la soluzione dell'anticorpo secondario diluito nel buffer TBST con latte scremato al 5%. Incubare la membrana per un'ora a 37 gradi Celsius con agitazione delicata. Al termine dell'incubazione, scartare la soluzione di anticorpo e lavare la membrana due volte nel buffer TBST per cinque minuti ciascuna con agitazione delicata.Successivamente, sviluppare la membrana con la soluzione del substrato a temperatura ambiente per 15 minuti al buio. Quando appare il segnale, arrestare la reazione lavando la membrana con acqua bidistillata. Dopo aver asciugato la membrana all'aria, acquisire l'immagine del dot blot mediante un sistema di imaging.Infine, utilizzando un software di analisi dell'immagine, misurare l'intensità di ciascun punto del dot-blot. Qui viene presentata la proteina completa del virus della necrosi nervosa, costituita dagli amminoacidi da uno a 338, insieme alle sue versioni troncate in serie. Per confermare l'espressione delle proteine nelle cellule batteriche trasformate, è stato eseguito un dot-blot mediante anticorpo anti-6XHis, che ha mostrato la presenza di tutte le proteine oggetto di studio.Successivamente, le proteine ricombinanti sono state analizzate mediante ibridazione dot-blot utilizzando l'anticorpo monoclonale RG-M56. L'analisi ha rivelato che l'epitopo proteico riconosciuto dall'anticorpo si trova nel peptide compreso tra i residui 195 e 338. Infine, un epitopo costituito da 20 o 8 residui amminoacidici è stato identificato mediante analisi peptidica.L'analisi con sostituzioni di alanina ha mostrato che le sostituzioni dei residui di valina in posizione 197 e 199, nonché di una cisteina in posizione 201, aboliscono la capacità di legame dell'epitopo e l'ibridazione in dot-blot. Analogamente, una ridotta affinità di legame è stata osservata nell'analisi dell'intensità di legame, confermando che i residui identificati sono essenziali per il legame dell'epitopo con l'anticorpo monoclonale RGM56. Questa tecnica di identificazione di peptidi può essere utilizzata per sviluppare farmaci terapeutici a base di peptidi o medicinali peptidici.

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Immunologia e Infezioni

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Impara a identificare epitopi lineari B-cell con anticorpi monoclonali mediante scanning peptidico e dot-blot hybridization. Questo metodo semplice ed efficiente facilita applicazioni terapeutiche e diagnostiche in immunologia.

Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

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