Name: Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a A. fumigatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Scopri come valutare l'attività antifungina di neutrofili e monociti umani primari in tempo reale usando conidi di Aspergillus fluorescenti e microscopia video. Questo metodo identifica difetti specifici nell'immunità innata.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal MRC e l&#39;Università di Aberdeen (MRC Centro di Micologia Medica) e dal Wellcome Trust Award strategica - Micologia Medica Fungal Immunology (SFB, JMB, JK, AW). Un ringraziamento speciale è data al sostegno del Fondo Chloe. TMH è sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institute of Health (NIH, il codice RO1 093.808) e il Memorial Sloan Kettering Cancer Center è supportato dal NIH concedere P30 CA008748. Inoltre, TMH è un investigatore nella patogenesi della malattia infettiva sostenuta dal Fondo Burroughs Wellcome. Desideriamo ringraziare l&#39;Aberdeen Microscopia e Istologia strumento per il loro aiuto e sostegno.

Il protocollo per ottenere neutrofili e cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è basato su metodi precedentemente pubblicati 9. L&#39;uso di campioni di sangue di volontari sani è stato approvato dal comitato etico della ricerca umana dell &#39;Università di Aberdeen. Prima di iniziare assicurarsi che tutte le approvazioni etiche sono a posto per un prelievo di sangue di volontari sani e / o pazienti per lo scopo dell&#39;esperimento descritto. Mantenere le cellule in ghiaccio, ove possibile, di aumentare la loro sopravvivenza. 1. A. fumigatus, Cultura e Condizioni <ol><li> Preparare glucosio agar minimo come descritto 10. <ol><li> Regolare mezzi a pH 6,5 usando NaOH 1 M e autoclave a 120 ° C per 20 min. </li><li> Lasciare raffreddare a 65 ° C. </li><li> Lavorando in una cappa a flusso sterile, versare 30 mL di supporti raffreddati in un pallone T75 e lasciar raffreddare il collo del pallone di riposo su una pipetta 25 ml di cReate una pendenza agar. </li></ol></li><li> Striscia la DsRed Af293- ceppo A. fumigatus sull&#39;agar e incubare per 7 giorni a 37 ° C + 5% di CO 2. Due boccette produrrà circa 10 9 conidi in 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pre-biotinilazione. </li></ol> 2. A. fumigatus etichettatura e preparazione Nota: Quando si esegue questo test per la prima volta, preparare il parental Af293- ceppo A. fumigatus. Prelevare campioni di entrambi i ceppi in provette per microcentrifuga ed etichettare solo uno di ogni ceppo come descritto di seguito. Ciò permetterebbe di avere il controllo conidi senza colore e conidi con un solo colore, sia DsRed o AF633, per testare la configurazione e le attrezzature. <ol><li> Raccolto A. fumigatus conidi immergendo la coltura con 30 ml di PBS + 0,05% Tween-80. Filtrare la sospensione risultante attraverso un colino cella 40 micron in una provetta da 50 ml per rimuovere i frammenti ifali. </li><li> Centrifuge a 805 xg per 10 min, rimuovere il surnatante e lavare una volta in 20 mL di PBS sterile. Piscina conidi da due piastre dello stesso ceppo durante la fase di lavaggio. </li><li> Dopo la fase di lavaggio, risospendere il pellet in 5 ml di PBS e trasferimento 1 ml della sospensione di conidi in provette per microcentrifuga. 1 ml di sospensione di ciascun ceppo è solitamente sufficiente per cellule vive. Avvolgere le aliquote restanti in fogli e conservare a 4 ° C. </li><li> aliquote centrifuga di sospensione di conidi a 9.300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente e rimuovere con attenzione il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 mL 0,05 M NaHCO 3 pH 8,3. </li><li> Preparare 10 mg di biotina / 200 pl dimetilsolfossido soluzione madre (DMSO) ricostituendo 25 mg di biotina in 500 microlitri di DMSO. Aggiungere 10 microlitri biotina / soluzione stock DMSO alla provetta, coperchio in foglio di alluminio e incubare per 2 ore su un agitatore meccanico a 4 ° C. <ol><li> Aliquotare il resto della biotina / DMSO archivio solution e congelare a -20 ° C per l&#39;uso in esperimenti successivi. </li></ol></li><li> Centrifugare per 10 minuti a 9300 xg e rimuovere con attenzione il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 ml di 100 mM Tris-HCl pH 8,0 per 1 ora per disattivare biotina liberamente fluttuante. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 9300 xg e rimuovere con attenzione il surnatante. Lavare il pellet due volte con 1 ml di PBS sterile e risospendere il pellet in 1 ml di PBS. </li><li> Sciogliere 1 mg di streptavidina-AF633 in 0,5 mL di PBS per fare un / soluzione madre 2 mg mL. Aggiungere 10 ml di 2 mg / mL streptavidina-AF633 per 1 ml di sospensione di conidi e incubare per 40 minuti a temperatura ambiente su un agitatore meccanico coperto in foglio di alluminio. Il restante Streptavidina-AF633 può essere congelato in aliquote per l&#39;uso in esperimenti successivi. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 9300 xg e rimuovere con attenzione il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 ml di PBS e contare il conidi con un emocitometro a una diluizione 1: 1.000 (1: 100 e poi 1,10). Regolare la concentrazione conidi di 3,6 x 10 6 / ml con CO 2 media indipendenti, avvolgerlo in carta e conservare a 4 ° C. NOTA: I conidi sono ora etichettati con AF633 e verranno indicati come FLARE conidi. </li><li> Opzionale: Se è necessaria la stimolazione con conidi gonfio, dopo aver contato conidi (passo 2.9), diluire conidi di 7,2 x 10 6 / ml in base azotata di lievito (YNB) medio e aggiungere 500 microlitri sospensione di conidi di 4,5 ml YNB medie un autoclavato 50 mL beuta. Coprire e posizionare il pallone in un incubatore scuotimento (200 rpm a 37 ° C) per 6 ore. <ol><li> Trasferire il medio in una provetta da 15 ml. Centrifugare a 805 xg per 10 min a temperatura ambiente e lavare una volta in PBS. Centrifuga di nuovo e risospendere pellet in 1 ml di CO 2 media indipendenti, dando 3.6 x 10 6 conidi / mL. Nota: Conidi spesso ciuffo dopo che diventano gonfie rendendo difficile un conteggio preciso, si consiglia di calcolare con la cNumeri ounted di conidi utilizzati riposo. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento di neutrofili umani e monociti <ol><li> Disegnare 20 ml di sangue venoso da volontari sani in due provette di sangue 10 mL contenenti acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Per ciascun donatore separatamente, versare 20 ml di sangue in una provetta da 50 ml e diluire con 15 ml di PBS. </li><li> Alla base del sangue con 15 mL di una soluzione di isolamento dei linfociti (densità 1.077 g / mL) con un ago della siringa e ferro. Posizionare l&#39;ago nella parte inferiore del tubo e forzare delicatamente la soluzione di isolamento dei linfociti fuori. Centrifugare a 630 xg per 20 minuti senza freno e bassa accelerazione. </li><li> Preparare PBS, raffreddato in ghiaccio. NOTA: i passaggi 3.4 e 3.5 deve essere seguita contemporaneamente per generare monociti (3.4) e neutrofili (3.5). </li><li> Utilizzando un pastette, raccogliere lo strato PBMC. Questo è lo strato al centro tra il siero giallo (superiore) e la soluzione trasparente isolamento dei linfociti (inferiore) strato, etrasferire in un tubo da 50 ml fresca. <ol><li> Riempire il tubo con PBMC fino a 50 ml con PBS freddo e centrifugare a 582 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS freddo e risospendere in 1 ml di PBS per 20 ml di sangue del donatore utilizzati inizialmente. </li><li> Fare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 microlitri della sospensione cellulare a 160 ml di PBS e 20 ml di trypan blu. Contare le cellule con un emocitometro. </li><li> Preparare una soluzione tampone con l&#39;aggiunta di 26 mL di calore inattivato siero fetale di vitello (FCS) e 2,1 ml di 0,5 M EDTA a 500 ml di HBSS. Centrifugare le cellule per 10 min a 515 xg e risospendere in 40 ml di soluzione tampone a 1 x 10 7 cellule. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e aggiungere 10 ml di microperle CD14 per 1 x 10 7 cellule, mescolare bene e incubare per 15 min a 4 ° C, avendo cura di mescolare i tubi ogni 5 min. </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione tampone a 1 x 10 7 cellule e centrifuge a 515 g per 10 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere completamente fino a 1 x 10 8 cellule in 500 microlitri di soluzione tampone. </li><li> Mettere 1 colonna per campione su un separatore magnetico secondo le istruzioni del produttore. Prima lavare la colonna una volta con 500 ml di soluzione tampone. </li><li> Pipetta 500 microlitri di sospensione cellulare attraverso la colonna, attendere che la colonna asciugare e poi lavare ripetendo questo tre volte con soluzione tampone. </li><li> Posizionare un nuovo tubo 15 ml sotto la colonna e la colonna prendere fuori dal separatore magnetico. Poi lavare le cellule fuori della colonna nel tubo di 1 mL di soluzione tampone. </li><li> Aggiungere 4 ml di soluzione tampone e centrifugare a 515 xg per 10 minuti, e poi risospendere in 1 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) di media. </li><li> Fare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 microlitri della sospensione cellulare a 160 ml di PBS e 20 ml di trypan blu. Contare le cellule con unemocitometro. </li><li> Regolare la concentrazione cellulare a 6 x 10 5 / mL con RPMI e sementi 200 microlitri su un piatto di imaging basata vetro da 35 mm. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Il giorno dopo, prima di imaging, rimuovere il RPMI e aggiungere 200 ml di CO 2 di media indipendenti. Nota: Questi monociti possono essere differenziate in diversi sottoinsiemi dei macrofagi prima di imaging. Se questa è una tecnica da esplorare, un eccellente punto di partenza è il recente lavoro di Ohradanova-Repic et al. 1 1. </li></ol></li><li> Dopo la raccolta strato PBMC, rimuovere tutto il siero e la maggior parte della soluzione di isolamento dei linfociti, ma attenzione a non rimuovere il nastrino bianco sulla parte superiore del sedimento rosso come questo contiene la maggior parte dei neutrofili. <ol><li> Preparare un tampone 10x ipotonico lisi magazzino aggiungendo 83 g di NH 4 Cl e 10 g di KHCO 3 in 1 L di acqua sterile. Conservare a 4 °C. </li><li> Diluire tale stock 10x con acqua sterile e aggiungerlo ai tubi. Quindi, capovolgere con cautela 3 volte e incubare in ghiaccio per 15 min. </li><li> Centrifugare a 394 xg per 10 minuti e risospendere in tampone di lisi ipotonica per 10 min in ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 394 xg e lavare due volte con PBS freddo. Risospendere in 1 mL di CO 2 media indipendenti per donatore. </li><li> Fare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 microlitri della sospensione cellulare a 160 ml di PBS e 20 ml di trypan blu. Contare le cellule con un emocitometro. </li><li> Citometria a flusso, regolare la concentrazione di 6 x 10 5 / mL e aggiungere sospensione cellulare 400 microlitri di una piastra da 24 pozzetti. Per la microscopia, aggiungere 200 microlitri della stessa sospensione cellulare ad un piatto di imaging basata vetro da 35 mm. Nota: l&#39;imaging dei neutrofili o citometria a flusso deve essere iniziato immediatamente a causa della loro propensione a subire apoptosi se lasciato non stimolato. Se questo non è possibile neutrofili devono essere tenuti inghiaccio e utilizzato il più presto possibile (entro lo stesso giorno). </li></ol></li></ol> 4. Citometria a Flusso <ol><li> Aggiungere 200 ml di 1,2 x 10 6 / ml FLARE conidi alle cellule nella piastra a 24 pozzetti, e quindi aggiungere 100 ml di 20 mg / mL voriconazolo. Aggiungere 300 ml di RPMI e incubare per 16 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. NOTA: Voriconazolo viene aggiunto per impedire la germinazione dei conidi. </li><li> Aggiungere 25 ml di una soluzione stock 1 mM calcofluor-bianco a ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 25 pM e incubare per 10 min a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Centrifugare a 582 g per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS. </li><li> Per raccogliere cellule aderenti (monociti), aggiungere 1 ml di PBS con 3 mM EDTA a ciascun pozzetto e incubare per 10 min a 37 ° C con 5% di CO 2. lavare delicatamente le cellule dalla piastra pipettando e raccogliere le cellule in un tubo. </li><li> Risciacquare una volta in tampone FACS (2% siero di vitello fetale al PBS), e poi risospendere in FACS buffer per analisi FACS. <ol><li> Per l&#39;analisi FACS, prima regolare i parametri di compensazione del citometro a flusso e impostare cancelli positivi utilizzando tubi di compensazione monocromatiche, incluse conidi senza colore: DsRed + conidi, AF633 + conidi e Calcofluor bianco + conidi (generato come in 4.2). </li><li> Impostare cancello libera conidi basa su avanti e scatter laterale utilizzando conidi con nessun colore. Situato porta cellulare su avanti e scatter lato escludendo la porta conidi libero. </li><li> Analizzare provetta registrando 10.000 eventi. NOTA: Le cellule associati conidi dal vivo saranno DsRed + e + AF633. Le cellule associate a conidi morti saranno solo AF633 +. cellule bystander che non sono impegnati conidi sarà dsRed- e AF633-. Le popolazioni di cellule conidi-impegnati sono ulteriormente analizzati per la colorazione bianca calcofluor sul canale Pacific Blue. Conidi che restano al di fuori delle cellule sarà calcofluor Bianco +, e conidi che sono stati internalizzati sarannoCalcofluor Bianco-. </li></ol></li></ol> 5. Live Cell microscopio video Nota: La scelta del microscopio dipenderà ciò che è disponibile localmente, ma la configurazione microscopio dovrà prevedere una fase invertita, una camera ambientale riscaldata a 37 ° C e filtri di eccitazione / emissione appropriati per DsRed (532/561 nm) e AF633 (633 nm). conidi FLARE non funzionano con il laser 488 nm al posto del laser 532/561 nm per DsRed. Quando si esegue questo esperimento per questa prima volta, utilizzare il conidi di controllo con nessun colore e il colore unico per verificare fluorescenza di fondo e sanguinare-through tra la DsRed e canali AF633. <ol><li> Accendere il riscaldamento microscopio prima dell&#39;esperimento e consentire un tempo sufficiente per la camera di controllo ambientale riscaldare a 37 ° C. Il tempo necessario per la temperatura della camera di stabilizzazione varierà per differenti configurazioni microscopio. </li><li> Accendere il microscopio e il computer, ed eccoannuncio il software di imaging. Montare il piatto di imaging sul palco microscopio e regolare la messa a fuoco per trovare i neutrofili o monociti umani. </li><li> Per DsRed e AF633, impostare la potenza del laser al 10% e il tempo di esposizione di 1 s nelle impostazioni di acquisizione. </li><li> Rimuovere il vetrino imaging e aggiungere 100 ml di 3 x 10 6 / ml FLARE sospensione di conidi nei rispettivi pozzetti (volume totale 300 pl / pozzetto). Registrare il tempo che FLARE conidi vengono aggiunti al piatto. </li><li> Riportare la diapositiva per il palco e regolare la sensibilità della fotocamera per DsRed e AF633 di vedere chiaramente la conidi ma non overexpose l&#39;immagine. Impostare un elenco dei punti di fase se è richiesta l&#39;acquisizione multi-point. </li><li> Iniziano l&#39;imaging quando tutti i punti sono a fuoco, i canali sono ottimizzate e il tempo di ciclo e la durata è impostato. Tempo di ciclo e la durata delle immagini dipendono dalla domanda sperimentale. L&#39;obiettivo è di mantenere il tempo di ciclo più breve possibile (≤2 min) con 1 min consentendo analisi approfondite uptdinamica ake. </li></ol>

<ol><li>Kosmidis, C., Denning, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+spectrum+of+pulmonary+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis.</a> Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).</li>
<li>Warris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+pulmonary+Aspergillus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect%22%5BJournal%5D)">The biology of pulmonary Aspergillus infections.</a> J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).</li>
<li>Henriet, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocytes+kill+Aspergillus+nidulans+by+reactive+oxygen+species-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms.</a> Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).</li>
<li>Sheppard, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methodologies+for+the+determination+of+pulmonary+fungal+burden+in+experimental+murine+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis.</a> Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).</li>
<li>Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+video+microscopy+of+fungal+pathogen+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis.</a> J Vis Exp. (71), e50196(2013).</li>
<li>Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deploying+FLAREs+to+Visualize+Functional+Outcomes+of+Host-Pathogen+Encounters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1004912(2015).</li>
<li>Jhingran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+conidial+fate+and+measuring+host+cell+antifungal+activity+using+a+reporter+of+microbial+viability+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung.</a> Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).</li>
<li>Espinosa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+orchestrate+innate+antifungal+immunity+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung.</a> PLoS Pathog. 10 (2), e1003940(2014).</li>
<li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4427075">Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque.</a> J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).</li>
<li>Shimizu, K., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+involvement+of+a+cAMP-dependent+protein+kinase+in+a+G+protein+signaling+pathway+regulating+morphological+and+chemical+transitions+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans.</a> Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).</li>
<li>Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+monocytes+and+derived+subsets+of+macrophages+and+dendritic+cells+by+the+HLDA10+monoclonal+antibody+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel.</a> Clin Transl Immunology. 5 (1), e55(2016).</li>
<li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo metodo descrive un innovativo metodo in vitro per studiare l&#39;attività antifungina dei fagociti primari umani contro A. fumigatus utilizzando fluorescente Aspergillus Reporter (FLARE) conidi, cellule vive e citometria a flusso. Studi precedenti hanno dimostrato il valore aggiunto di utilizzare FLARE conidi sia in vivo nella infezione fungina sperimentale murino e nella valutazione in vitro di antimicotico immunità 6, 7. Combinando FLARE conidi con questa tecnica cellule vive prossima generazione consente un&#39;installazione per misurare la vitalità di conidi individuo durante interazioni dinamiche in vitro. Il metodo descritto ha il potenziale per indagare i ruoli specifici e l&#39;importanza di alcuni processi cellulari di cellule immunitarie alle risposte antifungini. Inoltre, le risposte antifungini di fagociti da pazienti affetti da specifichedefiniti difetti monocomponenti nel loro sistema immunitario possono essere valutati in maggior dettaglio. Molto risposte antifungini precoci e iniziali possono essere studiati in dettaglio più di 6 ore di immagini in continuo. Questo permette anche sottili differenze da rilevare, ad esempio la velocità di migrazione dei fagociti verso il fungo, i tassi di internalizzazione, dinamica degli eventi fungicide 12, che sarebbero indistinguibili utilizzando metodi convenzionali fagocitosi. Qualsiasi tipo di cellula può essere utilizzato con questo metodo; i tipi cellulari usate qui sono stati scelti perché questi fagociti costituiscono la prima e la seconda linea di difesa nelle vie aeree umane contro A. fumigatus 13. È interessante notare, differenze molto chiare possono osservare tra come monociti e neutrofili impegnarsi con riposo e conidi gonfio e ife. I monociti difficilmente migrano verso conidi, mentre i neutrofili mostrano un&#39;attività molto più migratoria. mar fluorescenti aggiuntivekers, come marcatori dal vivo-morto sulle cellule del sistema immunitario possono essere inclusi nel saggio di fornire approfondimenti di sopravvivenza dei fagociti seguente interazioni con Aspergillus. Interessanti potenziali future applicazioni per questa tecnologia includono la co-coltura di diversi tipi di cellule ospiti, le conseguenze per le risposte antifungini (ad esempio, i macrofagi su un monostrato epiteliale, cellule dendritiche derivate da monociti insieme con neutrofili), e la misura in tempo reale della reattivo ossigeno produzione di specie o neutrofili extracellulare formazione trappola seguito di stimolazione con Aspergillus. Alcuni punti devono essere notato per utilizzare questo protocollo, soprattutto il setup di laboratorio richieste: un microscopio con una fase invertita, una camera climatica stabile a 37 ° C, e l&#39;eccitazione / filtri di emissione per DsRed (532/561 nm) e AF633 ( 633 nm). La capacità del microscopio per mantenere le cellule a fuoco e mantenere l&#39;immersione in olio (particolarmente rilevante durante multi-point acquisizione) deve essere monitorata periodicamente a causa della lunga durata delle immagini. Per la quantificazione dell&#39;attività fungicida citometria a flusso sono richieste strutture. Inoltre, opportune approvazioni istituzionali ed etici devono essere in atto per lavorare con donatore sano e campioni di sangue dei pazienti derivati ​​e funghi geneticamente manipolati. Si raccomanda vivamente di utilizzare campioni di sangue fresco (uso lo stesso giorno) per aumentare la vitalità delle cellule e preservare la funzionalità. Idealmente, l&#39;isolamento di cellule viene eseguita immediatamente dopo aver disegnato i campioni di sangue e neutrofili sono ripreso immediatamente dopo l&#39;isolamento. In conclusione, una tecnica di imaging di cellule vive di nuova generazione per valutare in grande attività antifungina dettaglio phagocyte contro A. fumigatus è descritto. Questa tecnologia è in grado di fornire una visione unica singole interazioni cellula-fungine nelle prime difese immunitarie innate contro Aspergillus.

Aspergillus fumigatus è un patogeno fungino opportunistica e la causa fungina più comune delle infezioni polmonari invasive nell&#39;ospite immunocompromesso 1, 2. Capire come le cellule immunitarie dell&#39;ospite riconoscere ed eliminare Aspergillus è un settore importante della ricerca di funghi, tuttavia, i saggi fungicide attualmente disponibili hanno limitazioni significative. Metodi comunemente usati per misurare l&#39;attività fungicida includono saggi colorimetrici e determinazione delle unità formanti colonia 3, 4. Tuttavia, tali metodi forniscono informazioni sulla viabilità funghi in un unico punto di tempo anziché visualizzare l&#39;interazione dinamica tra ospite e patogeno. Di conseguenza, questi metodi non possono prendere in considerazione se un fungo è stato ucciso o semplicemente (temporaneamente) limitata in crescita o l&#39;attività metabolica. Abbiamo sviluppato un metodo in grado di osservare fungicil&#39;attività dal direttamente mentre catturando simultaneamente informazioni dettagliate riguardanti la fagocitosi, la migrazione dei fagociti e l&#39;inibizione della crescita di funghi. In precedenza, un protocollo è stato pubblicato utilizzando imaging in tempo reale come un mezzo per misurare la fagocitosi di Candida albicans da una linea cellulare di topo macrofagi 5. Questo concetto è stato ora ulteriormente sviluppato per affrontare il gap di conoscenza nella nostra comprensione delle interazioni con le cellule immunitarie Aspergillus utilizzando fluorescenti Aspergillus Reporter (FLARE) conidi 6, 7, 8. Questi conidi esprimono un fluoroforo rosso (DsRed) e sono etichettati con un secondo fluoroforo (Alexa Fluor 633). Una volta che un conidio FLARE viene ucciso, si smette di produrre DsRed e il restante DsRed svanisce, mentre l&#39;AF633 rimane fluorescente e legato alla conidi. Questo crea una chiara distinzione tra fu vivo e mortocellule NGAL durante l&#39;imaging cellulare dal vivo e citometria a flusso, e consente il monitoraggio del destino dei conidi individuali dopo la loro interazione con le cellule del sistema immunitario. I saggi descritti forniscono un metodo efficace di visualizzare l&#39;interazione tra cellule immunitarie dell&#39;ospite e Aspergillus e saranno di notevole valore nel chiarire le vie di segnalazione cellulari responsabili meccanismi effettori antifungini in cellule immunitarie innate. Altre applicazioni includono la visualizzazione come i cambiamenti nella crescita Aspergillus, come ad esempio il passaggio da riposo a conidi gonfio, o da conidi gonfio di ife, influenzano il riconoscimento dei fagociti e funzione. Il seguente protocollo descrive in dettaglio come ottenere monociti e neutrofili; come preparare il conidi FLARE; e come catturare le loro risposte con il video microscopia e citometria a flusso. Sebbene l&#39;uso di cellule immunitarie umane isolate da sangue del donatore viene qui descritto, questotecnica si è dimostrata altrettanto efficace utilizzando una varietà di popolazioni di cellule murine.

<table><tbody><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>T75 pallone</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 175</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.thermofisher.com/ Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>10592955</td><td>https://nl.fishersci.com/</td></tr> <tr><td>40 &; m filtro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>15 mL Provetta Falcon</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188 261</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>50 mL Provetta Falcon</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>MilliQ Millipore</td><td></td><td>QGARD00R1</td><td>l'acqua nanopura funzionano in modo simile. http://www.merckmillipore.com/</td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td> di <td>biotina</td><td>B-6352</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td> <td>di streptavidina-AF633</td><td>S-21375</td><td>AF633 è l'unico fluoroforo testato finora che rimane visibile nei fagosomi. Provette per</td></tr><tr><td>sangue https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html EDTA</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455036</td><td>Qualsiasi provetta per sangue con un agente anticoagulante dovrebbe funzionare. http://www.greinerbioone.com/en/start/</td></tr> <tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>http://www3.gehealthcare.com/</td></tr><tr><td>Trypan blu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV3008401</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>Microsfere CD14</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>Possono essere utilizzati anche altri metodi di isolamento dei monociti, preferiamo questo metodo in quanto fornisce un'elevata purezza costante dei monociti senza essere laborioso. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>Colonne MS</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Vedere il commento su Microsfere CD14. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>72400-021</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>Mezzo indipendente CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045054</td><td>Necessario se non vi è sufficiente scambio CO2 durante l'imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home</td></tr><tr><td>&micro;-slide 8 pozzetti fondo in vetro</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>Questa è la piastra di imaging che usiamo, tuttavia qualsiasi piastra di imaging in vetro di dimensioni adeguate dovrebbe funzionare. http://ibidi.com/</td></tr> <tr><td>UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>L7267000</td><td>Include il software volocity per l'acquisizione e l'analisi. http://www.perkinelmer.com/</td></tr> <tr><td>Calcofluor bianco</td><td>Sigma</td><td>18909</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Voriconazolo</td><td>Sigma</td><td>PZ0005</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>BD LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Citometro a flusso utilizzato. https://www.bdbiosciences.com/</td></tr></tbody></table>

immagini dal vivo di antifungini attività da human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em&gt; a. fumigatus</em

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus è un patogeno fungino opportunistica causano infezioni invasive nei pazienti immunocompromessi con un alto tasso di mortalità. La ricerca indaga risposte immunologiche contro A. fumigatus è stata limitata dalla mancanza di test coerenti e affidabili per misurare l&#39;attività antifungina di specifiche cellule immunitarie in vitro. Un nuovo metodo è descritto per valutare l&#39;attività antifungina di monociti primari e neutrofili da donatori umani contro A. fumigatus utilizzando fluorescenti Aspergillus Reporter (FLARE) conidi. Queste conidi contengono un reporter DsRed geneticamente codificato, che è costitutivamente espressa da conidi FLARE vivo, e sono esternamente etichettati con Alexa Fluor 633, che è resistente alla degradazione nel fagolisosoma, permettendo così una distinzione tra vivo e morto conidi A. fumigatus. Il video microscopia e citometria a flusso vengono successivamente utilizzati per la visualizzazione interagisconoionico tra conidi e cellule dell&#39;immunità innata, valutando attività fungicida pur fornendo anche una serie di informazioni sulla migrazione dei fagociti, fagocitosi e l&#39;inibizione della crescita fungina. Questa nuova tecnica ha già fornito nuove interessanti intuizioni l&#39;interazione ospite-patogeno delle cellule immunitarie primarie contro A. fumigatus. È importante notare la configurazione di laboratorio necessaria per eseguire questo test, compreso il microscopio necessaria e citometria a flusso strutture, e la capacità di lavorare con donatori di sangue umano e funghi geneticamente manipolati. Tuttavia, questo saggio è in grado di generare grandi quantità di dati e può rivelare forniscono informazioni dettagliate della risposta antimicotico. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare l&#39;interazione ospite-patogeno delle cellule immunitarie primarie contro A. fumigatus. E &#39;importante notare la configurazione di laboratorio necessario per eseguire questo test, tra cui il microscopio necessaria e citometria a flusso facilities, e la capacità di lavorare con donatori di sangue umano e funghi geneticamente manipolati. Tuttavia, questo saggio è in grado di generare grandi quantità di dati e può rivelare forniscono informazioni dettagliate della risposta antimicotico. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare l&#39;interazione ospite-patogeno delle cellule immunitarie primarie contro A. fumigatus.

I risultati rappresentativi sono riportati seguendo il protocollo descritto. La figura 1 illustra un video live-cell 6 h rappresentativo con neutrofili umani e FLARE conidi. DsRed (rosso) è espressa dalla conidi stessi mentre sono stati etichettati con AF633 (magenta). La figura 2 è un&#39;immagine di un singolo punto temporale da un film simile come mostrato in figura 1, che illustra la differenza tra vivo e morto conidi FLARE. conidi morti si distinguono da conidi in diretta da perdere il loro segnale DsRed (rosso), pur mantenendo una fluorescenza AF633 luminoso (magenta). A. fumigatus conidi spesso sopravvivere all&#39;interno di fagociti per oltre 6 ore. Pertanto, per quantificare efficacemente uccidere, citofluorimetria trame sono mostrati per un periodo di incubazione 16 h in figura 3. Questi dati sono stati ottenuti con una ce macrofagi alveolarill linea come esempio, ma può essere eseguita con qualsiasi tipo di cellula. In figura 4 la migrazione è mostrato nella prima ora di stimolazione per i neutrofili umani e la loro velocità e movimento direzionale. La Figura 5 mostra la percentuale di neutrofili e monociti che hanno ingerito 1, 2, 3 o più conidi mentre la figura 6 mostra il numero di conidi che germinano in ife. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig1.jpg" /> Figura 1: Live-cell microscopia video film di neutrofili umani e FLARE conidi. I neutrofili sono stati isolati da sangue umano e seminate insieme FLARE conidi di CO 2 di media indipendenti con un rapporto di 1: 3, rispettivamente. Imaging è stato avviato direttamente a 37 ° C con un microscopio confocale disco rotante. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min e 55 s per un periodo di 6 ore. bar scala = 10 micron.Un ingrandimento in video è mostrato con i canali separati per chiarire il ruolo dei conidi FLARE con DIC in alto a sinistra, DsRed (rosso) in alto a destra, AF633 (verde) in basso a sinistra e il video unito in basso a destra . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">Cliccate qui per scaricare questo video.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig2.jpg" /> Figura 2: immagine punto temporale singolo dimostrare la differenza tra vivo e morto conidi FLARE. neutrofili umani sono state stimolate con FLARE conidi e ripreso con un microscopio confocale a disco rotante. L&#39;immagine è stata scattata dai film generati. conidi morti si distinguono dalle ife avendo perso il loro DsRed (rosso: in alto a destra) del segnale, pur mantenendo la loro fluorescenza AF633 (verde: in basso a sinistra). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig2large.jpg">Si prega di cliccare qui per</a><html> Una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig3.jpg" /> Figura 3: Quantificazione e validazione di fagocitosi e l&#39;uccisione di A. fumigatus conidi. macrofagi alveolari di topo (MH-S) sono stati incubati con FLARE conidi in un rapporto 1: 1 per 16 ore in presenza di voriconazolo. cellule MH-S associati conidi vivi sono mostrati nella porta rosso (+ DsRed AF633 +). cellule MH-S associati conidi morti sono mostrati nella porta blu (DsRed-AF633 +). cellule spettatore MH-S sono mostrati nella porta oro. Calcofluor bianco, un colorante fluorescente cellulare impermeabile che si lega alla parete cellulare fungina, è usato per distinguere extracellulare conidi (Calcofluor bianco +) da conidi intracellulare (calcofluor White-). Come una convalida supplementare al metodo, è dimostrato che il trattamento con citocalasina D 2 mM inibisce l&#39;assorbimento da parte delle cellule conidi MH-S.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg&quot;&gt;Please clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig4.jpg" /> Figura 4: La migrazione dei neutrofili e monociti umani contro A. fumigatus conidi. I neutrofili sono stati isolati da sangue umano e seminate insieme FLARE conidi di CO 2 di media indipendenti con un rapporto di 1: 3, rispettivamente. Imaging è stato avviato direttamente a 37 ° C con un microscopio confocale disco rotante. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min e 55 s per un periodo di 6 ore. La migrazione di tutti i singoli neutrofili umani per campo è stato manualmente monitorati tramite il software di monitoraggio nei confronti di riposo (A) e gonfia (B) conidi per 1 ora. Dati rappresentano 1 fotogramma di celle per ogni condizione dello stesso donatore. Il fattore meandri (C), una misura di directiomovimento nal, e la velocità (D) sono stati poi quantificati utilizzando lo stesso software. Media ± SEM per 3 donatori sono indicati con 30 cellule per donatore oltre 2 esperimenti indipendenti. *: P &lt;0,05 (test t corretto di Welch). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig5.jpg" /> Figura 5: fagocitosi di A. fumigatus conidi dai neutrofili e monociti umani. Neutrofili e monociti sono stati isolati da sangue umano e seminate insieme FLARE conidi di CO 2 di media indipendenti con un rapporto di 1: 3, rispettivamente. Imaging è stato avviato direttamente a 37 ° C con un microscopio confocale disco rotante. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min e 55 s per un periodo di 6 ore. Fagocitosi è stata misurata come la quantità di cellule contengonoing FLARE conidi dopo 4 ore di stimolazione. I dati sono presentati come media ± SEM da 3 donatori e 3 fotogrammi al donatore oltre 2 esperimenti indipendenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig6.jpg" /> Figura 6: Inibizione di germinazione di A. fumigatus conidi dai neutrofili e monociti. Neutrofili e monociti sono stati isolati da sangue umano e seminate insieme FLARE conidi di CO 2 di media indipendenti con un rapporto di 1: 3, rispettivamente. Imaging è stato avviato direttamente a 37 ° C con un microscopio confocale disco rotante. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min e 55 s per un periodo di 6 ore. L&#39;inibizione della germinazione di funghi è stata esaminata misurando la percentuale di conidi che ha avuto germeinati dopo 2, 4 e 6 ore di co-coltura. I dati sono presentati come media ± SEM da 3 donatori e 3 fotogrammi al donatore oltre 2 esperimenti indipendenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, descriviamo un protocollo per valutare l&#39;attività antifungina di cellule immunitarie umane primarie in tempo reale utilizzando fluorescente Aspergillus conidi giornalista in combinazione con microscopia video live-cell e citometria a flusso. Dati generati forniscono informazioni sulle interazioni di accoglienza cellulo Aspergillus, come fungicida, fagocitosi, la migrazione delle cellule e l&#39;inibizione della crescita di funghi.

Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare in tempo reale l'attività antifungina delle cellule immunitarie primarie umane, utilizzando conidi marcatori fluorescenti di Aspergillus e microscopia video su cellule vive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo le risposte immunitarie contro le infezioni fungine in specifiche popolazioni di pazienti, in particolare la risposta immunitaria innata che si verifica precocemente dopo l'esposizione ai funghi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di identificare difetti specifici nell'immunità innata e antifungina, come la fagocitosi, la migrazione cellulare, l'uccisione dei microrganismi e l'inibizione della crescita fungina.Per iniziare, effettuare un’isolazione su agar del ceppo di aspergillus fumigatus AF293 contenente il gene reporter fluorescente dsRed in due fiasche T75. Incubare le colture a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per sette giorni per ottenere circa 10 alla nona conidi. Al termine dell'incubazione, immergere le colture in 20 millilitri di PBS con 0,05% di Tween 80 e raccogliere i conidi di A fumigatus.Quindi, utilizzando un filtro cellulare da 40 micrometri, filtrare le sospensioni ottenute in un tubo da 50 millilitri per rimuovere i frammenti ifali. Una volta filtrate le sospensioni, centrifugarle a 805 ×g per 10 minuti. Successivamente, eliminare i soprannatanti e risospendere i pellet in 20 millilitri di PBS sterile.Infine, unire i campioni e centrifugare la sospensione ottenuta un'ultima volta. Risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS e trasferire aliquote di un millilitro della sospensione conidiale ottenuta in provette per microcentrifuga. Centrifugare le aliquote a 9.300 × g a temperatura ambiente per 10 minuti.Quindi aspirare con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet di conidi in un millilitro di bicarbonato di sodio 0,05 moli con un PH di 8,3. Per etichettare i conidi, aggiungere 10 microlitri della soluzione madre di biotina al tubo da microcentrifuga, coprire il campione con della carta d'alluminio e incubare per due ore su un agitatore a quattro gradi Celsius. Dopo aver centrifugato il campione marcato con biotina per 10 minuti a 9.300 ×g, rimuovere con attenzione il soprannatante.Quindi risospendere il pellet di conidi in un millilitro di soluzione di Tris-HCl 100 micromolare con un pH di 8,0. Incubare questa sospensione a quattro gradi Celsius per un'ora con agitazione delicata per disattivare la biotina non legata. Centrifugare il campione a 9.300 ×g per 10 minuti.Rimuovere con attenzione il soprannatante ottenuto, lavare il pellet con un millilitro di PBS sterile e risospendere il pellet in un millilitro di PBS. Quindi aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre di Streptavidina-AF633 a un millilitro della sospensione conidiale. Incubare questa sospensione, coperta con pellicola di alluminio, per 40 minuti a temperatura ambiente su un agitatore rotante.Centrifugare il campione a 9.300 ×g per 10 minuti. Rimuovere quindi con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet di conidi in un millilitro di PBS. Utilizzando un emocitometro, contare i conidi a una diluizione di uno a 1.000 e quindi aggiustare la concentrazione di conidi a 3,6 × 10⁶ conidi per millilitro con mezzo indipendente dal CO₂.Infine, avvolgere la sospensione nella pellicola di alluminio e conservare a quattro gradi Celsius. Raccogliere e diluire un campione di sangue umano con PBS. Successivamente, utilizzare una siringa con un ago di ferro per sovrapporre al campione di sangue 15 millilitri di un mezzo per l'isolamento delle cellule mononucleate.Centrifugare il campione a 630 ×g per 20 minuti senza frenata e con accelerazione bassa. Raccogliere con una pipetta di Pasteur lo strato centrale di PBMC localizzato tra il siero giallo e lo strato trasparente della soluzione per l'isolamento dei linfociti. Successivamente, trasferire la sospensione raccolta in un nuovo tubo da 50 millilitri.Diluire i PBMC con PBS per ottenere 50 millilitri di sospensione e lavare le cellule. Dopo il lavaggio, mescolare 20 microlitri di sospensione cellulare con 160 microlitri di PBS e 20 microlitri di blu di tripano e contare le cellule con un emocitometro. Dopo il conteggio, diluire a una concentrazione appropriata in un tubo da 15 millilitri, centrifugare le cellule per 10 minuti a 515 ×g e quindi risospendere utilizzando 40 microlitri di soluzione tampone per 1 × 10⁷ cellule.Aggiungere 10 microlitri di MicroBeads CD14 per 1 × 10⁷ cellule e mescolare accuratamente. Incubare il campione a 4 °C per 15 minuti, assicurandosi di mescolare il tubo ogni 5 minuti. Dopo la coniugazione, lavare le cellule con 1 millilitro di soluzione tampone per 1 × 10⁷ cellule e centrifugare la sospensione a 515 × g per 10 minuti.Quindi risospendere fino a 1 × 10⁸ cellule in 500 microlitri di soluzione tampone. Montare una colonna, che verrà utilizzata con un singolo campione, su un separatore magnetico seguendo le istruzioni del produttore e lavare la colonna una volta con 500 microlitri di soluzione tampone. Applicare 500 microlitri della sospensione cellulare sulla colonna.Una volta asciutta, lavare la colonna tre volte utilizzando la soluzione tampone. Posizionare un nuovo tubo da 15 millilitri sotto la colonna e staccare la colonna dal separatore magnetico. Quindi, utilizzando un millilitro di soluzione tampone, eluire le cellule dalla colonna nel tubo.Lavare e risospendere le cellule eluite nel mezzo RPMI. Dopo aver aggiustato la densità cellulare a sei volte 10 alla 5a cellule per millilitro, seminare 200 microlitri della sospensione in una piastra per imaging con fondo in vetro da 35 millimetri. Incubare la coltura tutta la notte a 37 gradi Celsius con 5% CO2.Per isolare i neutrofili, rimuovere tutto il siero e la maggior parte della soluzione per l'isolamento dei linfociti dal campione di sangue rimanente dopo il recupero dei PBMC. Assicurarsi di non rimuovere la sottile banda bianca posta sopra il pellet rosso. Mantenendo le cellule sul ghiaccio, lisare quindi i globuli rossi e centrifugare i neutrofili rimanenti a 394 × g. Successivamente, lavare le cellule due volte con PBS freddo e quindi risospendere in un millilitro di un mezzo indipendente dal CO2.Per la citometria a flusso, regolare la densità cellulare a sei volte 10 alla 5a cellule per millilitro e aggiungere 400 microlitri della sospensione cellulare in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 200 microlitri della stessa sospensione cellulare in una piastra per imaging con fondo in vetro da 35 millimetri per l'esame al microscopio. Per visualizzare dsRed e Alexa Fluor 633 durante la microscopia, preriscaldare il riscaldatore del microscopio e accendere il microscopio e il computer.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di sospensione conidiale FLARE a tre volte 10 alla sesta per millilitro nelle pozzette appropriate della piastra per imaging. Registrare il momento in cui vengono aggiunti i conidi FLARE. Montare la piastra per imaging sul palco del microscopio, quindi nelle impostazioni di acquisizione, impostare la potenza del laser al 10% e il tempo di esposizione a un secondo.Regolare la sensibilità della telecamera per ottenere un'immagine chiara ma non sovraesposta di dsRed e AF633 e impostare un elenco di punti dello stage. Avviare l'acquisizione quando tutti i punti sono a fuoco, i canali fluorescenti sono ottimizzati e sono stati impostati il tempo di ciclo e la durata. Di seguito sono mostrate immagini acquisite durante una coltura simultanea di neutrofili e conidi FLARE.Il segnale fluorescente verde corrispondente alla colorazione con AF633 è visibile sia nelle conidie vive che in quelle morte. Mentre la fluorescenza dsRed può essere osservata esclusivamente nelle conidie vive. Pertanto, tra tutte le conidie rilevate, solo quelle colorate contemporaneamente con entrambi i coloranti e visibili come punti magenta sono vive.La fagocitosi e l'uccisione delle conidie di A fumigatus co-coltivate con cellule di macrofagi alveolari di topo è stata quantificata mediante citometria a flusso. Nell'analisi, i macrofagi bystander sono contrassegnati con un gate arancione, mentre i macrofagi associati a conidie morte e positivi solo per la colorazione AF633 sono mostrati all'interno del gate blu. Inoltre, le conidie morte non mostrano colorazione con calcofluor white, indicandone la localizzazione intracellulare.Le conidie vive marcate sia con dsRed che con AF633 sono individuate con un gate rosso; queste conidie sono inoltre internalizzate all'interno delle cellule macrofagiche, come dimostrato dalla ridotta colorazione con calcofluor white. Infine, è stata valutata l'influenza di A fumigatus sulla migrazione dei neutrofili umani, che ha rivelato un aumento del movimento e della velocità delle cellule immunitarie in risposta a conidie rigonfie rispetto a conidie in riposo. Una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in otto ore per una singola popolazione cellulare.Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le cellule sul ghiaccio. Dopo questa procedura, altri metodi come la misurazione delle specie reattive dell'ossigeno o la citocinesi possono essere eseguiti per ottenere ulteriori informazioni riguardo alla risposta immunitaria innata antifungina nella stessa popolazione cellulare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia fungina per studiare la fagocitosi e l'uccisione antifungina utilizzando patogeni fungini in cellule immunitarie primarie.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare in tempo reale le risposte immunitarie innate antifungine di cellule immunitarie umane primarie, utilizzando conidi marcatori fluorescenti di Aspergillus e microscopia video su cellule vive. Non dimenticare che lavorare con sangue umano può essere pericoloso e che devono sempre essere adottate adeguate precauzioni con dispositivi di protezione individuale (PPE) per prevenire la trasmissione di infezioni.

live-imaging-antifungal-activity-human-primary-neutrophils-monocytes

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

Questo video mostra l'imaging di cellule vive per l'analisi dell'attività antifungina nei neutrofili umani utilizzando conidi reporter fluorescenti di Aspergillus. Inizialmente, sia la fluorescenza rossa che quella magenta sono rilevate all'interno dei neutrofili, mentre la fluorescenza rossa diminuisce nel tempo, indicando la degradazione dei conidi e confermando l'attività antifungina dei neutrofili.

Valutazione in tempo reale dell'attività antifungina delle cellule immunitarie umane primarie

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia...

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Un metodo per valutare la capacità di isolato macrofagi alveolari del mouse per controllare la crescita di spore di Aspergillus fagocitati mediante microscopia confocale.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

Defensine pianta gioca un ruolo importante nella difesa delle piante contro gli agenti patogeni. Per un uso efficace di questi peptidi antimicotici come agenti antifungini, comprendere le loro modalità di azione (MOA) è critico. Qui, è descritto un metodo di imaging di cellule vive per studiare aspetti critici di MOA di questi peptidi.

Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta

Questo protocollo fornisce un metodo veloce e affidabile per misurare quantitativamente la fagocitosi di Aspergillus fumigatus conidia da fagociti primari umani utilizzando la citometria di flusso e per discriminare la fagocitosi di conidia dalla mera adesione ai leucociti.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

I coloranti fluorescenti vitali sono strumenti essenziali per l'analisi dell'imaging a cellule vive nella moderna biologia delle cellule fungine. Questo documento descrive in dettaglio l'applicazione di coloranti fluorescenti affermati e meno noti per il monitoraggio della dinamica della membrana plasmatica, dell'endo/esocitosi e della morfogenesi delle pareti cellulari nei funghi filamentosi.

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

I protocolli qui descritti forniscono una guida per visualizzare e quantificare l'attività delle proteasi neutrofile nell'espettorato umano. Le applicazioni di tale analisi spaziano dalla valutazione dei trattamenti antinfiammatori, alla convalida del biomarcatore, allo screening farmacologico e agli studi clinici di coorte di grandi dimensioni.

Monitoraggio dell'attività neutrofila elastasi e cathepsin G nei campioni di espettorato umano

A causa dell'opacità del suolo, le interazioni tra i suoi microbi costituenti non possono essere facilmente visualizzate con risoluzione cellulare. Qui vengono presentati due strumenti microfluidici, che offrono nuove opportunità per studiare le interazioni fungo-microbiche. I dispositivi sono versatili e semplici da usare, consentendo un elevato controllo spaziotemporale e immagini ad alta risoluzione a livello cellulare.

Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato che utilizza guaine fogliari di mais staccate per studi citologici, fisiologici e molecolari riproducibili delle interazioni del mais con i patogeni fungini delle piante. Le guaine fogliari facilitano l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellulari tra la pianta vivente e il fungo nei tessuti non fissati.

Guaine di mais staccate per l'imaging su cellule vive dell'infezione da patogeni fungini del mais fogliare

Scopri come valutare l'attività antifungina di neutrofili e monociti umani primari in tempo reale usando conidi di Aspergillus fluorescenti e microscopia video. Questo metodo identifica difetti specifici nell'immunità innata.

Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a

Esplora altri video