Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio
March 12th, 2017
Descriviamo un approccio sperimentale di base per l'analisi della terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo utilizzando BrUTP con l'approccio TRO (Strand-specific Transcription Run-on) in lievito in gemmazione. Questo protocollo può essere esteso per studiare la terminazione della trascrizione da parte di altre RNA polimerasi sia nel lievito che negli eucarioti superiori.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi nel lievito in gemmazione in condizioni in vivo mediante l'approccio di trascrizione specifica del filamento. Questo metodo aiuta a rispondere alla domanda chiave se la polimerasi trascrizionalmente attiva rilevata oltre le tre estremità prime del gene sia quella iniziata dalla regione del promotore. Il vantaggio principale di questo metodo è che può distinguere una polimerasi trascrittore MRNA da una polimerasi trascrivente pervasivamente che ha avviato le trascrizioni e si troverà alle tre estremità principali del gene.
Questa tecnica può essere estesa per studiare la terminazione della trascrizione da parte di altre RNA polimerasi e lieviti a causa della natura conservativa della terminazione da parte di diverse polimerasi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul ruolo preciso dei fattori di terminazione nel ciclo di trascrizione del lievito, può anche essere esteso allo studio della terminazione negli eucarioti superiori. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la permeabilizzazione cellulare e la trascrizione eseguita a tappe, poiché richiedono un'esecuzione attenta e le trascrizioni nascenti possono anche essere difficili da purificare.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta dall'approccio GRO seek che fornisce un'istantanea dell'intero genoma della posizione delle polimerasi trascrizionalmente attive in un modo specifico per il filamento. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la trascrizione e la purificazione dell'RNA sono difficili da eseguire a causa della bassa quantità e della natura instabile dei trascritti nascenti. Prima di iniziare la trascrizione, eseguire la reazione, coltivare, raccogliere e permeabilizzare le cellule di lievito a crescita esponenziale, per ottenere una tavolozza cellulare permeabilizzata.
Per avviare la reazione, aggiungere 150 microlitri di trascrizione eseguita su tampone alla tavolozza cellulare permeabilizzata. Utilizzando un puntale P-200 troncato, miscelare delicatamente pipettando su e giù. Posizionare il campione sul ghiaccio.
Dopo che tutti i campioni sono stati risospesi nella trascrizione su tampone, incubare i campioni per cinque minuti a 30 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Arresta la reazione aggiungendo 500 microlitri di reagente di isolamento dell'RNA freddo pronto all'uso a ciascun campione. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Iniziare la procedura di estrazione dell'RNA aggiungendo 200 microlitri di perle di vetro lavate con acido a ciascuna sospensione cellulare e agitando energicamente in un miscelatore a vortice per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti, utilizzare un ago caldo calibro 22 per forare il fondo di ciascuna provetta per microcentrifuga e posizionare la provetta sulla parte superiore di una provetta conica sterile da 15 millilitri. Centrifugare a 300 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius e trasferire il lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Aggiungere 500 microlitri di reagente di isolamento dell'RNA freddo e 200 microlitri di cloroformio al lisato cellulare. Mescolare il contenuto sul miscelatore a vortice e poi centrifugare a 16, 168 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta per microcentrifuga.
Aggiungere un volume uguale di alcol isoamilico fenolico cloroformio freddo. Agitare energicamente sul miscelatore a vortice e centrifugare a 16, 168 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la fase acquosa superiore contenente l'RNA in una nuova provetta da microcentrifuga.
Aggiungere un volume uguale di alcol isoamilico fenolico cloroformio freddo, agitare e centrifugare di nuovo. All'RNA finale contenente la fase acquosa aggiungere un volume appropriato di un stock di cloruro di sodio a cinque molari per ottenere una concentrazione finale di 0,3 molari. Aggiungere tre volte il volume di etanolo freddo per far precipitare l'RNA.
Incubare per un'ora, o durante la notte, a 20 gradi Celsius. Al termine della precipitazione dell'RNA, centrifugare a 16, 168 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e risospendere la tavolozza di RNA in 100 microlitri di acqua DEPC.
Utilizzare un kit di isolamento dell'RNA per separare l'RNA dai nucleotidi bromouridina trifosfato non incorporati ed eluire l'RNA dalla colonna con 100 microlitri di acqua priva di RNAsi. Incubare l'RNA in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per cinque minuti. E poi trasferire sul ghiaccio per almeno due minuti.
Inizia questa procedura preparando le perle di uranio impoverito anti bromo mentre l'RNA viene precipitato. Per ogni campione, aggiungere 500 microlitri di tampone legante l'EDTA di fosfato salino di sodio 0,25 X a 25 microlitri di perle stabilizzate. Centrifugare a 200 volte G per 30 secondi a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.
Lavare le perline tre volte con il tampone di legatura. Dopo aver rimosso il surnatante dal terzo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante alle perle e agitare delicatamente per una o due ore a quattro gradi Celsius su uno shaker a piattaforma. Lavare le perline altre due volte con 500 microlitri di tampone legante.
Rimuovere il surnatante dal secondo lavaggio e aggiungere 400 microlitri di tampone legante alle perline. Trasferire 100 microlitri di RNA direttamente nelle perline. Incubare con agitazione delicata per una o due ore a quattro gradi Celsius su un agitatore a piattaforma.
Centrifugare a 200 volte G per 30 secondi a quattro gradi Celsius e quindi rimuovere il surnatante. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone legante alle perline. Centrifugare a 200 volte G per 30 secondi a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.
In questo modo, lavare le perle in sequenza con il tampone legante, il tampone a basso contenuto di sale, il tampone ad alto contenuto di sale e due volte con il tampone TET. Per eluire l'RNA marcato con bromouridina trifosfato dalle perle, aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione e incubare per quattro minuti a 42 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Gira brevemente verso il basso e raccogli il surnatante.
In questo modo, eluire in sequenza due volte con 150 microlitri e una volta con 200 microlitri di tampone di eluizione. Da ciascun campione dovrebbero essere ottenuti circa 500 microlitri di RNA marcato con bromouridina trifosfato purificato per affinità. Per precipitare l'RNA marcato con bromouridina trifosfato purificato per affinità, aggiungere 500 microlitri di alcol isoamilico fenoliforme fenolinico freddo a ciascun campione.
Agitare e centrifugare a 16, 168 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta per microcentrifuga. Aggiungere il volume appropriato di un ceppo di cloruro di sodio a cinque molari per ottenere una concentrazione finale di 0,3 molari.
Quindi aggiungere tre volte il volume di etanolo freddo. Incubare a 20 gradi Celsius durante la notte per far precipitare l'RNA. Il giorno seguente, raccogliere l'RNA precipitato mediante centrifugazione a 16, 168 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e lasciare asciugare la tavolozza all'aria per 10 minuti. Risospendere la tavolozza di RNA in 26 microlitri di acqua DEPC. Determinare la concentrazione finale di RNA misurando l'assorbanza a 260 nanometri utilizzando uno spettrofotometro.
Conservare i campioni di RNA e le aliquote a 80 gradi Celsius fino a quando non sono necessari per la sintesi del cDNA. L'approccio di trascrizione specifica del filamento di bromouridina trifosfato è stato utilizzato per testare il requisito dell'RNA 14 per la terminazione della trascrizione del gene ASC1 nel lievito in gemmazione. L'RNA marcato con bromouridina trifosfato proveniente dal mutante RNA 14-1 e dalle sue cellule isogeniche di tipo selvatico è stato purificato e trascritto inversamente con i primer C, D, E, F e G. Il cDNA corrispondente è stato amplificato mediante PCR utilizzando le coppie di primer B e C, B e D, B ed E, B e F, B e G e frazionato su gel di agarosio.
La presenza di prodotti amplificati con PCR dalle coppie di primer B ed E, B e F e B e G nel mutante, riflette un fenotipo readthrough di terminazione. Nelle cellule wild type, tuttavia, la trascrizione sul segnale era limitata fino all'elemento terminatore e non c'era alcuna trascrizione rilevabile sul segnale oltre la regione del terminatore. Questo grafico mostra la quantificazione dei gel con cinque S RNA come controllo di normalizzazione.
L'individuazione di trascritti nascenti avviati dal promotore che leggono il segnale di terminazione nelle cellule mutanti ma non in quelle wild type conferma che l'RNA 14 è un fattore di terminazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che la trascrizione di reazione è fondamentale per ottenere un risultato di successo.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la ricerca GRO, per rispondere a domande aggiuntive, come il ruolo di un fattore di terminazione nell'intero genoma. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della trascrizione per esplorare la terminazione da parte di altre RNA polimerasi nel lievito e nei sistemi eucariotici superiori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la trascrizione, eseguire le reazioni e purificare i trascritti marcati nascenti.
Non dimenticare che l'RNA può essere estremamente instabile e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come indossare guanti, mantenere la temperatura intorno ai quattro gradi Celsius e utilizzare agenti privi di RNAsi.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per analizzare la terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo utilizzando BrUTP e l'approccio di trascrizione run-on (TRO) specifico per filamento in lievito in gemmazione. Il protocollo può anche essere adattato per studiare la terminazione della trascrizione da parte di altre RNA polimerasi sia nel lievito che negli eucarioti superiori.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Regolazione trascrizionale
- Attività della RNA polimerasi
- Biologia molecolare del lievito
Sfondo
- La terminazione della trascrizione è un processo critico nell'espressione genica.
- L'approccio di trascrizione run-on specifico per filamento consente l'analisi delle dinamiche di trascrizione.
- Questo metodo può differenziare tra vari tipi di RNA polimerasi.
- Comprendere i fattori di terminazione è essenziale per chiarire il ciclo di trascrizione nel lievito.
Scopo dello studio
- Indagare la terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo.
- Determinare se le polimerasi trascrizionalmente attive siano avviate dalla regione del promotore.
- Estendere i risultati ad altre RNA polimerasi in diversi organismi.
Metodi utilizzati
- Approccio di trascrizione run-on (TRO) specifico per filamento.
- Utilizzo di BrUTP per la marcatura dei trascrittori di RNA nascente.
- Tecniche di permeabilizzazione cellulare per un'analisi efficace della trascrizione.
- Metodi di purificazione per i trascrittori nascenti.
Principali risultati
- Il metodo distingue con successo tra polimerasi che trascrivono mRNA e polimerasi che trascrivono in modo pervasivo.
- Sono state ottenute informazioni sul ruolo dei fattori di terminazione nel ciclo di trascrizione.
- L'approccio può essere adattato per l'uso negli eucarioti superiori.
- Sono state identificate sfide nell'esecuzione, come la permeabilizzazione cellulare, per i nuovi utenti.
Conclusioni
- L'approccio TRO specifico per filamento è efficace per studiare la terminazione della trascrizione.
- Comprendere la terminazione della trascrizione può fornire informazioni sulla regolazione genica.
- Questo metodo ha ampie applicazioni in diverse specie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables precise detection of transcription termination defects in vivo, addressing a key challenge in target validation where distinguishing true promoter-initiated readthrough from pervasive transcription is essential for mechanistic de-risking. By providing strand-specific, quantitative readouts of polymerase activity beyond terminator regions, it supports predictive confidence in early discovery stages focused on RNA polymerase II and termination factor biology. The approach offers translational continuity from yeast models to higher eukaryotes, facilitating cross-species target validation and preclinical pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining whether observed transcription readthrough stems from promoter-initiated polymerase activity rather than non-specific initiation.
- Operational Value: Enables functional validation of termination factors as drug targets by isolating their specific role in the transcription cycle.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing mechanistic evidence that reduces ambiguity in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces strand-specific nascent RNA signals that serve as quantitative readouts for screening compounds or genetic perturbations affecting termination.
- Operational Value: Generates reproducible, affinity-purified BrUTP-labeled RNA suitable for downstream qPCR or sequencing applications in assay development pipelines.
- Scalability: The protocol’s reliance on standardized permeabilization and purification steps enables adaptation to multi-well formats for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects termination mechanism studies in yeast to conserved pathways in higher eukaryotes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by validating target function across model systems before moving to mammalian validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes are due to specific termination factor loss versus pervasive transcriptional noise, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, particularly when termination mechanisms are under investigation, and supports handoff to preclinical teams via standardized, quantifiable outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by distinguishing promoter-driven transcription from background noise, aiding in pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready, strand-specific nascent RNA that enables reliable comparison of genetic or pharmacological conditions affecting termination efficiency.
- Analytics: Provides amplifiable cDNA from purified BrUTP-labeled RNA, enabling quantitative PCR or sequencing readouts that help teams compare termination proficiency across conditions.
- Translational Research: Connects yeast-based termination findings to higher eukaryotes through conserved polymerase mechanisms, supporting preclinical continuity only when cross-species conservation is demonstrated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for termination analysis that can be applied across multiple targets and projects within nucleic acid-targeted discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in transcription termination studies through strand-specific discrimination.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined permeabilization, labeling, and purification steps that minimize user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering target-specific mechanistic data, reducing late-stage biological risk in RNA-focused therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of termination factor targets based on validated, quantitative evidence of functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, RNA handling, and nucleic acid purification techniques to manage unstable nascent transcripts.
- Dependent on access to BrUTP, RNA isolation reagents, phenol-chloroform workflows, and specialized beads for affinity purification of bromouridine-labeled RNA.
- Necessitates cross-team standardization between discovery biology and analytics groups to ensure consistent RNA yield, labeling efficiency, and cDNA synthesis quality.
- Adaptation to mammalian or higher eukaryotic systems may require optimization of permeabilization conditions and validation of BrUTP incorporation efficiency.
- Practical limitations include low yield of nascent transcripts and technical difficulty in RNA purification, which may affect scalability for high-throughput applications without automation support.
