Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare un epitopo lineare di cellule B riconosciuto da anticorpi monoclonali utilizzando proteine ricombinanti troncate in serie e scansione peptidica mediante ibridazione dot-blot. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti l'interazione molecolare tra l'antigene e l'anticorpo. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua semplicità ed efficienza.

L'epitopo identificativo può quindi essere utilizzato in indagini più complete, come nelle applicazioni terapeutiche e diagnostiche. A dimostrare la procedura sarà Chien-Wen Chen, un post-dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, coltiva cellule di ibridoma monoclonale di topo RGM56 in un terreno ibrido privo di siero.

Mantenere le colture cellulari in fiasche da 175 T a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica. Dopo cinque giorni di incubazione, raccogliere il terreno di coltura dopo che è diventato giallo e centrifugare il surnatante a 4.500 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, scartare i detriti delle cellule pellettate per ottenere l'anticorpo in soluzione.

Quindi, aggiungere due millilitri di agro sliterry al 50% di proteine G a una colonna da cinque millilitri ed equilibrare la resina con 10 millilitri di PBS ghiacciato, pari a 10 volumi di resina precaricata. Caricare 200 millilitri della soluzione anticorpale precedentemente preparata sulla colonna equilibrata e scartare la frazione che passa attraverso la colonna. Utilizzando 10 millilitri di PBS ghiacciato, lavare la colonna due volte.

Infine, per estrarre l'anticorpo dalla resina, aggiungere alla colonna 10 millilitri di soluzione di glicerina millimolare a pH 2,7. Raccogliere 900 frazioni di microlitri in provette da microcentrifuga precedentemente riempite con 100 microlitri di tampone di neutralizzazione 10X. Conservare l'anticorpo purificato in una soluzione di glicerolo al 50% integrata con sodio azide a meno 20 gradi Celsius.

Preparare i costrutti e trasformare le cellule di E.coli BL21 come descritto nel protocollo di testo. Quindi, trasferire una singola colonia in una provetta da 15 millilitri contenente tre millilitri di brodo LB integrato con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina e tappare liberamente la provetta. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 150 giri/min.

Monitorare la densità ottica della coltura a 600 nanometri. Quando raggiunge circa 0,6, raffreddare la coltura a 25 gradi Celsius. Quindi, aggiungere IPTG a una concentrazione finale di 0,4 millimolari per indurre l'espressione della proteina ricombinante.

Incubare la coltura per altre quattro ore a 25 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min. Dopo l'incubazione, trasferire un millilitro della coltura batterica in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare le cellule a 12.000 volte G per un minuto ed eliminare il surnatante.

Pipettando su e giù con una micropipetta, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di tampone di denaturazione. E mescolare la sospensione risultante mediante vortice vigoroso per ottenere un campione di proteina ricombinante pronto all'uso. Per procedere con l'ibridazione dot-blot, sciogliere ogni peptide sintetico in DMSO per ottenere soluzioni da 10 milligrammi per millilitro.

Quindi, attivare la membrana PVDF in metanolo per due minuti ed equilibrarla con il tampone Towbin modificato per altri due minuti. Sciacquare un pezzo di carta per cromatografia con tampone Towbin modificato e stendere su di esso la membrana PVDF bilanciata. Lascia riposare la membrana fino a quando il tampone scompare dalla sua superficie.

Utilizzando una punta da 10 microlitri, aggiungere due microlitri di ciascun campione di peptide o proteina ricombinante sulla membrana e lasciarla asciugare all'aria per 10 minuti. Individuare un simbolo sulla membrana è il passaggio più critico di questo protocollo. Il caricamento di una quantità precisa di campione su una piccola area della membrana in PVDF richiede un'attenzione particolare.

Successivamente, bloccare la membrana nel tampone TBST integrato con latte scremato al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente. Diluire l'anticorpo monoclonale RGM56 in tampone TBST integrato con latte scremato al 5%. E aggiungi la soluzione di anticorpi alla membrana.

Incubare la membrana a 37 gradi Celsius per un'ora agitando delicatamente. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale. E lavare la membrana due volte nel tampone TBST per cinque minuti agitando delicatamente.

Quindi, aggiungere alla membrana la soluzione dell'anticorpo secondario diluito in tampone TBST con il 5% di latte scremato. Incubare la membrana per un'ora a 37 gradi Celsius agitando delicatamente. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione anticorpale e lavare la membrana nel tampone TBST due volte per cinque minuti agitando delicatamente.

Quindi, sviluppare la membrana con la soluzione di substrato a temperatura ambiente per 15 minuti al buio. Quando appare il segnale, fermare la reazione lavando la membrana con acqua distillata doppiamente. Dopo aver asciugato la membrana all'aria, acquisire l'immagine del punto macchiato utilizzando un sistema di imaging.

Infine, utilizzando un software di analisi delle immagini, misurare l'intensità di ogni punto macchiato. Qui viene presentata la proteina codice del virus della necrosi nervosa a lunghezza intera che comprende gli amminoacidi da uno a 338 insieme alle sue varianti troncate in serie. Per confermare l'espressione delle proteine nelle cellule batteriche trasformate, è stata eseguita l'analisi dot-blot utilizzando anticorpi anti-6XHis che ha mostrato la presenza di tutte le proteine in esame.

Quindi, le proteine ricombinanti sono state analizzate mediante ibridazione dot-blot in cui è stato utilizzato l'anticorpo monoclonale RG-M56. L'analisi ha rivelato che l'epitopo proteico riconosciuto dall'anticorpo si trova nel peptide da 195 a 338. Infine, un epitopo costituito da 20 o otto residui di amminoacidi è stato identificato mediante scansione peptidica.

La scansione dell'alanina ha mostrato che le sostituzioni di residui di valina nelle posizioni 197 e 199 e di una cistina a 201 hanno abolito la capacità di legare l'epitopo e l'ibridazione dot-blot. Allo stesso modo, la diminuzione dell'affinità di legame è stata osservata nell'analisi dell'intensità di legame, confermando che i residui identificati sono essenziali per il legame dell'epitopo all'anticorpo monoclonale RGM56. Questa tecnica di identificazione dei peptidi può essere utilizzata per sviluppare farmaci peptidici terapeutici o farmaci peptidici.