Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire schiume reticolate non chimicamente o micro vettori derivati da matrici extracellulari specifiche per applicazioni in modelli 3D di colture cellulari in vitro o come scaffold pro-rigenerativi in sistemi di rilascio cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia cellulare applicata e dell'ingegneria tissutale, come ad esempio il modo in cui il microambiente cellulare 3D media la funzione cellulare e la rigenerazione dei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la fabbricazione di scaffold con geometrie regolabili che imitano la composizione nativa della ECM specifica del tessuto e sono stabili in coltura a lungo termine senza ulteriori reticoli.

Dopo aver liofilizzato la ECM derivata dal tessuto secondo il protocollo di testo, utilizzare forbici chirurgiche affilate per tritare finemente il tessuto decellularizzato. Per criomacinare il tessuto lavorato, riempire una camera di macinazione in acciaio inossidabile da 25 millilitri per un sistema di macinazione a sfere da laboratorio con ECM liofilizzata tritata e aggiungere due sfere di macinazione in acciaio inossidabile da 10 millilitri. Chiudere e immergere completamente la camera di macinazione carica in azoto liquido per tre minuti.

Quindi macinare il campione congelato a 30 Hertz per tre minuti. Ripetere l'immersione in azoto liquido e la macinazione fino a quando l'ECM non viene macinato in una polvere fine. Pesare 250 milligrammi di ECM tritata o criomacinata e trasferirla in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Aggiungere cinque millilitri di tampone NaH2PO4 molare a 22 molari alla provetta da centrifuga e segnare il livello del liquido sulla provetta. Quindi preparare una soluzione madre di alfa amilasi aggiungendo 7,5 milligrammi di alfa amilasi a un millilitro di tampone NaH2PO4 molare a 22 molari. Quindi, aggiungere al campione 100 microlitri della soluzione madre di alfa amilasi.

Quindi aggiungere 22 molari di NaH2PO4 per ottenere un volume finale di 10 millilitri. Agitare continuamente la sospensione a 300 giri/min e temperatura ambiente per 72 ore. Centrifugare la sospensione a 1500 volte G per 10 minuti.

Raccogliere ed eliminare con cura il surnatante senza disturbare il pellet ECM digerito. Quindi utilizzare 10 millilitri di NaCl al cinque percento diluito in acqua distillata doppia per risospendere il materiale pellettato e agitare continuamente per 10 minuti a 300 giri/min. Ripetere il lavaggio altre due volte prima di utilizzare 10 millilitri di acqua distillata doppia per risospendere il pellet.

Quindi agitare continuamente la sospensione a 300 giri/min a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo aver centrifugato nuovamente il campione, raccogliere ed eliminare con cura il surnatante senza disturbare il pellet ECM digerito. Aggiungere 2 molari di acido acetico al segno di cinque millilitri.

E vortice. Quindi agitare continuamente le sospensioni a 120 giri/min e 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, utilizzando un omogeneizzatore portatile dotato di una sonda a dente di sega larga 10 millimetri, omogeneizzare la sospensione ECM a temperatura ambiente a intervalli di 10 secondi fino a quando non rimangono frammenti visibili.

Posizionare la sospensione in un becher di acqua fredda tra gli intervalli di omogeneizzazione per evitare il surriscaldamento. Incubare la sospensione ECM a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 120 giri/min fino a quando la sospensione non è calda. Quindi utilizzare 2 molari di acido acetico per diluire la sospensione del campione alla concentrazione desiderata.

Con una siringa da tre millilitri e un ago calibro 18, riempire lo stampo desiderato con la sospensione ECM. Le schiume possono essere fabbricate in una gamma di geometrie a seconda della forma dello stampo. Coprite e congelate gli stampini a meno 20 o meno 80 gradi centigradi.

Inserite quindi gli stampini in un pallone liofilizzatore. Collegare il pallone al sistema di liofilizzazione da laboratorio e asciugare gli stampi per 24 ore o fino a completa asciugatura. Incubare la sospensione ECM criofresata con agitazione continua a 100 giri/min durante la notte.

Caricare tre millilitri di sospensione ECM in una siringa luer lock da tre millilitri e collegare un set per infusione alato sul foro della siringa. Fissare la siringa all'interno della pompa-siringa. Quindi fissare l'ago a un supporto per storta e posizionare la punta dell'ago verticalmente a una distanza di quattro o sei centimetri dalla parte superiore di un pallone Dewar a forma bassa.

Quindi collegare un elettrodo a coccodrillo alla punta dell'ago, assicurandosi anche che la clip a coccodrillo sia collegata al terminale positivo dell'alimentatore ad alta tensione. Piegare una striscia di carta stagnola sul bordo del pallone aspirante. Quindi collegare un secondo elettrodo a coccodrillo al bordo esterno della lamina.

Collegarlo al terminale della fonte di terra dell'alimentatore. Riempire il pallone Dewar con azoto liquido a circa un centimetro dall'alto in modo che tre quarti della pellicola siano sommersi. Quindi impostare la pompa a siringa su una velocità di infusione di 30 millilitri all'ora e spruzzare i campioni secondo il protocollo di testo.

Una volta completata l'infusione, versare con cura l'azoto liquido in eccesso dal Dewar, lasciando il micro vettore sospeso in circa 25 millilitri di azoto liquido per assicurarsi che rimangano congelati. Trasferire immediatamente i micro carrier con azoto liquido in una provetta centrifugata da 50 millilitri versando con un movimento regolare. Quindi usa una Scoopula per raccogliere tutti i micro portatori congelati rimasti nel Dewar.

Aggiungeteli anche alla centrifuga. Per prepararsi alla liofilizzazione, coprire la provetta da centrifuga con un foglio di alluminio forato con piccoli fori. Mettere le provette da centrifuga coperte in un pallone liofilizzatore.

Quindi collegare immediatamente il pallone al liofilizzatore e asciugare i campioni durante la notte. Trasferire delicatamente la schiuma liofilizzata in una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente un eccesso di etanolo assoluto. Allo stesso modo, risospendere i micro vettori liofilizzati in eccesso di etanolo assoluto all'interno della provetta da centrifuga originale utilizzata per la raccolta.

Utilizzando una pipetta sierologica, filtrare i micro supporti attraverso un setaccio inossidabile con una dimensione delle maglie definita in una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri per rimuovere eventuali aggregati e selezionare gli intervalli di dimensioni desiderati. Incubare il campione a quattro gradi Celsius per quattro ore o fino a quando la schiuma o i micro supporti non si sono depositati sul fondo della provetta da centrifuga. Quindi, sotto una cappa a flusso laminare con tecnica asettica, utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere l'etanolo assoluto dagli scaffold e aggiungere un eccesso di etanolo al 95% diluito con PBS sterile.

Incubare gli scaffold a quattro gradi Celsius per quattro ore o fino a quando gli scaffold non sono affondati sul fondo del recipiente di reidratazione. Reidratare gradualmente gli scaffold attraverso una serie di etanolo. Ad ogni passaggio, incubare gli scaffold a quattro gradi Celsius fino a quando non affondano sul fondo del recipiente, prima di cambiare la soluzione.

Sostituire il PBS sterile con altri due risciacqui per rimuovere l'etanolo residuo. Conservare i campioni in PBS sterile al 100% a quattro gradi Celsius fino al momento della coltura cellulare. Utilizzare gli scaffold entro una o due settimane dalla reidratazione.

Di seguito sono riportati alcuni esempi dei tipi di schiume derivate dalla ECM e di micro carrier fabbricati utilizzando tessuto adiposo decellularizzato. Tessuto dermico suino decellularizzato e ventricolo sinistro decellularizzato suino. La dimostrazione delle tecniche può essere applicata per generare bio-scaffold tessuto-specifici utilizzando una varietà di tessuti decellularizzati come fonti di ECM.

Dopo la criomacinazione o la macinazione, la digestione enzimatica e l'omogeneizzazione, i campioni possono essere dispensati in una ciotola prima del congelamento e della liofilizzazione. Questa cifra rappresenta schiume fresate reidratate DAT, DDT e DLV, sintetizzate in uno stampo per piastre di coltura tissutale a 48 pozzetti. Queste schiume DAT, DDT e DLV sono state fabbricate con ECM criofresata a una concentrazione di 35 milligrammi per millilitro e una temperatura di congelamento di meno 80 gradi Celsius.

Per fabbricare micro carrier derivati dalla ECM utilizzando una tecnica di elettrospruzzatura, per ogni sorgente ECM è possibile regolare la concentrazione della sospensione, la velocità di infusione e la tensione dell'ago per generare micro carrier sferici discreti di diametro compreso tra 350 e 500 micrometri dopo la reidratazione controllata. Infine, i micro portatori DAT, DDT e DLV mostrati qui da SEM rivelano che le dimensioni della struttura ultra possono variare a seconda della sorgente ECM decellularizzata. I metodi presentati in questo video possono essere utilizzati per fabbricare una vasta gamma di micro vettori e schiume specifici per i tessuti, costituiti da ECM pura e non chimicamente reticolata utilizzando tessuto decellularizzato come fonte di matrice.

Seguendo queste procedure, le schiume e i micro vettori possono essere seminati con cellule in condizioni statiche o dinamiche e possono essere applicati come substrato istruttivo per colture cellulari in vitro e applicazioni in vivo.