Name: Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Impara l'analisi della terminazione della trascrizione con l'approccio TRO strand-specifico e BrUTP nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo distingue le RNA polimerasi attive e aiuta a studiare i fattori di terminazione.

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La ricerca nel laboratorio di Ansari è stata supportata dalla borsa di ricerca (No. MCB 1020911) dalla National Science Foundation.

NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nell&#39;articolo ricerca riportata nel Medler, S e Ansari, A. 2. 1. la coltura e la raccolta delle cellule <ol><li> Avviare una cultura 5 mL di cellule in terreno YPD (estratto di 10 g / L di lievito, 20 g / L peptone, 2% di destrosio) da una piastra di Saccharomyces cerevisiae appena striato. </li><li> Far crescere le cellule durante la notte in un agitatore orbitale a 30 ° C e 250 rpm. </li><li> Diluire la coltura cresciuta overnight 100 orari ad un volume finale di 100 ml in mezzo YPD in un pallone da 250 mL confuso. NOTA: E &#39;necessario un totale di 100 ml di coltura per reazione TRO; se sono necessari più reazioni, deve essere utilizzato un volume maggiore di cultura. </li><li> Far crescere le cellule ad una densità ottica pari a 0,8 - 1,0 in 600 nm (A 600 ~ 0,8 - 1.0). </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 820 xg per 5 minuti a 4 ° C in un contenitore sterile tubo da 50 ml. </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml di ghiaccio freddo bu TMNffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl) e incubare in ghiaccio per 5 min. </li><li> Centrifugare a 820 xg per 5 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule. Rimuovere delicatamente il surnatante tramite aspirazione. </li></ol> 2. permeabilizzante e preparare cellule per Run-on Assay <ol><li> Risospendere le cellule in 1 ml di soluzione Sarkosyl 0,6% pipettando su e giù delicatamente con un tronco di P 1000 punta. Trasferire la sospensione cellulare ad una refrigerata 1,5 ml provetta. </li><li> Agitare gentilmente le cellule a 4 ° C per 25 minuti su un agitatore piattaforma. NOTA: i tubi microcentrifuga devono essere imballati in una provetta da 50 ml con ghiaccio per mantenere una temperatura fredda, evitando possibilità di eventuali nuovi eventi di iniziazione che si verificano al promotore in questa fase. </li><li> Centrifugare le cellule a 1200 xg per 6 minuti a 4 ° C usando un tavolo refrigerata centrifuga. </li><li> Aspirare delicatamente il surnatante per rimuovere il liquido in eccesso dal alpellet cellulare meabilized. </li></ol> 3. Trascrizione Run-on Reaction <ol><li> Aggiungere 150 ml di trascrizione di run-in di buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 2 mM DTT (ditiotreitolo), 0,75 mm ciascuno di ATP, CTP, GTP, e BrUTP, 200 U RNAsi inibitore) al pellet di cellule permeabilizzate. </li><li> Mescolare delicatamente pipettando su e giù con un tronco di P 200 punta. NOTA: Se l&#39;elaborazione di più campioni, tenere tutto in ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono pronti e quindi procedere alla fase successiva. </li><li> Incubare per 5 minuti a 30 ° C in un bagno d&#39;acqua. NOTA: Regolare il tempo di incubazione tra 1 e 5 min per assicurare integrazione ottimale del BrUTP nel RNA nascente. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 500 ml di freddo reagente isolamento RNA pronto per l&#39;uso. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li></ol> 4. RNA Estrazione <ol><li> Aggiungere 200 ml di perline di vetro lavata con acido al suspensi cellularesu (passo 3,4), e agitare vigorosamente per 20 minuti a 4 ° C in un vortex. </li><li> Forare il fondo della provetta utilizzando un 22 G ago caldo e posizionarlo sulla parte superiore di un tubo conico sterile da 15 ml. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 1 min a 4 ° C per raccogliere il lisato cellulare. Trasferire il lisato cellulare di una provetta da microcentrifuga da 1,5. </li><li> Aggiungere 500 ml di RNA freddo reagente isolamento e 200 ml di cloroformio al lisato cellulare. Mescolare il contenuto su un vortex e centrifugare a 16.168 xg per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire la fase acquosa superiore ad una nuova provetta. </li><li> Aggiungere un volume uguale di fenolo freddo / cloroformio / alcool isoamilico (125: 24: 1) pH 4-5. Agitare vigorosamente su un vortex e centrifugare a 16.168 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire la fase acquosa contenente RNA superiore ad una nuova provetta. Ripetere il punto 4.6 altre due volte. </li><li> Per la fase acquosa finale di RNA contenenti, aggiungere 5 M NaCl stock per ottenere una concentrazione finale di 0,3 M. Aggiungere 3 volte la quantità in volume di etanolo freddo per precipitare l&#39;RNA. <ol><li> Incubare per 1 ora o durante la notte a -20 ° C. NOTA: Eseguire le operazioni da 4.9 - 4.11, mentre le perle anti-BrdU vengono incubate per bloccare (vedi punto 5.3). </li></ol></li><li> Centrifugare a 16.168 xg per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di RNA in 100 ml di acqua DEPC (dietilpirocarbonato). </li><li> Utilizzare un isolamento mini kit di RNA per separare l&#39;RNA dai nucleotidi BrUTP prive di personalità giuridica. Eluire l&#39;RNA dalla colonna con 100 ml di acqua RNasi-free. </li><li> Incubare l&#39;RNA in un bagno d&#39;acqua a 65 ° C per 5 minuti e poi trasferire in ghiaccio per almeno 2 min. </li></ol> 5. Affinità Purificazione di RNA BrUTP marcato <ol><li> Per 25 ml di anti-BrdU stabilì perline, aggiungere 500 ml di 0,25x SSPE (sodio fosfato salino EDTA) tampone di legame (20x PESS: 3 M di NaCl, 0,2 M NaH 2 PO 4 </sub&gt;, 0,02 M EDTA, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 37,5 mM NaCl). Centrifugare a 200 xg per 30 s a 4 ° C e rimuovere il surnatante. </li><li> Ripetere il passaggio 5.1 tre volte. </li><li> Aggiungere 500 ml di tampone di bloccaggio (1x Binding Buffer, 0.1% polivinilpirrolidone, 1 mg di ultra-puri albumina sierica bovina (BSA)) per le perline e agitare delicatamente per 1 - 2 ore a 4 ° C su un agitatore piattaforma. </li><li> Lavare le perline altre due volte con 500 ml di tampone di legame, come descritto al punto 5.1. </li><li> Aggiungere 400 ml di Binding Buffer ai talloni. </li><li> Trasferire 100 ml di RNA (dal punto 4.11) direttamente ai talloni. Incubare con delicata agitazione per 1 - 2 ore a 4 ° C su un agitatore piattaforma. </li><li> Lavare le perline in sequenza con 500 ml di tampone di legame, 500 ml di tampone basso contenuto di sale (0.2x PESS, 1 mM EDTA, 0.05% Tween), 500 ml di tampone di sale (0,25x PESS, 1 mM EDTA, 0,05% di Tween, 100 mM NaCl), e due volte con 500 ml di buffer di TET (1x TE, 0,05% di Tween), filatura a200 xg per 30 s a 4 ° C tra ogni lavaggio. </li><li> Eluire l&#39;RNA BrUTP marcato da perline in sequenza, due volte con 150 microlitri e una volta con 200 ml di tampone di eluizione (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), incubando per 4 min a 42 ° C in un bagno di acqua seguita da una breve centrifuga per separare perline dal surnatante. </li></ol> 6. Precipitazione di RNA BrUTP Labeled <ol><li> Aggiungere 500 ml di freddo fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (125: 24: 1) pH 4-5 per l&#39;affinità purificato BrUTP etichettati RNA. Miscelare su vortex e centrifugare a 16.168 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire la fase acquosa superiore ad una nuova provetta. </li><li> Aggiungere 5 M NaCl magazzino per ottenere una concentrazione finale di 0,3 M e 3 volte il volume di etanolo freddo per precipitare l&#39;RNA. </li><li> Incubare a -20 ° C per una notte. </li><li> Raccogliere il RNA precipitato per centrifugazione a 16.168 xg per 30 min a 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Rimuovere il surnatante e consentire il pellet asciugare all&#39;aria per 10 min. </li><li> Risospendere il pellet di RNA in 26 ml di acqua DEPC. </li><li> Determinare la concentrazione di RNA finale misurando l&#39;assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. Inoltre, determinare il rapporto di 260/280. Un rapporto ~ 2 è indicativa di un campione di RNA puro. </li><li> Conservare i campioni di RNA in aliquote a -80 ° C fino al momento della sintesi del DNA. </li></ol> 7. trascrizione inversa di RNA BrUTP marcato <ol><li> Regolare la concentrazione di RNA a 100 ng / ml con acqua DEPC. Utilizzare 0,5 mg di RNA per ogni reazione di sintesi del DNA. NOTA: La concentrazione di template di RNA può variare da 0,5 a 1.0 mg per ottenere sintesi ottimale cDNA. </li><li> Reverse trascrivere l&#39;RNA utilizzando più primer inversa disegnati a valle del sito (sito di terminazione) poli (A) come mostrato nella figura 3A. </li><li> Per ogni reazione di trascrizione inversa, aggiungere 5 ml di RNA template (0,5 mg), 1 dNTP mix microlitri (10 mM ciascuno), 2 ml di primer reverse C, D, E, F o G (50 pM ciascuno) (vedere la Figura 3A) e acqua priva di nucleasi. Il volume finale di reazione in ciascuna provetta è di 13 microlitri. NOTA: Il numero di reazioni di trascrizione inversa dipenderà dal numero di primer inversi utilizzati per la sintesi di cDNA. Ad esempio, per ASC1 cinque primer inverso sono stati utilizzati e quindi cinque reazioni trascrizione inversa sono stati istituiti. Etichettare i tubi come C, D, E, F e G sulla base del primer reverse utilizzato per la sintesi di cDNA. </li><li> Incubare le provette contenenti RNA template, miscela dNTP e primer in un termociclatore a 65 ° C per 5 minuti per rimuovere ogni conformazione strutturale secondaria, e poi raffreddare a 4 ° C per almeno 2 min. </li><li> Aggiungere 1 ml trascrittasi (200 U / mL) invertono, 4 microlitri di buffer e 2 ml di 0,1 M DTT in ogni provetta contenente il modello di RNA e innesco (passo 7,4). Mescolare pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Eseguire trascrizione inversa incubando la miscela di reazione in un termociclatore a 42 ° C per 60 min. </li><li> Inattivare i trascrittasi inversa a 65 ° C per 20 min. </li><li> Conservare il cDNA a -20 ° C o procedere al passo successivo. </li></ol> 8. amplificazione di cDNA <ol><li> Eseguire la reazione di PCR per l&#39;amplificazione di ciascun preparato cDNA (etichettata C, D, E, F e G per ASC1) dal punto 7.8 come segue: template 3,0 microlitri di cDNA dal punto 7.8, 1.0 ml forward primer B (10 mM), 1,0 microlitri inversa Primer C o 10x polimerasi tampone D o e o F o G (10 micron), 2,5 microlitri PCR, 0,5 microlitri miscela dNTP (10 mm ciascuno), 1,0 ml MgCl 2 (2,5 mm), 15,5 acqua di grado microlitri PCR, e 0,5 microlitri termostabile polimerasi dell&#39;enzima. NOTA: diverse diluizioni di cDNA che va da 1: 5 a 1: 100 dovrebbero essere testati per ottimizzare la resa del prodotto di PCR. Un primer forward singolo promotore-prossimale sarà utilizzato per amplificare il cDNAottenuta utilizzando diversi inneschi inversa. Ad esempio, un singolo innesco B avanti situato vicino il promotore è stato usato in combinazione con cinque primer inversi da C a G per ASC1. BC, BD, BE, BF e BG sono stati usati in provette etichettate rispettivamente come C, D, E, F e G, come mostrato nella Figura 3A. </li><li> Eseguire la PCR utilizzando i seguenti parametri ciclo termico: 1 ciclo di 95 ° C per 2 min (hot start per l&#39;attivazione della polimerasi), 30 - 40 cicli a 95 ° C per 30 s (denaturazione), 54 ° C per 15 s (ricottura) , 68 ° C per 1 min (estensione) e 1 ciclo a 68 ° C per 5 min (estensione finale). NOTA: La temperatura di ricottura può variare a seconda delle primers specifici utilizzati e il tempo di estensione varia a seconda delle dimensioni del prodotto atteso. </li><li> Separare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su 0,8%, 1,5%, o 2 gel di agarosio% a seconda della dimensione prevista del prodotto. </li><li> Quantificare il prodotto di PCR come descritto in El Kaderi et al. , 2012 11. NOTA: In alternativa, utilizzare strategia in tempo reale RT-qPCR per quantificare la quantità di trascritti nascenti. </li></ol>

<ol><li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li>
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<li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li>
<li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disengaging+polymerase%3A+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li>
<li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome%3A+why%2C+where+and+how+to+stop%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li>
<li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+eukaryotic+transcriptome%3A+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li>
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<li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reality+of+pervasive+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625(2011).</li>
<li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li>
<li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15(2012).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo specifica TRO-filo usato qui è stato adattato dal protocollo utilizzato per GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analisi in cellule di mammifero 12. Abbiamo modificato con successo il protocollo di studiare la trascrizione nascente in erba lievito. Per analizzare in particolare il difetto di terminazione della trascrizione, abbiamo regolato il protocollo ulteriormente per sbarazzarsi della fase di RNA idrolisi. Questo ci ha permesso di rilevare in particolare la lunghezza trascrizioni...

Il ciclo di trascrizione eucariotica si compone di tre fasi principali; iniziazione, l&#39;allungamento e la terminazione. La terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II è costituito da due distinte fasi, interdipendenti 3. Il primo passo prevede la scissione, poliadenilazione e il rilascio di mRNA dal modello, ed è immediatamente seguita dalla seconda fase, segnata dal disimpegno della polimerasi dal modello. La corretta terminazione è di fondamentale importanza per il riciclaggio della polimerasi durante l&#39;iniziazione / ripresa della trascrizione, per evitare l&#39;interferenza con la trascrizione dei geni a valle, e per mantenere la trascrizione aberranti sotto controllo limitando trascrizione di pervasiva non codificante RNA 4, 5. Nonostante i recenti progressi, la risoluzione è di gran lunga il meno passo capito del ciclo di trascrizione RNA polimerasi II. Un test terminazione affidabile è essenziale per studiare il meccanismo underlying terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo. Un certo numero di approcci sperimentali sono utilizzati per rilevare il difetto di terminazione in un gene trascrizione attivamente in condizioni fisiologiche. Questi includono Northern blot, fattore di terminazione Chip (immunoprecipitazione della cromatina) e il saggio TRO tradizionale. Ognuna di queste tecniche hanno alcuni vantaggi e svantaggi. Il saggio TRO tradizionali utilizzati per essere l&#39;approccio più affidabile e sensibile per la rilevazione di un difetto di terminazione della trascrizione in vivo 1. Questo test localizza le molecole polimerasi trascrizionalmente attivi su diverse regioni di un gene all&#39;interno della cella. In condizioni normali, il saggio dimostra molecole polimerasi trascrizionalmente impegnati rigorosamente distribuiti tra la regione promotore e terminatore del gene (Figura 1A). Alla cessazione difettoso, tuttavia, la polimerasi è in grado di leggere il segnale di terminazionee viene rilevato nella regione a valle del &#39;fine del gene (Figura 1B) 3. Un difetto terminazione della trascrizione si manifesta in presenza di una polimerasi di senso trascrizione che ha avviato dalla regione promotore-prossimale, ed essere in grado di leggere il segnale di terminazione, continua trascrivere la regione a valle della estremità 3 &#39;di un gene, come mostrato in figura 2A. Con la realizzazione che il genoma eucariotico presenta schiacciante trascrizione diffusa in senso così come le direzioni anti-senso e intorno a un gene 6, 7, 8, 9, 10, divenne presto chiaro che il saggio TRO tradizionale non può rilevare se il segnale polimerasi a valle di un gene rappresenta una trascrizione promotore-avviata (Figura 2A) o un RNA aberrante che ha avviato somewhere nel mezzo del gene oa valle dell&#39;elemento terminatore (Figura 2B), o la trascrizione polimerasi in direzione anti-senso dall&#39;estremità 3 &#39;del gene (Figura 2C). Il dosaggio specifico TRO-strand utilizzando BrUTP qui descritto può distinguere se il segnale polimerasi translettura osservato rappresenta promotore-avviato mRNA senso esteso o un trascritto antisenso che ha avviato valle del gene in esame. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio per dimostrare il ruolo delle chinasi Kin28 a cessazione della trascrizione in erba di lievito 2. Utilizzando l&#39;approccio qui dimostriamo che Rna14 è necessario per la terminazione della trascrizione di ASC1 in erba lievito.

<table><tbody><tr><td>Miscela di alcol fenolo-cloroformio-isoamilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td>pH 4-5</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi, placenta umana</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Perline anti-BrdU</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32323AC</td><td></td></tr><tr><td>Protoscript II</td><td>New England Biolabs</td><td>M03368L</td><td>o un enzima equivalente</td></tr><tr><td>Advantage 2 polimerasi Mix</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>o un enzima equivalente</td></tr><tr><td>5-Bromouridina 5' trifosfato sale sodico</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-214314A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0451AA</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td></td><td>N0454AA</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>N0452AA</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina ultrapura (BSA)</td><td>MC Labs</td><td>UBSA-100</td><td></td></tr><tr><td>Asc1 B</td><td></td><td></td><td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td></tr><tr><td>Asc1 C</td><td></td><td></td><td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC</td></tr><tr><td>Asc1 D</td><td></td><td></td><td>TGTACATATGTATTTTCGCAGCA</td></tr><tr><td>Asc1 E</td><td></td><td></td><td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td></tr><tr><td>Asc1 F</td><td></td><td></td><td>CTATGGAATGGGGGTTTTAAG</td></tr><tr><td>Asc1 G</td><td></td><td></td><td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td></tr><tr><td>5s cDNA</td><td></td><td></td><td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td></tr><tr><td>5' 5s reverse</td><td></td><td></td><td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td></tr><tr><td>3' 5s reverse</td><td></td><td></td><td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td></tr></tbody></table>

analisi di terminazione della trascrizione utilizzando brutp-strand-specifici trascrizione run-on (tro) approccio

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Questo manoscritto descrive un protocollo per rilevare difetti trascrizione terminazione in vivo. Il protocollo TRO specifico filamento utilizzando BrUTP qui descritto è un potente approccio sperimentale per analizzare il difetto di terminazione della trascrizione in condizioni fisiologiche. Come il dosaggio TRO tradizionale, si basa sulla presenza di una polimerasi trascrizionalmente attivo oltre all&#39;estremità 3 &#39;del gene come indicatore di trascrizione terminazione difetti 1. Supera due principali problemi incontrati con il test TRO tradizionale. In primo luogo, esso può rilevare se la polimerasi lettura attraverso il segnale di terminazione è quello che ha avviato la trascrizione dal promotore-prossimale, o se è semplicemente rappresentando una polimerasi diffusamente trascrizione che ha avviato non specificamente da qualche nel corpo o 3 &#39; fine del gene. In secondo luogo, può distinguere se il segnale polimerasi trascrizionalmente attivo oltre laregione terminatore è veramente il translettura polimerasi senso mRNA di trascrizione o un segnale di RNA anti-senso non codificante terminator-iniziati. Brevemente, il protocollo prevede permeabilizzante le cellule di lievito in crescita esponenziale, permettendo ai trascritti che avviati in vivo di allungare in presenza del nucleotide BrUTP, purificare RNA BrUTP marcato dall&#39;approccio affinità, trascrizione inversa del RNA nascente purificato e amplificando il cDNA usando primer specifici filamento che fiancheggiano il promotore e le regioni di terminazione del gene 2.

Per dimostrare l&#39;applicabilità della procedura TRO BrUTP-strand-specifica nel rilevare un difetto di terminazione della trascrizione, abbiamo utilizzato un mutante sensibile alla temperatura di cessazione difettoso di RNA14 chiamato rna14-1. Il ruolo di Rna14 in cessazione di trascrizione di RNA polimerasi II è stata dimostrata con il saggio TRO tradizionale che ha rilevato l&#39;RNA nella regione Terminator-prossimale di geni selezionati 1. ...

Descriviamo un approccio sperimentale di base per l'analisi della terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo utilizzando BrUTP con l'approccio TRO (Strand-specific Transcription Run-on) in lievito in gemmazione. Questo protocollo può essere esteso per studiare la terminazione della trascrizione da parte di altre RNA polimerasi sia nel lievito che negli eucarioti superiori.

Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi nel lievito in gemmazione in condizioni in vivo mediante l'approccio di trascrizione specifica del filamento. Questo metodo aiuta a rispondere alla domanda chiave se la polimerasi trascrizionalmente attiva rilevata oltre le tre estremità prime del gene sia quella iniziata dalla regione del promotore. Il vantaggio principale di questo metodo è che può distinguere una polimerasi trascrittore MRNA da una polimerasi trascrivente pervasivamente che ha avviato le trascrizioni e si troverà alle tre estremità principali del gene.Questa tecnica può essere estesa per studiare la terminazione della trascrizione da parte di altre RNA polimerasi e lieviti a causa della natura conservativa della terminazione da parte di diverse polimerasi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul ruolo preciso dei fattori di terminazione nel ciclo di trascrizione del lievito, può anche essere esteso allo studio della terminazione negli eucarioti superiori. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la permeabilizzazione cellulare e la trascrizione eseguita a tappe, poiché richiedono un'esecuzione attenta e le trascrizioni nascenti possono anche essere difficili da purificare.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta dall'approccio GRO seek che fornisce un'istantanea dell'intero genoma della posizione delle polimerasi trascrizionalmente attive in un modo specifico per il filamento. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la trascrizione e la purificazione dell'RNA sono difficili da eseguire a causa della bassa quantità e della natura instabile dei trascritti nascenti. Prima di iniziare la trascrizione, eseguire la reazione, coltivare, raccogliere e permeabilizzare le cellule di lievito a crescita esponenziale, per ottenere una tavolozza cellulare permeabilizzata.Per avviare la reazione, aggiungere 150 microlitri di trascrizione eseguita su tampone alla tavolozza cellulare permeabilizzata. Utilizzando un puntale P-200 troncato, miscelare delicatamente pipettando su e giù. Posizionare il campione sul ghiaccio.Dopo che tutti i campioni sono stati risospesi nella trascrizione su tampone, incubare i campioni per cinque minuti a 30 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Arresta la reazione aggiungendo 500 microlitri di reagente di isolamento dell'RNA freddo pronto all'uso a ciascun campione. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Iniziare la procedura di estrazione dell'RNA aggiungendo 200 microlitri di perle di vetro lavate con acido a ciascuna sospensione cellulare e agitando energicamente in un miscelatore a vortice per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti, utilizzare un ago caldo calibro 22 per forare il fondo di ciascuna provetta per microcentrifuga e posizionare la provetta sulla parte superiore di una provetta conica sterile da 15 millilitri. Centrifugare a 300 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius e trasferire il lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Aggiungere 500 microlitri di reagente di isolamento dell'RNA freddo e 200 microlitri di cloroformio al lisato cellulare. Mescolare il contenuto sul miscelatore a vortice e poi centrifugare a 16, 168 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta per microcentrifuga.Aggiungere un volume uguale di alcol isoamilico fenolico cloroformio freddo. Agitare energicamente sul miscelatore a vortice e centrifugare a 16, 168 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la fase acquosa superiore contenente l'RNA in una nuova provetta da microcentrifuga.Aggiungere un volume uguale di alcol isoamilico fenolico cloroformio freddo, agitare e centrifugare di nuovo. All'RNA finale contenente la fase acquosa aggiungere un volume appropriato di un stock di cloruro di sodio a cinque molari per ottenere una concentrazione finale di 0,3 molari. Aggiungere tre volte il volume di etanolo freddo per far precipitare l'RNA.Incubare per un'ora, o durante la notte, a 20 gradi Celsius. Al termine della precipitazione dell'RNA, centrifugare a 16, 168 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e risospendere la tavolozza di RNA in 100 microlitri di acqua DEPC.Utilizzare un kit di isolamento dell'RNA per separare l'RNA dai nucleotidi bromouridina trifosfato non incorporati ed eluire l'RNA dalla colonna con 100 microlitri di acqua priva di RNAsi. Incubare l'RNA in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per cinque minuti. E poi trasferire sul ghiaccio per almeno due minuti.Inizia questa procedura preparando le perle di uranio impoverito anti bromo mentre l'RNA viene precipitato. Per ogni campione, aggiungere 500 microlitri di tampone legante l'EDTA di fosfato salino di sodio 0,25 X a 25 microlitri di perle stabilizzate. Centrifugare a 200 volte G per 30 secondi a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.Lavare le perline tre volte con il tampone di legatura. Dopo aver rimosso il surnatante dal terzo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante alle perle e agitare delicatamente per una o due ore a quattro gradi Celsius su uno shaker a piattaforma. Lavare le perline altre due volte con 500 microlitri di tampone legante.Rimuovere il surnatante dal secondo lavaggio e aggiungere 400 microlitri di tampone legante alle perline. Trasferire 100 microlitri di RNA direttamente nelle perline. Incubare con agitazione delicata per una o due ore a quattro gradi Celsius su un agitatore a piattaforma.Centrifugare a 200 volte G per 30 secondi a quattro gradi Celsius e quindi rimuovere il surnatante. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone legante alle perline. Centrifugare a 200 volte G per 30 secondi a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.In questo modo, lavare le perle in sequenza con il tampone legante, il tampone a basso contenuto di sale, il tampone ad alto contenuto di sale e due volte con il tampone TET. Per eluire l'RNA marcato con bromouridina trifosfato dalle perle, aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione e incubare per quattro minuti a 42 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Gira brevemente verso il basso e raccogli il surnatante.In questo modo, eluire in sequenza due volte con 150 microlitri e una volta con 200 microlitri di tampone di eluizione. Da ciascun campione dovrebbero essere ottenuti circa 500 microlitri di RNA marcato con bromouridina trifosfato purificato per affinità. Per precipitare l'RNA marcato con bromouridina trifosfato purificato per affinità, aggiungere 500 microlitri di alcol isoamilico fenoliforme fenolinico freddo a ciascun campione.Agitare e centrifugare a 16, 168 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta per microcentrifuga. Aggiungere il volume appropriato di un ceppo di cloruro di sodio a cinque molari per ottenere una concentrazione finale di 0,3 molari.Quindi aggiungere tre volte il volume di etanolo freddo. Incubare a 20 gradi Celsius durante la notte per far precipitare l'RNA. Il giorno seguente, raccogliere l'RNA precipitato mediante centrifugazione a 16, 168 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere il surnatante e lasciare asciugare la tavolozza all'aria per 10 minuti. Risospendere la tavolozza di RNA in 26 microlitri di acqua DEPC. Determinare la concentrazione finale di RNA misurando l'assorbanza a 260 nanometri utilizzando uno spettrofotometro.Conservare i campioni di RNA e le aliquote a 80 gradi Celsius fino a quando non sono necessari per la sintesi del cDNA. L'approccio di trascrizione specifica del filamento di bromouridina trifosfato è stato utilizzato per testare il requisito dell'RNA 14 per la terminazione della trascrizione del gene ASC1 nel lievito in gemmazione. L'RNA marcato con bromouridina trifosfato proveniente dal mutante RNA 14-1 e dalle sue cellule isogeniche di tipo selvatico è stato purificato e trascritto inversamente con i primer C, D, E, F e G. Il cDNA corrispondente è stato amplificato mediante PCR utilizzando le coppie di primer B e C, B e D, B ed E, B e F, B e G e frazionato su gel di agarosio.La presenza di prodotti amplificati con PCR dalle coppie di primer B ed E, B e F e B e G nel mutante, riflette un fenotipo readthrough di terminazione. Nelle cellule wild type, tuttavia, la trascrizione sul segnale era limitata fino all'elemento terminatore e non c'era alcuna trascrizione rilevabile sul segnale oltre la regione del terminatore. Questo grafico mostra la quantificazione dei gel con cinque S RNA come controllo di normalizzazione.L'individuazione di trascritti nascenti avviati dal promotore che leggono il segnale di terminazione nelle cellule mutanti ma non in quelle wild type conferma che l'RNA 14 è un fattore di terminazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che la trascrizione di reazione è fondamentale per ottenere un risultato di successo.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la ricerca GRO, per rispondere a domande aggiuntive, come il ruolo di un fattore di terminazione nell'intero genoma. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della trascrizione per esplorare la terminazione da parte di altre RNA polimerasi nel lievito e nei sistemi eucariotici superiori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la trascrizione, eseguire le reazioni e purificare i trascritti marcati nascenti.Non dimenticare che l'RNA può essere estremamente instabile e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come indossare guanti, mantenere la temperatura intorno ai quattro gradi Celsius e utilizzare agenti privi di RNAsi.

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