Name: Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Impara a sintetizzare schiume e microcarrier derivati dalla matrice extracellulare senza reticolazione chimica per colture cellulari 3D e applicazioni rigenerative. Questo metodo consente geometrie personalizzabili.

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Il Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada e il Canadian Institutes of Health Research (CIHR) hanno fornito finanziamenti per questo lavoro. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Amin Rizkalla per l'uso del suo sistema di elettrospruzzatura, la Nanofabrication Facility presso la Western University per l'uso di apparecchiature di imaging SEM, il Mount Brydges Abattoir per la fornitura di campioni di tessuto suino e i dottori Aaron Grant, Brian Evans e Robert Richards per le loro collaborazioni cliniche a sostegno di questa ricerca.

1. Elaborazione tessuto decellularizzato <ol><li> Decellularization e liofilizzazione <ol><li> tessuto Decellularize (s) di interesse a seguito di un protocollo stabilito. NOTA: Ponteggi in questo studio sono stati preparati seguendo protocolli decellularizzazione pubblicati per DAT umano 28, DDT porcina 8, e suina DLV 32. Disponibile in commercio, collagene insolubile può anche essere usato per fabbricare schiume e microcarriers, come il collagene provenienti da tendine bovino, che è stato usato con successo su un intervallo di concentrazione di 10 - 50 mg / mL. Altre fonti di collagene insolubili possono essere utilizzati, ma possono richiedere ottimizzazione per individuare l&#39;intervallo di concentrazione che produrrà impalcature stabili. </li><li> Trasferire il tessuto decellularizzato idrato o collagene purificato in una provetta da centrifuga 50 con una pinza e aggiungere sufficiente acqua distillata doppia (DDH 2 O) immergere il tessuto, toa volume massimo totale di 35 ml. </li><li> Congelare il campione una notte a -80 ° C, con la provetta in posizione orizzontale durante il congelamento per massimizzare l&#39;area di superficie per sublimazione durante la successiva liofilizzazione. </li><li> Rimuovere il tappo dalla provetta e trasferire il campione congelato in un vaso liofilizzazione. </li><li> Lyophilize campione utilizzando un laboratorio liofilizzatore per 48 - 72 ore o fino a quando completamente asciugato. NOTA: Il tempo di asciugatura può variare per diversi liofilizzatori e tessuti decellularizzato. </li><li> Finemente tritare l&#39;ECM liofilizzata in piccoli pezzi (~ 1 - 2 mm 3) usando forbici chirurgiche affilate. </li><li> Conservare l&#39;ECM tritata in un essiccatore fino al momento per ulteriori elaborazioni. NOTA: Si raccomanda che l&#39;ECM tritato essere utilizzato immediatamente per evitare l&#39;assorbimento di umidità dall&#39;ambiente. </li></ol></li><li> Cryomilling (facoltativo per schiuma fabbricazione) <ol><li> Riempire un acciaio inossidabile camera di macinazione 25 mL di laboratoSistema ry ball mulino con ECM liofilizzato macinate e aggiungere due sfere in acciaio inox fresatura 10 mm. </li><li> Chiudere e completamente immergere la camera di macinazione caricata in azoto liquido per 3 min. </li><li> Mill il campione congelato per 3 minuti a 30 Hz (1.800 rpm). </li><li> Ripetere i punti 1.2.2 e 1.2.3 finché l&#39;ECM è macinato in una polvere fine. NOTA: Il numero di volte in cui questi passaggi devono essere ripetuti può variare tra le sorgenti ECM. Ad esempio, DAT genere richiede 3 cicli di fresatura per generare una polvere fine. </li><li> Trasferire la polvere utilizzando uno scoopula in una fiala di vetro, sigillare ermeticamente, e memorizzare in un essiccatore. </li></ol></li><li> Preparazione ECM Sospensione <ol><li> Pesare 250 mg di ciascuna macinata (per schiume) o cryomilled (per schiume o microcarriers) ECM e trasferirlo in una provetta da centrifuga 15. Fare riferimento al punto 1.1.6 e 1.2 per la preparazione di ECM macinate e ECM cryomilled, rispettivamente. NOTA: Questo protocollo è progettato per preparare 50 mg / mL ECM suspenSion, che è raccomandato per DAT umana, DDT suina e suina DLV. A seconda della fonte ECM specifico, sospensioni uniformi possono essere generati a concentrazioni iniziali superiori o inferiori. </li><li> Aggiungere 5 ml di 0,22 M NaH 2 PO 4 (pH 5.4) tampone nella provetta da centrifuga e segnare il livello del liquido sul tubo. </li><li> Preparare una soluzione madre α-amilasi aggiungendo 7,5 mg di α-amilasi di 1 mL 0,22 M NaH 2 PO 4 (pH 5,4) tampone. Aggiungere 100 ml di soluzione madre α-amilasi (0,75 mg di α-amilasi; 0.3% w / w di tessuto secco) al campione. Aggiungere 0,22 M NaH 2 PO 4 per ottenere un volume finale di 10 ml. </li><li> Agitare la sospensione continuo a 300 rpm per 72 ore a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare la sospensione a 1.500 xg per 10 min. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante senza disturbare il pellet ECM digerito. Risospendere il materiale pellettato in 10 mL di NaCl al 5% diluito in DDH 2 O. </li><li> Ripetere passaggio 1.3.5 per un totale di due risciacqui con 5% di NaCl in DDH 2 O. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il materiale pellettato in 10 ml di DDH 2 O. </li><li> Agitare la sospensione continuamente a 300 rpm per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare la sospensione a 1.500 xg per 10 min. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante senza disturbare il pellet ECM digerito. </li><li> Aggiungere 0,2 M di acido acetico fino alla tacca 5 ml praticato al punto 1.3.2. </li><li> Agitare la sospensione continuo a 120 rpm O / N a 37 ° C. </li><li> Omogeneizzare la sospensione ECM a temperatura ambiente in intervalli di dieci secondi usando un omogeneizzatore portatile dotato di un dente di sega sonda larghezza 10 millimetri finché nessun frammenti visibili rimangono. Posizionare la sospensione in un bicchiere di acqua fredda tra gli intervalli di omogeneizzazione per evitare il surriscaldamento. NOTA: A seconda della sorgente ECM, ulteriore diluizione in 0,2 M di acido acetico può essere richiesto per ottenere una sospensione omogenea. Eraffreddamento xcessive della sospensione ECM può comportare un aumento della viscosità che può interferire con omogeneizzazione efficiente. Se viene rilevato un aumento della viscosità, il campione può essere rewarmed a 37 ° C e sottoposto a ulteriore lavorazione. </li><li> Conservare a 4 ° C per un massimo di un mese prima della schiuma o microsupporto fabbricazione. </li></ol></li></ol> 2. Fabrication Schiuma ECM-derivato <ol><li> Incubare la sospensione ECM dal passaggio 1.3.13 (macinate o cryomilled) a 37 ° C con agitazione a 120 rpm continua fino a quando la sospensione è caldo. </li><li> Diluire la sospensione ECM in 0,2 M acido acetico alla concentrazione desiderata. NOTA: A seconda della sorgente ECM, schiume stabili può essere preparato nel range di 10 - 100 mg / ml, con il 15 - 50 mg / ml come nei limiti indicati per DAT, DDT e DLV. Tipicamente, schiume fabbricate a concentrazioni più elevate saranno leggermente meno porosa ma più stabile in coltura e maneggevole. </li><li> Usando una siringa da 3 ml won un ago da 18 G per evitare la formazione di bolle nella sospensione ECM, riempire lo stampo desiderata con la sospensione ECM. Per fabbricare il DAT, DDT, e schiume DLV, dispensare 400 ml di 35 mg / mL di sospensione ECM in una piastra di coltura trattata cellulare a 48 pozzetti. NOTA: La forma dello stampo selezionato e il volume della sospensione ECM determineranno la geometria della schiuma risultante. </li><li> Coprire e congelare gli stampi durante la notte mettendoli in una -20 ° C o -80 ° C freezer. NOTA: La temperatura di congelamento può influenzare la porosità delle schiume. Pori più grandi sono attesi quando i campioni vengono congelati a -20 ° C rispetto ai -80 ° C a causa della formazione di cristalli di ghiaccio più grandi 33. Per fabbricare schiume con una struttura porosa uniforme, assicurarsi che lo stampo non è in contatto con una superficie conduttiva per evitare il raffreddamento direzionale. </li><li> Posizionare gli stampi contenenti i campioni congelati in un pallone liofilizzatore. Collegare il pallone liofilizzatore alla laboratORY blocco del sistema asciugatrice e asciugare per 24 ore. NOTA: E &#39;importante che il campione rimane congelato prima della liofilizzazione. </li><li> Conservare le schiume liofilizzati in un essiccatore fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Fabrication microcarrier ECM-derivata tramite Electrospraying NOTA: Una panoramica del electrospraying set è mostrato in Figura 2. <ol><li> Incubare la sospensione ECM cryomilled dal punto 1.3.13 a 37 ° C con agitazione continua a 100 rpm O / N. NOTA: Cryomilled ECM viene utilizzato per fabbricare i microcarriers ECM-derivati ​​per garantire una maggiore uniformità nella sospensione e prevenire intasamento durante electrospraying. </li><li> Carico 3 mL di sospensione ECM in una serratura mL Luer della siringa 3 allegando infusione alato impostare sul foro della siringa. NOTA: Una serie di misuratori dell&#39;ago può essere utilizzato, riconoscendo che la selezione può influenzare la dimensione e la forma dei microcarriers risultanti. per fabricate le microcarriers DAT, DDT, e DLV, utilizzare un ago G 25. </li><li> Fissare la siringa all&#39;interno della pompa a siringa. Fissare l&#39;ago a un supporto storta e posizionare la punta dell&#39;ago verticalmente ad una distanza di 4 - 6 cm dal bordo superiore di un vaso dewar basso modulo (250 - 500 Campo dimensione mL negativa). </li><li> Collegare un elettrodo coccodrillo per la punta dell&#39;ago e collegarlo al terminale positivo di alimentazione ad alta tensione. </li><li> Piegare una striscia di lamina di alluminio (12 x 5 cm) oltre il bordo del contenitore termico. </li><li> Collegare un secondo elettrodo coccodrillo al bordo esterno del foglio e collegarlo al terminale di sorgente massa dell&#39;alimentatore. </li><li> Riempire il vaso dewar con azoto liquido per circa 1 cm dalla parte superiore, in modo che ¾ della lamina è sommerso. NOTA: E &#39;importante mantenere il vaso dewar riempito con azoto liquido. La superficie dell&#39;azoto liquido deve essere inferiore a 2 cm dalla parte superiore del pallone nel procedimento di electrosprayingS. rabbocco continuo dell&#39;azoto liquido è richiesto per mantenere un livello costante durante electrospraying. </li><li> Impostare la pompa a siringa ad una velocità di infusione di 30 ml / h. NOTA: Variando la velocità di infusione può alterare la forma microsupporto e il diametro, ma l&#39;intervallo consigliato è 25 - 35 ml / h. Mentre è fortemente dipendente dalla viscosità della sospensione, le portate inferiori a 25 ml / h può comportare la generazione di microcarriers grandi. A portate molto basse, la dimensione e la forma dei microcarriers possono diventare meno omogenea. Alla velocità di infusione sopra i 35 ml / h, l&#39;uniformità delle goccioline generate tramite electrospraying può essere interrotto, con conseguente microcarriers non sferiche con una distribuzione di dimensione più ampia 34. </li><li> Applicare una tensione di 20 kV e accendere la pompa a siringa per avviare electrospraying. NOTA: La tensione può essere variata per regolare le dimensioni delle microcarriers e tende ad avere un maggiore impatto sul diametro che l&#39;infusioTasso n. L&#39;intervallo di tensione raccomandato è 15 - 25 kV. Una diminuzione del diametro microsupporto è previsto con un aumento della tensione 35. </li><li> Dopo il completamento dell&#39;infusione, accuratamente travasare azoto liquido in eccesso dal Dewar, lasciando le microcarriers sospese in ~ 25 mL di azoto liquido per garantirne la congelati. </li><li> trasferire immediatamente i microcarriers con l&#39;azoto liquido in un tubo da 50 ml centrifuga versando in un movimento uniforme. Raccogliere eventuali microcarriers congelati rimasti nella Dewar con uno scoopula e aggiungerli alla provetta. NOTA: A seconda della dimensione del Dewar, le microcarriers in azoto liquido può essere inizialmente versata in un recipiente di medie dimensioni, e quindi trasferito immediatamente nel tubo da 50 ml per centrifuga. </li><li> Coprire provetta contenente le microcarriers in azoto liquido con un foglio di alluminio perforato con piccoli fori in preparazione per liofilizzazione. </li><li> Posizionare la centrifuga copertotubi in un pallone liofilizzatore. collegare immediatamente il pallone liofilizzatore e asciugare i campioni O / N. NOTA: E &#39;molto importante mantenere i microcarriers sospese in azoto liquido per garantire che non scongelare prima di questa fase, come scongelamento può provocare il collasso e / o aggregazione. DAT, DDT e DLV microcarriers fabbricate ad una concentrazione di 35 mg / ml usando le condizioni electrospraying sopra descritte hanno tipicamente un diametro idratato compresa fra i 350 - 500 um di dimensione. La distribuzione delle dimensioni possono variare a seconda della fonte ECM. </li><li> Conservare le microcarriers liofilizzati in un essiccatore fino al momento dell&#39;uso. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig2.jpg" /> Figura 2. Descrizione generale del Apparato Electrospraying utilizzato in microcarrier Fabrication. A: Immagine che mostra la disposizione delle apparecchiature electrospraying chiave tra cui la pompa a siringae alimentatore ad alta tensione, nonché il posizionamento dell&#39;ago rispetto alla Dewar di azoto liquido. B: Electrospraying schematica, compresi gli intervalli consigliati per la tensione, velocità di infusione, e la distanza. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 4. Schiume Preparazione e microcarriers per colture cellulari <ol><li> reidratazione <ol><li> Trasferire le schiume liofilizzati con pinza in un tubo da 50 ml centrifuga contenente eccesso di etanolo assoluto (~ 99.9%) (~ 5: 1 rapporto di etanolo per schiume). Analogamente, risospendere le microcarriers liofilizzati in eccesso di etanolo assoluto all&#39;interno della provetta originale utilizzato per la raccolta. Usando una pipetta sierologica, filtrare le microcarriers attraverso un acciaio setaccio a maglie di dimensione definita in un nuovo tubo 50 ml centrifuga per eliminare eventuali aggregati e selezionare per intervalli di dimensioni desiderate. NOTA: Se le schiume sono fabbricati all&#39;interno piastre TCP, possono essere reidratati direttamente all&#39;interno di questi vasi. </li><li> Incubare a 4 ° C per 4 ore o fino a quando le schiume o microcarriers hanno gravità depositata sul fondo della provetta. Eseguire tutte le fasi successive in una cappa a flusso laminare sterile utilizzano reagenti e la corretta tecnica asettica. </li><li> Rimuovere l&#39;etanolo assoluto con una pipetta sierologica e aggiungere eccesso (rapporto 5: 1) 95% di etanolo diluito con soluzione salina fosfato sterile tamponata (PBS) per i ponteggi. Incubare a 4 ° C per 4 ore o fino a quando le impalcature ECM-derivati ​​hanno toccato il fondo del recipiente reidratazione. </li><li> Gradualmente reidratare i ponteggi attraverso una serie di etanolo (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 e 0%, diluita con PBS sterile). Ad ogni passo, incubare a 4 ° C fino a quando i ponteggi hanno toccato il fondo del recipiente prima di cambiare la soluzione. Degassare i ponteggi sotto vuoto luce se la formazione di bolle all&#39;interno dei ponteggi è observed. </li><li> Sostituire la PBS sterile per ulteriori due risciacqui per eliminare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Conservare in 100% sterile PBS a 4 ° C fino al momento coltura cellulare. Utilizzare i ponteggi all&#39;interno di 1 - 2 settimane dopo la reidratazione. </li></ol></li><li> Preparazione per Cell semina <ol><li> Il giorno prima della semina, trasferire le schiume con pinze in coltura cellulare trattato bene piastre o inserti transwell e aggiungere terreno di coltura cellulare sufficiente (selezionato in base al tipo di cellula di interesse) per immergere completamente le impalcature (ad esempio, 2,5 mL / scaffold in una piastra 12 pozzetti). Analogamente, consentono ai microcarriers alla gravità depositano all&#39;interno della provetta da centrifuga, attentamente rimuovere il PBS usando una pipetta sierologica senza disturbare i microcarriers, e aggiungere terreno di coltura per ottenere un rapporto 5: 1 di mezzo ai microcarriers. NOTA: per la semina ASC umani, utilizzare mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM): miscela di nutrienti F12 di Ham integrato consiero 10% bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina. </li><li> Sostituire il terreno di coltura cellulare per un totale di un risciacquo. </li><li> Equilibrare la notte ponteggi nel terreno di coltura a 37 ° C. I ponteggi saranno pronti per la semina delle cellule il giorno successivo. NOTA: Le schiume possono essere seminati in staticamente inserti colture cellulari o coltura tissutale piastre a pozzetti 29, o seminate dinamicamente utilizzando un agitatore da laboratorio 36. A seconda della fonte ECM, metodi di lavorazione e la concentrazione della sospensione, semina dinamica può migliorare l&#39;adesione cellulare iniziale, la proliferazione e l&#39;infiltrazione. I microcarriers possono essere seminati dinamicamente utilizzando un sistema di coltura filatore 11. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In generale, bioscaffolds derivati ​​da tessuti decellularizzati possono più strettamente approssimare la composizione 3D complessa e struttura della ECM nel microambiente cellulare nativo rispetto agli scaffold sintetici o modelli di coltura standard basati su 2D TCPS. Come discusso in precedenza, le interazioni cellula-ECM sono criticamente importanti nel mediare comportamento cellulare sia nella cultura e nel corpo 1. Riconoscendo che le proprietà biochimiche, biofisiche, e biomeccaniche del ECM sono unici per ogni tessuto, è sempre più evidente per sostenere le ragioni per l&#39;applicazione di approcci tessuto-specifiche nella progettazione di biomateriali per l&#39;ingegneria dei tessuti, così come nello sviluppo di più fisiologicamente modelli di coltura rilevanti per esperimenti in vitro 20. Utilizzando tessuti decellularizzati come materiale di partenza, i nostri metodi possono incorporare la complessa composizione della ECM specifico tessuto entro più custFormati ponteggi omizable. Mentre le operazioni meccaniche ed enzimatiche di elaborazione si tradurrà in una perdita della ultrastruttura ECM nativa, studi precedenti con DAT hanno dimostrato che gli effetti istruttivi della ECM derivate da tessuto adiposo sono conservati in questi formati impalcatura, suggerendo che la composizione bioscaffold è un mediatore chiave della funzione delle cellule 11, 29. Un significativo vantaggio di utilizzare schiume ECM-derivato e microcarriers come substrati di coltura cellulare rispetto ai tessuti intatti decellularizzati è che sono più omogenea, che può migliorare l&#39;uniformità di distribuzione delle celle e le interazioni cellula-cellula / cellula-ECM. I metodi qui descritti possono essere utilizzati per generare una vasta gamma di bioscaffolds tessuto-specifici per l&#39;uso in applicazioni di coltura cellulare e ingegneria tessutale. Ad esempio, oltre al DAT, DDT, e DLV, il nostro laboratorio ha applicato con successo queste tecniche per generare por 3Dschiume OU utilizzando osso decellularizzato, cartilagine, nucleo polposo, e fibroso, così come disponibile in commercio, collagene insolubile derivato da tendine bovino. Da una prospettiva in vitro, questi bioscaffolds potrebbero essere utilizzati come base per modelli di coltura fedeltà superiore 3D per indagare biologia cellulare, fisiologia o malattia patologia 38, come substrati bioattivi in alto throughput piattaforme di screening farmaco 39, o matrici come istruttivi per stelo differenziazione cellulare 40, 41. DAT, DDT e DLV schiume fabbricate a concentrazioni di 25 - 50 mg / ml sono stabili a lungo termine in coltura in vitro (testato fino a 28 giorni). Inoltre, tutti i tre tipi di microcarriers possono supportare l&#39;adesione cellulare e la proliferazione in condizioni dinamiche in un sistema di coltura filatore bassa potenza di taglio (10 - 15 rpm) per almeno 2 settimane. Per le applicazioni in vivo, il biocompatibile e biodegradable schiume e microcarriers ECM-derivato promettenti come prodotti off the shelf per stimolare rimodellamento tissutale costruttivo e rigenerazione 11, 29. Inoltre, i ponteggi cellule adesive potrebbero essere utilizzati come sistemi di somministrazione di terapia cellulare 42, 43. Come esempio, le schiume DAT hanno mostrato di promuovere l&#39;angiogenesi e adipogenesis quando seminato con ASC allogenici e impiantato per via sottocutanea in un modello di ratto immunocompetente 29. Rispetto al DAT intatto, DAT più elaborato schiume degradata molto più rapidamente, con una riduzione del 50% in volume osservato a 3 settimane come vennero integrati con i tessuti dell&#39;ospite, e quasi totale riassorbimento di 12 settimane. Tuttavia, gli espansi anche indotto una risposta angiogenica più potente, suggerendo che l&#39;ECM enzima digerita avuto effetti unici pro-rigenerative. Analogamente, i microcarriers ECM-derivati possono essere usati come in vitro &lt;/ em&gt; substrati di coltura cellulare nei sistemi di coltura dinamici e veicoli di consegna cella come iniettabili 11, 30, 44. Più specificamente, il piccolo diametro e ampia area superficiale delle microcarriers potrebbe consentire l&#39;erogazione di una grande quantità di cellule in un piccolo volume, pur fornendo una matrice che può aiutare a sostenere la vitalità delle cellule e aumentare la ritenzione delle cellule nel sito di iniezione 30. Prima di utilizzare in qualsiasi sistema vivente, è fondamentale garantire che l&#39;ECM sorgente è sostanzialmente privo di componenti cellulari antigenici e / o reagenti decellularizzazione potenzialmente citotossici che potrebbero innescare una risposta dell&#39;ospite 7 negativo. Pepsina enzima proteolitico è comunemente usato nella preparazione di idrogel ECM-derivato 15. Pepsina è una proteasi non specifico che digerire collagene ed altre proteine ​​ECM into piccoli frammenti 45. Mentre idrogel fabbricati con ECM pepsina-digerito sono stati segnalati per avere effetti di cellule-istruttivo, una limitazione è che questi materiali tendono ad essere estremamente meccanicamente deboli 46. Nel nostro sviluppo iniziale delle microcarriers DAT, abbiamo utilizzato un approccio composito in cui pepsina-digerito DAT è stato combinato con alginato e aggiunta goccia a goccia in CaCl 2 per formare perle sferiche 30. Le perle sono state successivamente foto-reticolato e l&#39;alginato è stato estratto usando il citrato di sodio. Oltre alla necessità di reticolazione chimica, una limitazione chiave era che le microcarriers fabbricati con questo approccio ha avuto scarsa stabilità di sotto di una gamma di dimensioni 900 - 950 um 30. Al posto di pepsina, i metodi qui presentati utilizzano una digestione più lieve della ECM con l&#39;enzima glicolitico α-amilasi, che viene postulato di scindere gruppi carboidrati dalla teloperegioni ptide di collagene, aumentando così la solubilità in acido acetico 37. Questo approccio consente l&#39;isolamento di collagene altamente polimerizzata che può essere utilizzato per generare schiume e microcarriers ECM-derivato puri senza la necessità di reticolazione chimica o altri additivi. Questi bioscaffolds sono stabilizzate mediante interazioni fisiche e legami idrogeno tra fibrille di collagene ben conservati, simile al collagene nel microambiente ECM nativa. Le schiume sono una piattaforma altamente flessibile che può essere fabbricato in un&#39;ampia gamma di geometrie seconda stampo specifico selezionato. Per gli studi di coltura cellulare, gli espansi possono essere colate direttamente TCPs piastre a pozzetti, per formare rivestimenti o ponteggi 3D di vario spessore. Per fabbricare schiume 3D con superfici molto uniformi, si raccomanda che uno stampo personalizzato è progettato che può essere sigillato su entrambi i lati con vetrini plastica o vetro. Sia ECM tritati o cryomilled può essere utilizzato per sintetizzarele schiume. In generale, abbiamo trovato che le schiume cryomilled tendono ad essere macroscopicamente più morbida ed avere un ultrastruttura più perturbato a concentrazioni inferiori 31, 36. A seconda della fonte di tessuto, le fasi di lavorazione meccaniche aggiuntive possono provocare alterazioni della composizione ECM che potrebbe influenzare la funzione delle cellule. Ad esempio, nel nostro lavoro precedente, laminina è stato rilevato in schiume DLV tritate, ma non cryomilled DLV schiume 31. Al contrario, collagene I, collagene IV, laminina, fibronectina e sono stati rilevati sia macinate e cryomilled DAT schiume 36. In aggiunta alle fasi di lavorazione meccanica, la dimensione dei pori e la porosità degli espansi può essere sintonizzata in una certa misura, variando la concentrazione della sospensione ECM e la temperatura di congelamento 47. In generale, schiume concentrazione inferiori (~ 10 - 15 mg / mL) sono qualitativamente più porosa, ma possono contrarsi rapidamente e hanno scarsastabilità a lungo termine cultura 31, 36. Analogamente, un tasso di congelamento lento, tipicamente raggiunti da una temperatura di congelazione superiore, può portare a pori più grandi nelle schiume a causa delle dimensioni dei cristalli di ghiaccio che si formano durante la fabbricazione 29. Tutti questi parametri possono influenzare le interazioni delle cellule con i materiali, tra cui l&#39;attaccamento, l&#39;infiltrazione, e il rimodellamento. Ad esempio, la crescita cellulare in schiume che sono fabbricati con concentrazioni ECM superiori può essere limitata alle zone superficiali, in particolare con sorgenti ECM macinate e in condizioni di coltura statiche 36. Ai microcarriers, i parametri chiave che possono essere regolati sono la concentrazione della sospensione ECM, gauge, e la tensione applicata, con concentrazioni superiori tipicamente cedevole microcarriers che sono più stabili in coltura dinamica a lungo termine. Dopo l&#39;apertura del electrospraying, i suspens ECMgoccioline ioni dovrebbero rientrare rapidamente nel centro del pallone, verso la direzione del collettore foglio di alluminio. Per prevenire l&#39;aggregazione, è importante che le perline contatto con l&#39;azoto liquido prima lamina. La distanza tra l&#39;ago e la superficie del azoto liquido può essere regolata per soddisfare tali requisiti. È importante notare che l&#39;ottimizzazione può essere richiesta a seconda delle caratteristiche delle sorgenti ECM specifico, in particolare nel selezionare un intervallo di concentrazione che genererà bioscaffolds stabili. Un altro fattore chiave è il protocollo decellularization che viene utilizzato per generare i materiali di partenza, come metodi di decellularizzazione che degradano l&#39;ECM o la presenza di reagenti residui (per esempio, tensioattivi) possono avere un impatto negativo sulla stabilità delle schiume risultanti e microcarriers. Se si incontrano problemi con la stabilità bioscaffold, opzioni che possono essere studiati includono l&#39;utilizzo di un processo di reidratazione più graduale, aumentando la sosp ECMconcentrazione ensione, ed esplorare tritata contro ECM cryomilled. Qualora tutte queste opzioni non riescono a risolvere il problema, può essere necessario per esplorare i protocolli di decellularizzazione o fonti alternative ECM. Per garantire la riproducibilità durante la produzione scaffold, particolare attenzione deve essere presa in determinate fasi del protocollo. Quando cryomilling i tessuti decellularizzati, si raccomanda di fresatura essere effettuata immediatamente dopo liofilizzazione in un ambiente secco per ridurre la probabilità di aggregazione delle particelle dovuta all&#39;assorbimento di umidità dall&#39;ambiente. Durante la fabbricazione microcarrier, si suggerisce che la sospensione è electrosprayed in piccoli lotti, con un volume massimo di 3 mL, per evitare problemi con raffreddamento di esempio che possono provocare l&#39;ostruzione dell&#39;ago. Inoltre, è essenziale che i microcarriers non sono autorizzati a scongelare dopo il processo di electrospraying. Per mantenere la loro geometria sferica e stabilità meccanica, il microcarritori devono essere raccolti e azoto liquido, trasportato in un contenitore di liquido riempito di azoto, e subito liofilizzate. Infine, sia per le schiume e microcarriers, è fondamentale che le fasi di reidratazione vengono eseguiti lentamente in un periodo di diversi giorni. reidratazione rapida può provocare collasso strutturale sulla macro e / o micro-scala. Inoltre, reidratazione deve avvenire lentamente per evitare la formazione di piccole bolle d&#39;aria all&#39;interno del ponteggio, che possono richiedere una notevole quantità di tempo degassare sotto vuoto luce. In conclusione, i metodi presentati in questo documento possono essere usati per fabbricare una gamma diversificata di schiume tessuto-specifici e microcarriers compresi pura, ECM non chimicamente reticolato. Un vantaggio per i ricercatori biologici è che i bioscaffolds sono facili da maneggiare e possono essere elaborati in modo simile ai tessuti durante l&#39;esecuzione di analisi con tecniche quali saggi istologia, immunoistochimica, o genica e proteica.Inoltre, i ponteggi ECM derivate possono essere enzimaticamente degradata estrarre popolazioni di cellule seminate o possono essere usati direttamente come veicoli di consegna cellule biodegradabili e biocompatibili. Nel complesso, questa tecnologia piattaforma flessibile detiene grande utilità per numerose applicazioni, tra cui per studi su colture cellulari in 3D che indagano la funzione delle cellule, come substrati di espansione delle cellule, e bioscaffolds come pro-rigenerative.

La matrice extracellulare (ECM) è composto da una complessa rete 3D di proteine, glicoproteine e polisaccaridi 1. Una volta considerato come un quadro prevalentemente strutturale, è ormai ampiamente riconosciuto che l&#39;ECM incorpora una gamma diversificata di molecole bioattive con importanti ruoli funzionali 2. Interazioni cellula-ECM possono dirigere la sopravvivenza cellulare, adesione, la migrazione, la proliferazione e la differenziazione 3. Mentre le principali classi di macromolecole ECM sono generalmente ben conservate di tutti i tessuti e specie, ogni tessuto ha una composizione di matrice unica e l&#39;architettura 4. Nel complesso, l&#39;ECM tessuto-specifica fornisce un microambiente istruttivo che media funzione dal subcellulare alla scala tessuti / organi 5. A causa del ruolo critico della ECM nel mediare la funzione cellulare, c&#39;è stato un crescente interesse per la deluppo di bioscaffolds ECM di derivazione per applicazioni in ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. In particolare, il metodo di decellularization è stata ampiamente studiata come un mezzo per ottenere ECM da una vasta gamma di tessuti da utilizzare come materiale per ponteggi rigenerazione dei tessuti e la consegna cellule 5, 6, 7. Decellularization genere comporta una serie di, chimiche, meccaniche e modulazione / o biologici trattamento mirato a rimuovere cellule e componenti cellulari, pur determinando ideale alterazioni minime alla struttura 3D e la composizione della ECM 8. Attraverso rilevamento letteratura, vari protocolli decellularizzazione possono essere identificati per virtualmente ogni tessuto del corpo 7. Mentre i tessuti decellularizzati possono essere usate direttamente come supporti impiantabili o substrati di coltura cellulare 3D, infiltrazione cellulare puòessere limitato nei tessuti con una struttura densa ECM 9. Inoltre, l&#39;eterogeneità naturale nella ECM può causare variabilità nella adesione cellulare e la distribuzione all&#39;interno delle matrici decellularizzati, che potrebbero influire sul risposta cellulare 10. Nel complesso, mentre promettente per alcune applicazioni, applicando tessuti decellularizzati nella loro forma intatta offre scarsa versatilità in termini di proprietà di sintonizzazione ponteggio compresa la forma, porosità e rigidità, nonché le modalità di consegna per applicazioni in vivo. Per aggirare queste limitazioni, numerosi gruppi di ricerca stanno applicando ulteriori metodi di elaborazione per generare formati ponteggio personalizzati utilizzando tessuti decellularizzati come materiale di base. Nella forma più semplice, ciò può comportare cryomilling tessuti decellularizzati per generare particelle ECM tessuto-specifici iniettabili 11. Queste particelle ECM possono essere incorporati come una cellula-instrucomponente ctive in scaffold compositi con altri biomateriali, come in situ reticolazione idrogel 12, 13, 14. Oltre alle lavorazioni meccaniche, tessuti decellularizzato possono anche essere sottoposti a digestione enzimatica con proteolitica e / o enzimi glicolitici per fabbricare idrogel ECM-derivati, schiume, microcarriers e rivestimenti 15, 16, 17, nonché per sintetizzare bioinks per stampa 3D 18. Oltre alle applicazioni di ingegneria tissutale, bioscaffolds ECM-derivati tengono un grande potenziale per la generazione di una maggiore fedeltà modelli in vitro per la ricerca biologica. C&#39;è un forte bisogno di sviluppare sistemi di coltura cellulare 3D che meglio ricapitolano il microambiente cellulare nativo 19. La maggior parte in vitro cell cultura studi fino ad oggi sono condotti in coltura tissutale polistirene (TCPS), che ha scarsa correlazione con l&#39;ambiente cellulare biologicamente complesso e dinamico trovati nei tessuti viventi 20. Mentre conveniente per studiare le interazioni cellulari all&#39;interno di un ambiente controllato, coltivando cellule su questi substrati rigidi 2D semplificate altera l&#39;adesione cellulare e la morfologia, così come sia cellula-cellula e cellula-ECM INTERAZIONI 21, 22. Gli adattamenti cellulari osservati in 2D TCPS possono influire segnali intracellulari che regolano le funzioni cellulari diversi, tra cui la sopravvivenza, proliferazione, migrazione e differenziazione, sollevano questioni di pertinenza di studi 2D nella modellazione sistemi in vivo 23. C&#39;è stato un crescente riconoscimento che il comportamento cellulare può variare notevolmente in 2D rispetto ai sistemi 3D 24, e che la biochimica e bisegnalazione omechanical con l&#39;ECM sono mediatori chiave di funzione delle cellule 25. Molti gruppi hanno tentato di superare i limiti dei sistemi 2D stabiliti mediante rivestimento TCPS con componenti ECM come il collagene, laminina, fibronectina e. Mentre queste strategie in grado di migliorare l&#39;adesione delle cellule e possono alterare le risposte cellulari, questi modelli rimangono limitati dalla loro configurazione 2D che non imitano la complessa organizzazione spaziale o la biochimica del ECM nativa 26, 27. Il nostro laboratorio di bioingegneria si è interessata allo sviluppo di bioscaffolds ECM-derivati ​​come substrati per applicazioni di coltura cellulare e ingegneria tessutale 3-D. In particolare, abbiamo sperimentato l&#39;uso di tessuto adiposo decellularizzato (DAT) come tavola per ponteggio per la rigenerazione adiposo 28. Inoltre, abbiamo stabilito metodi per sintetizzare microcarriers 3D e schiume porose usando DAT digeriti con pepsina enzima proteolitico o enzima glicolitico α-amilasi 29, 30, 31. In particolare, abbiamo dimostrato in tutti questi formati scaffold che l&#39;ECM adiposo derivata fornisce un microambiente induttivo per la differenziazione adipogenica di cellule umane derivate da tessuto adiposo gambo / stromali (CSA) in coltura. Più recentemente, abbiamo deciso di metodi di fabbricazione per produrre schiume 3D porosi suina α-amilasi digeriti decellularizzato ventricolo sinistro (DLV) (metodi decellularizzazione adattati da Wainwright et al. 32), e dimostrato che prevedono la piattaforma di supporto per indurre cardiomyogenic presto espressione marcatore in pericardio umani ASC grassi di derivazione 31. Questo articolo descrive in dettaglio i metodi per la sintesi non chimicamente reticolate schiume porose 3D microcarriers derivati ​​puramenteda ECM α-amilasi digeriti per uso come 3D biologicamente complesso in substrati di coltura cellulare in vitro e come biomateriali per la rigenerazione tissutale. In teoria, qualsiasi sorgente ECM contenente collagene alto peso molecolare può essere usato come materiale di partenza per queste tecniche. Per dimostrare la flessibilità di questo approccio, i metodi sono stati applicati per generare bioscaffolds tessuto-specifici utilizzando DAT umana, porcina decellularizzato tessuto dermico (DDT) 8, e porcina DLV come esempi rappresentativi. Figura 1 fornisce una visione d&#39;insieme del processo di fabbricazione per le schiume e microcarriers ECM-derivato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig1.jpg" /> Figura 1. Descrizione del metodo per la produzione di schiume e microcarriers ECM-derivato tessuto-specifici. Decelerazione 1. tessuti decellularizzato, preparato seguendo stabilitaprotocolli lularization, possono essere utilizzati per tessuto-specifica ECM derivato bioscaffold fabbricazione. Immagini macroscopiche sono mostrati di idrato DAT umana (preparato come descritto Flynn 2010 28), DDT porcina (preparato come descritto Reing, JE, et al. 2010 8), e suini DLV (preparati come descritto in Wainwright et al. 2010 32 ), come esempi rappresentativi di fonti ECM che possono essere utilizzati come materiali di partenza. Barre di scala rappresentano 3 cm. 2. I tessuti decellularizzati vengono liofilizzati, e quindi macinate 3. meccanicamente. Barre di scala rappresentano 1 cm. 4. L&#39;ECM macinate può quindi essere cryomilled, che è opzionale per la schiuma fabbricazione, ma necessaria per la sintesi microsupporto. bar scala rappresenta 3 mm. 5. L&#39;ECM macinate o cryomilled viene poi digerito con α-amilasi e omogeneizzata per creare una sospensione omogenea ECM. bar scala rappresenta 1 cm. <strong&gt; 6a) Per schiuma realizzazione, la sospensione ECM viene trasferita in un definito dall&#39;utente stampo, congelato e liofilizzato per generare uno scaffold 3D poroso con una geometria ben definita. bar scala rappresenta 1 cm. 6b) Per la realizzazione microcarrier, la sospensione ECM cryomilled è electrosprayed per generare microcarriers sferiche discreti. bar scala rappresenta 2 mm. 7. Le schiume e microcarriers possono poi essere gradualmente reidratati e seminato con cellule. Immagini rappresentative sono mostrati di ASC umane (cellule vitali = verde) seminate su una schiuma DAT (a sinistra) e DAT microsupporto (a destra). Barre di scala rappresentano 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Acido acetico, glaciale</td><td>BioShop</td><td>ACE222.500</td><td></td></tr><tr><td>Puntali a coccodrillo</td><td>VWR</td><td>470149-728</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-amilasi</td><td>Sigma</td><td>101074694</td><td>da Aspergillus aryzae</td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004251</td><td>Con rotore a secchiello oscillante per provette da centrifuga da 15 e 50 mL</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga (15 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga (50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Collagene da tendine d'achille bovino (insolubile)</td><td>Sigma</td><td>C9879&nbsp;</td><td>O fonte di collagene insolubile simile; Può essere utilizzato come alternativa ai tessuti decellularizzati per fabbricare le schiume e i microvettori</td></tr><tr><td>Sistema di criofresatura</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>MM 400</td></tr><tr><td>Disidratatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>8624426</td><td>Per la conservazione di ECM liofilizzate e bioscaffold</td></tr><tr><td>DMEM: F12 Hams</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Utilizzato per terreni di proliferazione</td></tr><tr><td>Pallone</td><td>Dewar Fisher Scientific</td><td>10-196-6</td><td>Forma bassa; intervallo di volume di 250 - 500 mL</td></tr><tr><td>Acqua distillata doppia (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Da Barnstead GenPure xCAD Water Purification System</td></tr><tr><td>D-PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Wisent</td><td>311425125</td><td></td></tr><tr><td>ECM (matrice extracellulare)</td><td></td><td></td><td>Isolato da tessuto adiposo umano, derma suino o miocardio suino, come descritto in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, e Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Greenfield Specialty Alcohols Inc.</td><td>P016EAAN</td><td>Absolute</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Wisent</td><td>80150</td><td>Utilizzato per terreni di proliferazione</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>VWR</td><td>37-501-32</td><td>Per il trasferimento delle schiume</td></tr><tr><td>Congelatore (-20 &deg; C)</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore ( -80 &deg; C)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EXF40086A</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-26D</td><td>Per conservare ECM criofresata liofilizzata</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore portatile</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Velocità: 8.000 - 30.000 giri/min</td></tr><tr><td>Accessori per omogeneizzatori: sonde del generatore di fondo a dente di sega</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-17</td><td>10 x 95 mm</td></tr><tr><td>Azoto</td> <td>liquido</td><td></td><td>Per l'elettrospruzzatura</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>7750021</td><td>FreeZone4.5</td></tr><tr><td>Camera di macinazione</td><td>Retsch</td><td>02.462.0213</td><td>25 mL di volume consigliato</td></tr><tr><td>Sfere di fresatura</td><td>VWR</td><td>16003-606</td><td>Diametro 10 mm, acciaio inox consigliato</td></tr><tr><td>18 G ago</td><td>VWR</td><td>C ABD305185</td><td>Per l'erogazione di sospensioni ECM in stampi</td></tr><tr><td>Orbitale agitatore per incubatrici</td><td>SciLogex</td><td>832010089999</td><td>Temperatura controllata (37 &deg; C)</td></tr> <tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Utilizzato per mezzi di proliferazione</td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>Mandel Scientific</td><td>DRU-4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per storta</td><td>VWR</td><td>470019-526</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto per storta</td><td>VWR</td><td>21573-606</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Safety-Lok</td><td>BD</td><td>309606</td><td>Siringa Luer lock da 3 mL per la fabbricazione di microcarrier e la dispensazione di sospensioni ECM</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (10&nbsp; mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>BioShop</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>VWR</td><td>89259-968</td><td>Per la raccolta di microvettori</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>VWR</td><td>82027-590</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>VWR</td><td>10117-490</td><td>Alimentazione</td></tr><tr><td>ad alta tensione</td> controllata da microprocessore <td>Gamma High Voltage Research</td><td>ES30P-5W/DDPM</td><td>In grado di fornire un intervallo di tensione consigliato da 15 a 25 kV</td></tr><tr><td>Piastre a 12 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565321</td><td>Per l'uso come stampi durante la fabbricazione di schiuma; È possibile selezionare anche altre dimensioni o stampi definiti dall'utente</td></tr><tr><td>Set per infusione alato</td><td>Terumo</td><td>22258092</td><td>lunghezza del tubo di 30 cm, consigliati 25 G 3/4"; Possono essere utilizzati altri calibri dell'ago che possono influenzare il diametro del microcarrier</td></tr></tbody></table>

fabbricazione di schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, cultura e piattaforme di distribuzione

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

funzione delle cellule è mediata da interazioni con la matrice extracellulare (ECM), che ha complessa composizione ed architettura tessuto-specifica. Il focus di questo articolo è sui metodi per fabbricare schiume e microcarriers porosi ECM-derivato per l&#39;uso come substrati biologicamente rilevanti nei 3D avanzata in modelli di colture cellulari in vitro o come impalcature pro-rigenerativo e sistemi di consegna delle cellule per l&#39;ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa. Utilizzando tessuti decellularizzati o collagene insolubili purificato come materiale di partenza, le tecniche possono essere applicate per sintetizzare una vasta gamma di bioscaffolds tessuto-specifiche con geometrie personalizzabili. L&#39;approccio comporta lavorazioni meccaniche e mite digestione enzimatica per fornire una sospensione ECM che viene utilizzato per fabbricare le schiume tridimensionali o microcarriers attraverso procedure di congelamento e liofilizzazione controllati. Questi puri impalcature ECM-derivati ​​sono altamente porosa, ma stabile senza la necessità di chemicAl agenti o altri additivi che possono influenzare negativamente la funzione delle cellule reticolazione. Le proprietà impalcatura possono essere sintonizzati in parte da fattori variabili quali la concentrazione ECM sospensione, metodi di lavorazione meccanica, o condizioni di sintesi. In generale, i ponteggi sono robusti e facili da maneggiare, e possono essere trattati come tessuti per la maggior parte saggi biologici standard, fornendo una piattaforma coltura cellulare 3D versatile e di facile utilizzo che riproduce la composizione ECM nativa. Nel complesso, questi metodi semplici per fabbricare schiume e microcarriers ECM-derivato personalizzate possono essere di interesse per entrambe biologi ed ingegneri biomedici come piattaforme cellule istruttivo tessuto-specifici per in vitro e in vivo applicazioni.

In questo studio, abbiamo fabbricato schiume e microcarriers ECM derivato utilizzando DAT umano, DDT porcina e porcina DLV come esempi rappresentativi dimostrano che le tecniche possono essere applicate per generare bioscaffolds tessuto-specifici utilizzando una varietà di tessuti decellularizzati come fonti ECM ( figura 1). Sia per schiuma e microcarrier fabbricazione, la tecnica Nishihara di collagene solubilizzazione con l&#39;enzima glicolitico α-amilasi 37 è atto a generare una sospensione ECM viscoso dal tessuto materiali di partenza decellularizzati, che viene utilizzato per sintetizzare le bioscaffolds attraverso procedure di congelamento e liofilizzazione controllati. Per fabbricare le schiume, tessuti decellularizzati possono essere elaborati attraverso sia macinazione meccanica o cryomilling per aumentare la superficie prima della digestione enzimatica. A seguire45; amilasi trattamento e omogeneizzazione, la sospensione risultante viene erogato ECM in uno stampo definito dall&#39;utente, che viene poi congelato e liofilizzato. I ponteggi possono essere memorizzati stabilmente allo stato secco per un periodo prolungato di tempo. Prima dell&#39;uso in studi su colture cellulari, i ponteggi liofilizzati devono essere sottoposti ad un processo di reidratazione controllato che produce schiume omogenei porosi e altamente idratati derivate da ECM puro (Figura 3A). Se gli espansi sono reidratati troppo rapidamente, rapido gonfiore può danneggiare delicate caratteristiche strutturali, con conseguente perdita di integrità e collasso strutturale. In generale, gli espansi manterranno la forma definita dallo stampo seguente reidratazione originale e sono stabili senza necessità di reticolazione chimica. Figura 3B mostra rappresentante microscopio elettronico a scansione (SEM) immagini del DAT, DDT, e DLV schiume fabbricato con ECM cryomilled ad una concentrazione di 35 mg / mL e una temperatura di congelamento di -80 &amp; #176; C. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig3.jpg" /> Figura 3. rappresentativi Immagini della DAT, DDT, e DLV Schiume fabbricato con Cryomilled ECM Sospensioni ad una concentrazione di 35 mg / mL e congelato a -80 ° C. A: vista macroscopico del DAT, DDT, e DLV schiume sintetizzati in 48 pozzetti stampo piastra di coltura tissutale conseguente reidratazione fresato. Barre di scala rappresentano 1 cm. B: immagini SEM delle schiume DAT, DDT, e DLV mostrando un ultrastruttura porosa omogenea. Barre di scala rappresentano 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Le sospensioni ECM cryomilled possono anche essere utilizzati per generare microcarriers ECM-derivato puri attraverso tecniche electrospraying (Figura 2 </strong&gt;). Per ciascuna sorgente ECM, la concentrazione della sospensione, gauge, velocità di infusione, e la tensione può essere sintonizzato per generare microcarriers sferiche discreti da 350 - 500 um di diametro seguente reidratazione controllata (Figura 4A). Mentre le microcarriers possono essere memorizzati in uno stato liofilizzato, è raccomandato per facilità di trattamento che sono erogate o setacciati per un intervallo di dimensioni desiderato seguendo risospensione in etanolo. Immagini SEM suggerisce che l&#39;ultrastruttura microsupporto può variare a seconda della fonte di tessuto decellularizzato (Figura 4B). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig4.jpg" /> Figura 4. rappresentativi Immagini della DAT, DDT, e DLV microcarriers fabbricato con Cryomilled ECM Sospensioni ad una concentrazione di 35 mg / mL, una velocità di infusione di 0,5 mL / min, ed una tensione applicata di 20 kV. A: macroscopica vista of gli idrati microcarriers DAT, DDT, e DLV. Barre di scala rappresentano 4 mm. B: immagini SEM delle microcarriers DAT, DDT, e DLV mostrano che l&#39;ultrastruttura e le dimensioni possono variare a seconda della fonte ECM. Barre di scala rappresentano 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Le proprietà meccaniche dei ponteggi dipendono dalla sorgente ECM, il metodo di lavorazione applicato (cioè macinazione contro cryomilling), la concentrazione della sospensione ECM, e la temperatura di congelamento. In generale, i ponteggi sono morbidi e conformi con moduli di Young nell&#39;intervallo di 1 - 5 kPa riportata per la DAT (50 e 100 mg / mL) 29 e schiume DLV (20 - 50 mg / mL) 31, e &lt;1 kPa per i microcarriers. Le schiume cryomilled sono tipicamente più morbidi thuno schiume tritate a causa della loro natura più interrotto. sistemi di prova meccanici specializzati muniti di celle di carico altamente sensibili sono necessari per un&#39;accurata caratterizzazione delle proprietà a compressione. Tipicamente, le schiume e microcarriers avrebbero moduli inferiore ai tessuti nativi decellularizzati dovute alle ulteriori fasi di lavorazione coinvolte nella fabbricazione compresi digestione enzimatica e omogeneizzazione, nonché la natura non covalente reticolato dei ponteggi. Tuttavia, questo può variare a seconda del tessuto di interesse. Ad esempio, nel lavoro precedente, abbiamo scoperto che macinate DAT schiume fabbricata a concentrazioni alte ECM (100 mg / ml) dovuto moduli simile al tessuto adiposo nativo 29. Le schiume e microcarriers ECM derivato reidratati possono essere seminati con cellule in condizioni di coltura statiche o dinamiche di fornire una piattaforma di supporto per cellule in studi su colture cellulari in vitro e / or in consegna cellule vivo. Mentre i ponteggi generalmente supportano attacco delle cellule, l&#39;efficienza di semina dipenderà dalla sorgente ECM, la geometria scaffold e porosità, e il tipo cellulare di interesse. Come tali, i metodi di semina e densità richiederanno ottimizzazione seconda delle condizioni definite dall&#39;utente. Per le schiume descritte sopra, si consiglia una concentrazione cellulare iniziale nell&#39;intervallo di 0,25 - 1 x 10 6 cellule / scaffold, con semina dinamica su un agitatore orbitale per migliorare infiltrazione di cellule. Per i microcarriers, suggeriamo una densità di semina iniziale nell&#39;intervallo 25.000 - 50.000 cellule / mg di microcarriers, con semina effettuata in condizioni dinamiche in una cultura beuta filatore 11. Le immagini mostrate nella parte inferiore della figura 1 rappresentano ASC umani seminate su una schiuma DAT (sinistra) o DAT microcarrier (destra, prelabeled con un colorante ammina reattiva e apparire blu 13), come visualizzato da micro confocalescopia fluorescente utilizzando un colorante vitalità cellulare (cellule vive = verdi, cellule morte = rosso; scala barre rappresentano 100 um). microscopia confocale può essere utilizzato per visualizzare le cellule seminate sulla superficie di schiume fino a 2 mm di spessore, ma visualizzazione nelle regioni centrali degli scaffold è limitata dalla loro natura opaca. Tuttavia, le schiume e microcarriers possono essere trattati come tessuti e inclusi in paraffina o crio-sezionati per istologica e immunoistochimica analisi di visualizzare distribuzione delle celle e l&#39;espressione marcatore.

La matrice extracellulare tessuto-specifico (ECM) è un mediatore chiave della funzione delle cellule. Questo articolo descrive metodi per sintetizzare schiume e microcarriers che sono stabili in coltura senza la necessità di reticolazione chimica per applicazioni in 3D avanzata in colture di cellule in vitro o come bioscaffolds pro-rigenerativi ECM-derivato puri.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è assistere nella determinazione delle dimensioni di schiume o microsupporti non reticolati chimicamente, derivati dalla matrice extracellulare specifica del tessuto, per applicazioni in modelli di coltura cellulare tridimensionale in vitro o come impalcature pro- rigenerative nei sistemi di somministrazione cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia cellulare applicata e dell'ingegneria tissutale, come ad esempio in che modo il microambiente cellulare tridimensionale media la funzione cellulare e la rigenerazione tissutale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la fabbricazione di impalcature con geometrie regolabili che imitano la composizione nativa della matrice extracellulare specifica del tessuto ed è stabile in colture a lungo termine senza ulteriore reticolazione.Dopo aver liofilizzato la matrice extracellulare (ECM) derivata dal tessuto secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare forbici chirurgiche affilate per tritare finemente il tessuto descellularizzato. Per effettuare la criomacinazione del tessuto processato, riempire una camera di macinazione in acciaio inox da 25 millilitri per un sistema di macinazione a sfera da laboratorio con l'ECM liofilizzato tritato e aggiungere due sfere di macinazione in acciaio inox da 10 millilitri. Chiudere la camera di macinazione caricata e immergerla completamente in azoto liquido per tre minuti.Quindi macinare il campione congelato a 30 Hertz per tre minuti. Ripetere l'immersione in azoto liquido e la macinazione fino a quando la MEC non viene ridotta in una polvere fine. Pesare 250 milligrammi di MEC tritata o criomacinata e trasferirla in un tubo da centrifuga da 15 millilitri.Aggiungere cinque millilitri di tampone NaH2PO4 22 M al tubo da centrifuga e segnare il livello del liquido sul tubo. Successivamente, preparare una soluzione madre di alfa amilasi aggiungendo 7,5 milligrammi di alfa amilasi a un millilitro di tampone NaH2PO4 22 M. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione madre di alfa amilasi al campione.Quindi aggiungere NaH2PO4 22 molare per ottenere un volume finale di 10 millilitri. Agitare continuamente la sospensione a 300 giri al minuto e a temperatura ambiente per 72 ore. Centrifugare la sospensione a 1500 ×g per 10 minuti.Raccogliere con attenzione e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet di ECM digerita. Successivamente, utilizzare 10 millilitri di NaCl al cinque percento diluito in acqua bidistillata per risospendere il materiale pellettizzato e agitare continuamente per 10 minuti a 300 giri al minuto. Ripetere il lavaggio altre due volte prima di utilizzare 10 millilitri di acqua bidistillata per risospendere il pellet.Quindi agitare continuamente la sospensione a 300 giri al minuto a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo aver centrifugato nuovamente il campione, raccogliere con attenzione e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet di ECM digerito. Aggiungere acido acetico 2 molare fino al segno di cinque millilitri.E vortexare. Quindi agitare continuamente la sospensione a 120 giri al minuto e 37 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, utilizzando un omogeneizzatore manuale dotato di una sonda a denti di sega larga 10 millimetri, omogeneizzare la sospensione di matrice extracellulare a temperatura ambiente a intervalli di 10 secondi fino a quando non rimangono frammenti visibili.Collocare la sospensione in un becher contenente acqua fredda tra un'omogeneizzazione e l'altra per evitare il surriscaldamento. Incubare la sospensione di ECM a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 120 giri al minuto fino a quando la sospensione non sarà calda. Quindi utilizzare acido acetico 2 molare per diluire la sospensione campione alla concentrazione desiderata.Con una siringa da tre millilitri e un ago da 18 gauge, riempire il modello desiderato con la sospensione di ECM. Le schiume possono essere fabbricate in una gamma di geometrie a seconda della forma del modello. Coprire e congelare i modelli a meno 20 o meno 80 gradi Celsius.Quindi posizionare gli stampi in un flacone per liofilizzatore. Collegare il flacone al sistema di liofilizzazione in laboratorio e asciugare gli stampi per 24 ore o fino a completa essiccazione. Incubare la sospensione di ECM criomacinata con agitazione continua a 100 giri/min per tutta la notte.Caricare tre millilitri di sospensione di ECM in una siringa da tre millilitri con attacco luer lock e collegare un set di infusione alato all'orifizio della siringa. Fissare saldamente la siringa alla pompa per siringa. Quindi fissare l'ago a un supporto con morsetto e posizionare la punta dell'ago verticalmente a una distanza di quattro-sei centimetri dalla sommit&agrave; di un contenitore Dewar basso.Successivamente, collegare un elettrodo a pinza coccodrillo alla punta dell'ago, assicurandosi anche che la pinza coccodrillo sia collegata al terminale positivo dell'alimentatore ad alta tensione. Pieghare una striscia di alluminio lungo il bordo del pallone a vuoto. Quindi, collegare un secondo elettrodo a pinza coccodrillo al bordo esterno della lamina di alluminio.Collegarlo al terminale di massa dell'alimentatore. Riempire il matraccio Dewar con azoto liquido fino a circa un centimetro dal bordo superiore, in modo che i tre quarti della lamina siano immersi. Impostare quindi la pompa per siringa su una velocità di infusione di 30 millilitri all'ora ed eseguire l'elettrospruzzo dei campioni secondo il protocollo descritto nel testo.Una volta completata l'infusione, versare con attenzione l'eccesso di azoto liquido dal Dewar, lasciando il microportatore sospeso in circa 25 millilitri di azoto liquido per garantire che rimanga congelato. Trasferire immediatamente i microportatori con l'azoto liquido in un tubo da centrifuga da 50 millilitri, versandoli in un unico movimento fluido. Successivamente, utilizzare una spatola per raccogliere eventuali microportatori congelati rimasti nel Dewar.Aggiungerli anche alla centrifuga. Per preparare la liofilizzazione, coprire il tubo della centrifuga con della carta d'alluminio forata con piccoli fori. Posizionare i tubi della centrifuga coperti in un matraccio per liofilizzatore.Quindi collegare immediatamente il pallone al liofilizzatore e asciugare i campioni durante la notte. Trasferire delicatamente la schiuma liofilizzata in un tubo da centrifuga da 50 millilitri contenente etanolo assoluto in eccesso. Analogamente, risospendere i microsupporti liofilizzati in etanolo assoluto in eccesso all'interno del tubo da centrifuga originale utilizzato per il recupero.Utilizzando una pipetta serologica, filtrare i microsupporti attraverso un setaccio in acciaio inossidabile con una dimensione definita della maglia in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri per rimuovere eventuali aggregati e selezionare gli intervalli di dimensione desiderati. Incubare il campione a quattro gradi Celsius per quattro ore o fino a quando la schiuma o i microsupporti si saranno depositati sul fondo del tubo da centrifuga. Successivamente, sotto una cappa a flusso laminare e utilizzando tecniche asettiche, utilizzare una pipetta serologica per rimuovere l'etanolo assoluto dagli scaffold e aggiungere un eccesso di etanolo al 95% diluito con PBS sterile.Incubare gli scaffold a quattro gradi Celsius per quattro ore o fino a quando gli scaffold non saranno affondati sul fondo del contenitore di reidratazione. Reidratare gradualmente gli scaffold attraverso una serie di etanolo. A ogni passaggio, incubare gli scaffold a quattro gradi Celsius finché non affondano sul fondo del contenitore, prima di cambiare la soluzione.Sostituire il PBS sterile con altri due risciacqui per rimuovere l'etanolo residuo. Conservare i campioni in PBS sterile al 100% a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso per la coltura cellulare. Utilizzare gli scaffold da una a due settimane dopo la reidratazione.Qui sono mostrati esempi dei tipi di schiume e microsupporti derivati dalla matrice extracellulare (ECM) realizzati utilizzando tessuto adiposo descelularizzato, tessuto dermico porcino descelularizzato e ventricolo sinistro porcino descelularizzato. Questi esempi dimostrano che le tecniche possono essere applicate per generare bioscaffolds specifici per tessuto, utilizzando una varietà di tessuti descelularizzati come fonti di ECM.Dopo la criomacinazione o il trinciamento, la digestione enzimatica e l'omogeneizzazione, i campioni possono essere dispensati in una bacinella prima del congelamento e della liofilizzazione. Questa figura rappresenta schiume liofilizzate di DAT, DDT e DLV, rigenerate con idratazione, sintetizzate in uno stampo a piatto da coltura tissutale a 48 pozzetti. Queste schiume di DAT, DDT e DLV sono state prodotte utilizzando ECM criomacinato a una concentrazione di 35 milligrammi per millilitro e una temperatura di congelamento di meno 80 gradi Celsius.Per produrre microsupporti derivati dalla matrice extracellulare (ECM) mediante una tecnica di elettrospruzzo, per ogni concentrazione della sospensione di ECM, è possibile regolare il calibro dell'ago, la velocità di infusione e la tensione al fine di generare microsupporti sferici discreti con diametro compreso tra 350 e 500 micrometri, successivamente a una reidratazione controllata. Infine, i microsupporti DAT, DDT e DLV mostrati in questo caso mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) rivelano che l'ultrastruttura in termini di dimensioni può variare in base alla fonte di ECM deselcellarizzata. I metodi presentati in questo video possono essere utilizzati per produrre una vasta gamma di microsupporti e schiume specifici per tessuti, costituiti da ECM pura e non legata chimicamente, impiegando tessuti deselcellarizzati come fonte della matrice.Seguendo queste procedure, le schiume e i microsupporti possono essere seminati con cellule in condizioni statiche o dinamiche e possono essere utilizzati come substrati di istruzione cellulare per colture cellulari in vitro e applicazioni in vivo.

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In questo protocollo, dimostriamo la realizzazione di una serie di messaggi microattuatore verticalmente sfollati su cui si basa la tecnologia, e come questa tecnologia di base può essere modificato per condurre high-throughput di coltura cellulare meccanicamente dinamica sia la cultura bidimensionale e tridimensionale paradigmi.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

Questo video descrive la preparazione di una sospensione di matrice extracellulare omogeneizzata e digerita da tessuti decellularizzati e liofilizzati. Questa tecnica aiuta a fabbricare schiume porose derivate dalla ECM e microvettori da utilizzare come substrati in modelli avanzati di colture cellulari 3D.

Preparazione della sospensione ECM: una tecnica per ottenere una sospensione omogenea da una matrice extracellulare derivata dal tessuto

Questo video descrive il metodo per sintetizzare schiume pure derivate dalla ECM senza la necessità di reticolazione chimica. Queste schiume derivate dalla MEC trovano applicazioni come modelli avanzati di colture cellulari 3D in vitro o come bioscaffold pro-rigenerativi.

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Questo video dimostra la procedura di fabbricazione di microcarrier derivati da matrice extracellulare mediante elettrospraying. Questi microvettori simulano il microambiente nativo tessuto-specifico e sono stabili in modelli di coltura cellulare 3D in vitro a lungo termine.

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Questo studio presenta una metodologia per preparare 3D, biodegradabili, schiuma come scaffold cellulari basate su elastomeri cristalli liquidi catena laterale biocompatibili (LCEs). esperimenti di microscopia confocale mostrano che LCEs schiuma come permettere l'attacco, proliferazione, e l'allineamento spontaneo dei mioblasti C2C12s.

Sintesi di biocompatibili a cristalli liquidi in elastomero Schiume come impalcature cellulari per 3D spaziali colture cellulari

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

Vi proponiamo un protocollo di espansione delle cellule su microcarriers macroporosa e loro uso come sistema di consegna in un bioreattore di perfusione per inizializzare una matrice di tessuto decellularizzati. Abbiamo anche diverse tecniche per determinare la proliferazione delle cellule e l'attuabilità delle cellule coltivate su microcarriers. Inoltre, dimostriamo la funzionalità delle cellule dopo le culture di bioreattore.

Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per l'espansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello

L'obiettivo del presente protocollo è la produzione delle fibre di intera tabella extracellulare mirati per la riparazione della ferita che sono adatti per la valutazione preclinica come parte di un impianto di impalcatura rigenerativa. Queste fibre sono prodotte dalla cultura dei fibroblasti su membrane a fibra cava ed estratte dalla dissoluzione delle membrane.

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).

Sistema a matrice 3D derivato da fibroblasti applicabile al saggio di formazione di tubi endoteliali

Qui viene presentata una lieve tecnica di stampa 3D guidata dall'alternanza di forze viscose-inerziali per consentire la costruzione di microcarrier in idrogel. Gli ugelli fatti in casa offrono flessibilità, consentendo una facile sostituzione di diversi materiali e diametri. I microcarrier leganti le cellule con un diametro di 50-500 μm possono essere ottenuti e raccolti per un'ulteriore coltivazione.

Stampa 3D di microcarrier idrogel in vitro mediante getto alternato di forza viscosa-inerziale

Sebbene la rigidità della matrice extracellulare (ECM) sia un regolatore chiave del comportamento cellulare, i meccanismi di rilevamento e trasduzione sottostanti restano poco chiari. Per affrontare questo problema, forniamo protocolli per creare substrati a base di poliacrilammide e silicone con rigidità regolabile, per approfondire la nostra comprensione della diafonia cellula-ECM.

Generazione di substrati extracellulari in poliacrilammide e silicone con rigidità definita per applicazioni in biologia cellulare

Impara a sintetizzare schiume e microcarrier derivati dalla matrice extracellulare senza reticolazione chimica per colture cellulari 3D e applicazioni rigenerative. Questo metodo consente geometrie personalizzabili.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione (Video) | JoVE Journal

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

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