Analisi di particelle singole ad alta risoluzione da immagini elettroniche a cryo-microscopia usando SPHIRE

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di determinare la struttura di complessi macromolecolari mediante l'analisi di singole particelle di dati di criomicroscopia elettronica utilizzando il software di elaborazione delle immagini SPHIRE. La crio-EM a singola particella sta diventando una tecnologia mainstream per lo studio delle strutture delle macromolecole a risoluzione quasi atomica. SPHIRE è un nuovo pacchetto software che consente l'elaborazione semi-automatizzata dei dati crio-EM in modo facile da usare.

Il vantaggio principale di SPHIRE è il meccanismo di convalida automatica. La maggior parte delle procedure deve essere eseguita una sola volta e i risultati sono oggettivi e riproducibili. La crio-EM ad alta risoluzione può essere utilizzata per posizionare singoli residui, fornendo così informazioni cruciali sull'organizzazione e sul funzionamento di macchine micromolecolari complesse.

Gli individui che non conoscono questo metodo dovrebbero tenere presente che l'ottenimento di una struttura ad alta risoluzione dipende fortemente dalla qualità del campione e dai dati di input. Per iniziare a utilizzare l'applicazione SPHIRE, aprire la GUI dal terminale. Aprire le UTILITIES per visualizzare un'immagine di criomicroscopia con e2display.

Utilizza lo strumento di misurazione integrato per misurare l'asse delle particelle più lungo in angstrom per pixel. Apri le Impostazioni del progetto. Impostate la dimensione della finestra CTF almeno sulla dimensione della casella delle particelle.

Impostare la dimensione della casella delle particelle su un numero pari, almeno 1 1/2 volte il diametro delle particelle. Impostate il raggio delle particelle ad almeno la metà della lunghezza misurata. Inserire la simmetria del gruppo di punti, se nota, e la massa molecolare approssimativa.

Registra le impostazioni. Quindi, nel menu FILMATO, aprire Allineamento filmato Micrograph. Imposta i percorsi dei file eseguibili unblur e summovie.

Scegli un filmato del micrografo grezzo non allineato e sostituisci la variabile del nome del file con un carattere jolly per impostare il modello di percorso del micrografo di input. Assegnare un nome alla directory di output. Inserisci il numero di fotogrammi del filmato, la tensione del microscopio e l'esposizione per fotogramma.

Eseguire il processo per generare micrografie medie ponderate in base alla dose e non ponderate in base alla dose. Quindi, apri il menu CTER e seleziona Stima CTF. Impostare le micrografie non ponderate in base alla dose come input.

Assegna un nome alla directory di output e compila i parametri di raccolta dati. Impostare la frequenza più bassa su 0285 angstrom inversi e la frequenza più alta su 0,285 angstrom inversi. Eseguire il processo per generare un elenco di parametri CTF.

Quindi, apri il menu FINESTRA e seleziona Selezione particelle. Impostare le micrografie ponderate in base alla dose come input e avviare l'utility e2boxer. Esegui il prelievo di particelle manualmente o automaticamente.

Estrai le particelle selezionate in pile di immagini e combina le pile in un'unica pila di immagini virtuali in un database BDB. Una volta che le particelle sono state prelevate e impilate, apri il menu ISAC e seleziona Clustering 2D ISAC. Impostare lo stack di immagini virtuali nel database BDB come input.

Stima il numero di immagini per classe. Inserisci i parametri rimanenti e genera le medie delle classi 2D. Una volta completata la classificazione 2D, utilizzare l'utilità Visualizza dati per visualizzare le medie delle classi riproducibili convalidate.

Verificare che siano rappresentati più orientamenti delle particelle e che le medie di classe siano di qualità soddisfacente. Genera un nuovo stack di immagini virtuali contenente solo particelle appartenenti alle medie di classe convalidate. Quindi, aprire il menu VIPER e utilizzare l'utilità Visualizza dati per visualizzare le medie delle classi.

Elimina le medie di classe di scarsa qualità o che mostrano viste identiche della particella. Salvare le medie delle classi rimanenti in un nuovo file. Quindi, selezionare RVIPER modello 3D iniziale e utilizzare la piccola selezione di medie di classe come input.

Esegui il comando per generare un modello 3D riproducibile iniziale della proteina. Ispeziona il modello nel programma di grafica molecolare Chimera. Confrontare il modello con una struttura nota di una proteina omologa o di un dominio della proteina di interesse.

Torna al menu VIPER in SPHIRE e seleziona Crea riferimento 3D. Genera un modello di riferimento 3D iniziale con la dimensione in pixel corretta e una maschera 3D. Aprire il menu MERIDIEN e selezionare Perfezionamento 3D.

Compila la pila di immagini di input e i percorsi iniziali del file di riferimento 3D. Assegna un nome alla directory di output e imposta la maschera del modello di riferimento come maschera 3D. Seleziona Applica maschera 2D rigida.

Impostate la risoluzione iniziale tra 20 e 25 angstrom ed eseguite il perfezionamento 3D per produrre i semivolumi non filtrati. Quindi, visualizza a mezzo volume non filtrato in Chimera. Determinare una soglia di binarizzazione in cui tutte le densità proteiche sono connesse, ma gli artefatti di rumore non lo sono.

Torna al menu MERIDIEN di SPHIRE e apri Maschera 3D adattiva. Immettere l'input del mezzo volume non filtrato e la soglia di binarizzazione. Assegna un nome alla maschera di output ed esegui il processo per generare una maschera 3D con bordi sfumati.

Quindi, apri Nitidezza e seleziona entrambi i semivolumi non filtrati. Impostate la maschera 3D a mezzo volume con bordo morbido come maschera fornita dall'utente. Eseguire il processo che unisce i semivolumi e quindi filtra e rende più nitido il volume unito.

Aprire il file di registro per visualizzare la stima finale della risoluzione. Genera una mappa 3D della distribuzione angolare delle particelle dello stack di immagini di input generato durante il perfezionamento 3D. Apri il modello 3D nitidito e filtrato in Chimera.

Ispeziona la mappa di densità e le sue funzioni ad alta risoluzione. Aprire la distribuzione angolare in Chimera e verificare che gli angoli di Eulero siano distribuiti isotropicamente. Aprire il menu SORT3D e selezionare Stima variabilità 3D.

Genera una mappa di variabilità 3D dalla pila virtuale di immagini di particelle appartenenti alle medie di classe convalidate. Generare una maschera 3D binarizzata da questa mappa di variabilità per il successivo clustering 3D focalizzato. Quindi, aprire la RSORT3D Clustering 3D e selezionare la directory del precedente perfezionamento 3D come input.

Assegna un nome alla directory di output e imposta le maschere 3D globali e focalizzate. Utilizzare almeno 5.000-10.000 immagini per gruppo per set di dati di grandi dimensioni. Eseguire il processo di ordinamento per generare volumi di ciascun gruppo 3D omogeneo.

Usa Chimera per identificare la struttura con la risoluzione apparente più alta. Tornate al menu SORT3D in SPHIRE e aprite Perfezionamento sottoinsieme locale. Impostare il percorso del file di testo del sottoinsieme al file del cluster ID particella corrispondente alla struttura a risoluzione più alta.

Impostate la directory di rifinitura 3D sulla directory contenente i semivolumi non filtrati e l'iterazione di riavvio sull'iterazione di risoluzione più alta della rifinitura 3D precedente. Eseguire il comando per generare semivolumi locali non filtrati. Quindi, creare una maschera 3D con bordi sfumati da uno dei semivolumi locali.

Unire i semivolumi locali e rendere più nitido il volume unito senza applicare un filtro passa-basso. Quindi, apri il menu LOCALRES e fai clic su Risoluzione locale. Selezionare i semivolumi locali.

Quindi, selezionate la maschera locale con bordi sfumati. Impostare la risoluzione complessiva sulla risoluzione assoluta stimata durante la nitidezza del volume locale unito. Calcolare la risoluzione locale del volume.

Quindi, apri Filtro locale 3D. Impostare il volume locale non filtrato più nitido come input. Selezionare la mappa di risoluzione locale e la maschera 3D con bordi sfumati.

Applica il filtro di risoluzione locale al volume nitido per produrre il modello 3D finale. Apri la mappa del volume e della risoluzione locale risultanti in Chimera. Avvia lo strumento Colore superficie e scegli il volume dal menu e l'opzione per colorare la superficie in base alla risoluzione locale.

Il complesso tossina TcdA1 è stato ripreso mediante criomicroscopia. Tutte le immagini hanno mostrato singole particelle chiaramente distinguibili e anelli di Thon che si estendono fino a una risoluzione di oltre quattro angstrom nello spettro di potenza. Le particelle sono state selezionate utilizzando e2boxer e poi sono state estratte in una pila di immagini.

Le medie di classe bidimensionali sono state generate dall'allineamento e dal clustering stabile iterativo, o ISAC. Queste medie di classe sono state utilizzate per calcolare un modello 3D riproducibile con RVIPER. Questo modello concorda bene con la struttura cristallina precedentemente risolta di TcdA1.

perfezionamento 3D automatico di questo modello utilizzando MERIDIEN ha generato una risoluzione quasi atomica map. 3D'analisi della variabilità ha indicato una flessibilità localizzata della regione terminale N marcata con istidina, dei domini di legame del recettore e del dominio di legame TcB. Sono stati eseguiti calcoli di risoluzione locale.

Il modello nitidito è stato filtrato localmente ed è stata applicata una scala di colori corrispondente alla risoluzione locale, che mostra l'accordo topologico tra le aree di alta variabilità e le aree di bassa risoluzione. La struttura finale cryo-EM con risoluzione di 3,5 angstrom di TcdA1 ha mostrato densità chiare per la maggior parte delle catene laterali. Una mappa di densità con questo livello di dettaglio può essere ulteriormente utilizzata per la costruzione di modelli atomici de novo.

Utilizzando questo approccio, una struttura di risoluzione quasi atomica può essere ottenuta in poche ore o pochi giorni, senza informazioni strutturali a priori. Durante il tentativo di questa procedura, utilizzare solo dati di alta qualità e controllare i risultati intermedi. L'eterogeneità composizionale e strutturale del campione crio-EM potrebbe essere un fattore limitante per raggiungere una risoluzione quasi atomica.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare SPHIRE per la determinazione strutturale crio-EM. Come avete visto, le routine di clustering incluse in SPHIRE vi permetteranno non solo di risolvere la struttura della proteina di interesse, ma anche di studiare le dinamiche conformazionali e di fornire informazioni meccanicistiche cruciali su meccanismi molecolari complessi.