Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di chiarire chimicamente il cuore di un topo, con aritmia cardiaca indotta, al fine di visualizzare l'intero organo per rilevare l'infiltrato leucocitario cardiaco mediante microscopia a foglio luminoso a fluorescenza. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sugli organi interi riguardo a protesi e strutture a livello di risoluzione cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente sia la quantificazione che la localizzazione dell'infiammazione in organi interi.

Fornire dettagli approfonditi sui protesi neurologiche. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando avevamo urgentemente bisogno di uno strumento di visualizzazione per identificare spiegazioni cellulari dell'aritmia cardiaca nel modulo di esaurimento. Dopo l'esposizione del cuore di un topo di età compresa tra otto e dieci settimane, utilizzare un catetere da 21 gauge e penetrare il ventricolo destro.

Incidi l'aorta per consentire il drenaggio del sangue, quindi perfondere con cinque millilitri di PBS con EDTA, applicando una pressione costante e lenta. Dopo il PBS con EDTA, perfondere con cinque millilitri di paraformaldeide al 4%. Al termine della perfusione, utilizzare pinze dentate per afferrare delicatamente il cuore fissato e sollevare leggermente l'organo per recidere tutte le connessioni tissutali.

Includendo le arterie e le vene entranti ed uscenti. Successivamente, conservare il cuore per quattro ore in PFA fresco al 4% per una ulteriore fissazione. Per disidratare il tessuto, incubare il cuore in una serie ascendente di etanolo, in tubi neri di polipropilene da cinque millilitri, al buio, con rotazione lenta e costante su un agitatore per tubi, per prevenire la formazione di bolle d'aria.

Quindi, chiarire il tessuto mediante incubazione con etere dibenzilico al 98% con rotazione costante durante la notte. Per eseguire la microscopia a foglio di luce a fluorescenza, posizionare prima blocchi di agarosio disidratati nel portacampioni standard, per mantenere il campione in posizione. Successivamente, trasferire il campione sul portacampioni.

Successivamente, trasferire il portacampioni in una cuvetta di dimensioni adeguate riempita di etere dibenzilico. Utilizzare le impostazioni appropriate dei filtri di eccitazione ed emissione per rilevare i segnali fluorescenti di interesse. Pertanto, un posizionamento e una fissazione corretti del campione sono fondamentali per minimizzare gli effetti di ombreggiamento durante l'acquisizione delle immagini.

Inoltre, un campione mal fissato può causare artefatti di movimento, difficili da correggere durante l'elaborazione successiva. Dopo aver acquisito tutte le immagini, aprire il software appropriato per l'analisi di immagini 3D e 4D e selezionare "supera". Scegliere file e apri, quindi selezionare la cartella contenente i dati del primo canale acquisito per aprire gli stack di immagini.

Selezionare modifica e aggiungere canali, per aggiungere i dati dei canali fluorescenti acquisiti appropriati. Successivamente, fare clic su modifica e selezionare le proprietà dell'immagine, per correggere le dimensioni del voxel in x, y e z. Regolare i parametri nella nuova finestra aperta.

Per regolare i segnali fluorescenti, aprire innanzitutto il menu di modifica e selezionare "mostra regolazione visualizzazione". Una nuova finestra mostrerà tutti i canali aperti. Per cambiare il canale di autofluorescenza in scala di grigi, selezionare il canale di autofluorescenza, scegliere lo stile di visualizzazione bianco e fare clic su OK.

Quindi, regolare la visualizzazione rimuovendo la griglia. Successivamente, eseguire uno zoom ed escludere un canale. Quindi, regolare il valore del livello nero per eliminare eventuali segnali di fondo indesiderati che non rappresentano le strutture del campione, nonché l'intensità del segnale e il contrasto.

Regolare il canale del segnale dell'anticorpo in base al segnale aggiornato del canale di autofluorescenza. Impostare la modalità del canale, quindi attivare per definire la visualizzazione del segnale dell'anticorpo mediante una tavola di colori a mappa termica. Successivamente, selezionare la modalità di fusione per visualizzare in dettaglio le strutture del tessuto.

Per tagliare virtualmente l'organo, prima dell'esportazione della scena 3D, selezionare l'icona del piano di taglio nell'elenco degli oggetti. Nella vista dell'immagine apparirà una cornice gialla e un manipolatore a fuso bianco. Utilizzare il mouse per ruotare l'estremità più sottile del fuso, in modo da modificare l'orientamento del piano di taglio, e spostare la parte centrale più spessa del fuso per selezionare la profondità desiderata del taglio.

Quindi, deselezionare le rispettive caselle di controllo per nascondere il telaio e il manipolatore e creare le immagini desiderate. L'acquisizione di un'intera serie di immagini, composta da due segnali di canali fluorescenti, genera una rappresentazione 3D artificiale, in cui la distribuzione dei leucociti viene visualizzata in una mappa termica. Le aree fortemente infiammate dei cuori di un animale trattato con tossina difterica possono essere riconosciute per il loro aspetto rossastro o biancastro.

Particolarmente nelle regioni del sistema di conduzione cardiaco, come il fascio atrioventricolare e le fibre di Purkinje. Al contrario, i cuori degli animali trattati con PBS come controllo non mostrano questo tipo di infiammazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente l'analisi digitale pronta di un organo bersaglio, dalla sua estrazione alla sua ricostruzione assistita al computer in quattro o cinque giorni.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'emmeneologia per esplorare i modelli di distribuzione cellulare in organi interi di topo. Ciò potrebbe influire sull'analisi e sul trattamento di una varietà di protesi di malattie fisiopatologiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare organi interi di topo per la microscopia a foglio luminoso a fluorescenza e di come generare ed elaborare pile di dati tridimensionali.