Name: Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Scopri un test high-throughput per valutare l'efficacia dei farmaci contro Mycobacterium tuberculosis in macrofagi. Questo metodo compatibile BSL-2 utilizza un colorante di vitalità per screening rapidi e predittivi.

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Ringraziamo il Dr. Frank Wolschendorf per l'accesso al lettore automatico di lastre di imaging Cytation 3. Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla sovvenzione NIH R01-AI104499 a OK. Parti del lavoro sono state eseguite nelle strutture UAB CFAR e dal nucleo di citometria a flusso UAB CFAR/nucleo di citometria a flusso UAB articolare, che sono finanziati da NIH/NIAID P30 AI027767 e da NIH 5P30 AR048311.

NOTA: Come M. tuberculosis mc 2 6206 è un ceppo non virulento 17, 18, tutti i lavori in questo protocollo può essere eseguita in un impianto di 2 livello di biosicurezza (BSL-2). 1. condizioni di coltura per la proteina fluorescente verde Esprimere M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb-GFP) NOTA: il M. tuberculosis H37Rv deriva auxotroph ceppo mc 2 6206 (Δ panCD, Δ Leucò) trasformato con la GFP esprimere plasmide pMN437 è utilizzato in tutto questo protocollo 16. E &#39;possibile sostituire il ceppo di Mtb-GFP con non GFP che esprimono ceppo selvatico per consentire una più agevole accessibilità del ceppo per i ricercatori. Tuttavia, l&#39;espressione GFP è opportuno attivare la conferma visiva della fagocitosi e la formazione di aggregati Mtb / macrofagi. per long conservazione a lungo termine, Mtb-GFP sono stati congelati a -80 ° C in piena 7H9 media (descritti al punto 1.1) integrato con il 20% di glicerolo. <ol><li> Preparare completo supporto Mtb-GFP (7H9-C), completandola 7H9 media con il 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, 24 mg / ml D-acido pantotenico, 50 mg / ml di L-leucina e 50 mg / ml Hygromycin B. </li><li> Scongelare una fiala di Mtb-GFP e aggiungere 10 ml di 7H9-C in un pallone a fondo quadro PETG 30 ml. </li><li> Incubare a 37 ° C su shaker rotativo (50 rpm). Prendere le misure della densità ottica (OD 600) ogni pochi giorni fino a OD 600 raggiunge 1,0 (circa 5-8 giorni). </li><li> Diluire e cultura passaggio come necessario per mantenere un OD 600 tra 0,2-1,0. </li><li> Per l&#39;infezione, utilizzare una cultura consolidata di Mtb-GFP all&#39;interno della fase di crescita logaritmica (OD 600 di 0,6-1). Per evitare le culture clumpy, sonicare il pallone di coltura Mtb in un bagno d&#39;acqua (130 W; 3 x 5 s impulsi) ONCe o due volte alla settimana </li></ol> 2. Condizioni di coltura per Cellule THP-1 <ol><li> Preparare completa THP-1 mezzi di cella (RPMI-C) completandolo terreno RPMI 1640 con 10% di siero fetale inattivato al calore bovini, 2 mM L-glutammina e 10 mM HEPES. </li><li> Incubare le cellule in un pallone T-75 a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro o citometria a flusso ogni altro giorno e mantenere le cellule THP-1 ad una densità tra ,1-0.600.000 per ml. </li></ol> 3. Infezione protocollo per generare strutture Mtb / macrofagi di aggregazione <ol><li> THP-1 preparazione cellulare (per piastra a 96 pozzetti) <ol><li> Centrifuga 7 x 10 6 cellule THP-1 a 250 xg per 5 min. Risospendere in 7 mL RPMI-C. </li></ol></li><li> Preparazione Mtb-GFP <ol><li> Centrifuga 2,8 x 10 8 Mtb-GFP a 3.200 xg per 5 minuti in una centrifuga oscillante bucket ucantare una conversione di OD 600 = 1.0 3 x 10 8 batteri / mL. </li><li> Risciacquare una volta con RPMI-C e centrifugare come al punto 3.2.1. </li><li> Risospendere in 7 mL RPMI-C e vortex per 10 s. </li></ol></li><li> Infezione NOTA: Vedere la Figura 1 per il modello. <ol><li> Preparare una piastra a 96 pozzetti aggiungendo 200 ml di acqua sterile in righe A e H e colonne 1 e 12 per un cerchione di acqua per evitare l&#39;evaporazione del terreno di coltura. </li><li> Aggiungere 200 ml RPMI-C a colonna 2 (B2 per G2) per il controllo di sfondo (vuoto). </li><li> Per infettare, aggiungere sospensione Mtb-GFP (punto 3.2) per sospensione cellulare THP-1 (passo 3.1) e mescolare bene pipettando. La densità delle cellule THP-1 finale è 5 x 10 5 per ml e la corrispondente molteplicità di infezione è 40. </li><li> Versare il THP-1 sospensione / Mtb-GFP in un serbatoio di 25 mL. </li><li> Aggiungere 200 ml di THP-1 / Mtb-GFP sospensione per tutti i restanti 96-pozzetti (B3 tramite G11) usinga multicanale pipetta. NOTA: Se si lavora con più lastre da 96 pozzetti, risospendere regolarmente il restante THP-1 sospensione / Mtb nel serbatoio per assicurare una miscela viene aggiunta a ciascun pozzetto. </li><li> Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 7-10 giorni. </li><li> Cambiare i media ogni 2 giorni, eliminando lentamente 100 ml trascorso supporto dalla parte superiore di ogni bene e delicatamente aggiungendo 100 ml di pre-riscaldato RPMI-C usando una pipetta multicanale. Non risospendere pozzi e disturbare gli aggregati Mtb / macrofagi sul fondo dei pozzetti. </li><li> Visivamente esaminare i pozzi di microscopia a fluorescenza (obiettivo 4-10X) tutti i giorni, prendendo atto della dimensione di Mtb aggregati / macrofagi. Di giorno 7-10, Mtb aggregati / macrofagi devono essere sufficientemente grande (fare riferimento alla Figura 2 per riferimento) di procedere per prove di efficacia della droga (sezione 4). </li><li> Se lo si desidera, catturare le immagini dei 96-pozzetti usando un sistema di imaging cellulare automatizzato montaticon campo chiaro e filtro GFP imposta per documentare Mtb / macrofagi formazione di aggregati. NOTA: Se gli utenti non hanno accesso ad un sistema di imaging automatizzato, immagini di pozzi rappresentative possono essere scattate con qualsiasi microscopio adeguato con funzionalità di GFP e di campo luminoso. </li></ol></li></ol> 4. inibizione della crescita Assay per valutare Drug efficacia contro Mtb Derivato da Mtb / macrofagi Aggregati <ol><li> Preparazione della droga (condizioni triplicato per due farmaci) Nota: vedere Figura 1A per il modello. <ol><li> In una piastra da 96 pozzetti separati, aggiungere 125 ml di mezzi 7H9-C di B2 fino al G10. </li><li> Preparare due farmaci a doppia più alta concentrazione finale desiderata in 1 mL di 7H9-C per spiegare la diluizione nel passaggio 4.2.4. </li><li> Aggiungere 250 ml di ogni farmaco per pozzi B11-C11-D11 e E11-F11-G11, rispettivamente, per i trattamenti in triplicato. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, in serie dilute i farmaci di prova duplice spostando 125 microlitri da B11-B10-G11 in G10. Mescolare pipettando 5 volte ad ogni passo. </li><li> Continuare a muoversi 125 microlitri da una colonna all&#39;altra (da destra a sinistra) attraverso la piastra, e fermarsi dopo colonna 4. </li><li> Dopo la miscelazione colonna 4, scartare 125 microlitri in un contenitore per rifiuti. Le colonne 2 e 3 non devono contenere tutte le droghe per consentire l&#39;uso come sfondo (vuoto) ei controlli di crescita positivi. NOTA: In alternativa, seguire modello in figura 1B per le librerie di prova della droga. Ciascuna piastra da 96 pozzetti può ospitare 58 farmaci ad un&#39;unica concentrazione. Preparare questa piastra farmaco utilizzando il doppio della concentrazione finale desiderata poiché sarà diluito a metà in fase 4.2.4. </li></ol></li><li> Trattamento farmacologico: <ol><li> Recuperare la piastra a 96 pozzetti contenente la Mtb con infezione macrofagi (aggregati Mtb / macrofagi). </li><li> decantare con attenzione tutti i pozzi rilevanti (B2 attraverso G11) con una pipetta multicanale.Eseguire questo in un modo a due fasi: dapprima rimuovere 150 microlitri senza inclinare il piatto, e quindi rimuovere rimanenti mezzi (~ 50 microlitri) inclinando la piastra e inserire la punta della pipetta al bordo inferiore del pozzo. Come Mtb / macrofagi aggregati sono aderenti al fondo del pozzo, nessun materiale dovrebbe essere perso. </li><li> Delicatamente aggiungere 100 ml di 7H9-C media per tutti i pozzetti rilevanti (B2 attraverso G11) della piastra contenente gli aggregati / macrofagi Mtb. </li><li> Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri dal farmaco contenente 96 pozzetti (passo 4.1) ai corrispondenti pozzetti della piastra infezione. </li><li> Mettere in busta sigillata e incubare per 3 giorni a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Quantificazione del farmaco efficacia usando il saggio resazurina microtitolazione <ol><li> Preparare resazurina soluzione madre ad una concentrazione finale di 0,8 mg / ml in H 2 O. filtro attraverso 0,22 micron dimensione dei pori della membrana PVDF per la sterilizzazione.</li><li> Preparare resazurin soluzione di lavoro miscelando resazurina soluzione madre, H 2 O e Tween-80 (soluzione al 20% in H 2 O) in un rapporto 2: 1: 1. Le concentrazioni finali sono 0,4 mg / mL resazurina e il 5% di Tween-80. </li><li> Utilizzando un lettore di piastre, impostare un programma per leggere la fluorescenza a 530 nm di eccitazione e di emissione 590 nm ogni 30 min per 24 ore a 37 ° C. lettore di piastre pre-riscaldare a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione di lavoro resazurina a tutti i pozzetti rilevanti (B2 tramite G11) della piastra droga trattata (passo 4.11) usando una pipetta multicanale. </li><li> Mettere piatto sul lettore di piastre e avviare il programma creato nel passo 5.3. NOTA: Per facilitare il trattamento di elevati volumi di piastre di dosaggio, è sufficiente per sviluppare il saggio in un incubatore a 37 ° ed eseguire singola fluorescenza legge ogni 24 h. Questo vale anche per gli utenti che non hanno accesso a un lettore di piastre con funzionalità cinetici e di incubazione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo descritto in dettaglio un modello di infezione Mtb alternativo adatto per test efficacia del farmaco. Questo modello tiene conto di due fattori chiave che dovrebbe essere dato più considerazione durante il processo di sviluppo TB farmaci precoce: la presenza di barriere fisiologicamente rilevanti alla penetrazione di droga e cambiamenti metabolici di Mtb durante l&#39;infezione. Mentre abbiamo già dimostrato i vantaggi del nostro modello di infezione e ha proposto la possibilità di scalare...

<html> La tubercolosi (TB) rimane una grave minaccia globale la salute nonostante la disponibilità di regimi chemioterapici anti-TB per oltre 40 anni 1. Ciò è dovuto in parte al requisito per periodi lunghi di trattamento di più di 6 mesi utilizzando più combinazioni di farmaci, che porta al paziente non conformità 2. L&#39;emergere di TBC resistente ai farmaci negli ultimi anni ha ulteriormente aggravato i problemi in un campo in cui il successo dello sviluppo di farmaci clinicamente approvati è praticamente inesistente 3. Infatti, nonostante esaustivo anti-TB sviluppo di farmaci, solo un singolo farmaco è stato approvato dalla FDA per l&#39;uso clinico negli ultimi 40 anni 4. Così, le nuove generazioni di farmaci anti-TB sono urgentemente necessari per affrontare questo problema. Un problema fondamentale nella scoperta TB farmaco è la mancanza di trasferimento di successo da composti con attività in vitro all&#39;efficacia in ambito clinico= &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Inizialmente, gli approcci target basati sono stati usati per lo screening per anti-Mtb farmaci 5, che non è riuscito a tradurre in cellule batteriche intere. Anche quando si usano le cellule Mtb, è spesso eseguita utilizzando brodo cresciuto culture, che non calcolano accuratamente l&#39;efficacia dei farmaci in vivo 8, 9. Questi problemi sono stati riconosciuti e test di screening di droga nei confronti di macrofagi contenenti Mtb o latente Mtb sono state stabilite con successo 8, 10, 11, 12. Tuttavia, anche questi test più avanzati non danno sufficiente attenzione alle barriere di penetrazione che i farmaci incontrano nelle lesioni polmonari non vascolarizzati, e di foci necrotici al sito di infezione. Infatti, Anche per la prima linea TB rifampicina farmaco, il dosaggio sub-ottimale è stata messa in discussione a causa di inadeguata nel tessuto vivo e liquido cerebrospinale (CSF) penetrazione 13, 14, 15, così come è diminuito l&#39;efficacia contro intracellulare Mtb 8, 9. Come tali, i nuovi modelli e le analisi che tengano conto di questi parametri durante il processo di sviluppo del cavo in anticipo sarebbe senza dubbio migliorare TB sforzi scoperta di nuovi farmaci. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente istituito un poco costoso, rapido, e BSL 2-modello di infezione compatibile alternativo per Mtb droga prove di efficacia 16. Questo modello di infezione prodotta densamente Mtb all&#39;interno di grandi strutture aggregate macrofagi, che ricapitolava fisiologicamente rilevanti barriere di penetrazione cellulare e ha generato macrofagi diversi passaggi <em&gt; Mtb con uno stato fisiologico alterato simile latente Mtb. Mtb derivato da questo modello di infezione è stato combinato con il test resazurina microtitolazione (REMA) per valutare l&#39;efficacia della droga, che ha prodotto risultati coerenti con altri modelli di infezione intracellulare e correlato bene con la capacità riportato comuni farmaci TB di raggiungere alte concentrazioni di CSF relative alle concentrazioni sieriche 16. Qui si descrive in dettaglio la generazione di Mtb / macrofagi strutture aggregate per produrre macrofagi diversi passaggi Mtb adatto per i test di sensibilità ai farmaci utilizzando REMA. In particolare, si mostra come questo sistema di infezione potrebbe essere adattato in un formato a 96 pozzetti per la compatibilità con throughput screening di candidati farmaci anti-TB.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Seguire le raccomandazioni del produttore</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>Preparare una soluzione madre al 20% in H2O; sterilizzare</td></tr> il <tr><td>sale emicalcico dell'acido D-pantotenico</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>Preparare una soluzione madre da 24 mg/mL in H2O; filtro sterilizzare</td></tr><tr><td>L-leucina</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>Preparare 50 mg/mL di soluzione madre in H2O; filtro sterilizzare</td></tr><tr><td>Igromicina B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>Preparare 200 mg/mL di soluzione madre in H2O</td></tr><tr><td>Nalgene Square PETG media Thermo</td><td>Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 lettore</td><td>di piastre Biotek</td><td></td><td>Intercambiabile con qualsiasi lettore di piastre fluorescenti e microscopio</td></tr><tr><td>Software</td><td>Gen5 Biotek</td><td></td><td>Registrazione e analisi di coversione della rezasurina</td></tr><tr><td>Rifampicina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL in H2O</td></tr><tr><td>Moxifloxacina cloridrato</td><td>Acros Organics</td><td>457960010</td><td>Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL in H2O</td></tr><tr><td>Resazurin Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>Preparare 800 &mu; g/mL soluzione madre in H2O; filtro sterilizzare</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>Preparare una soluzione madre al 20% in H2O; filtro sterilizzare</td></tr></tbody></table>

un test compatibile high-throughput per valutare drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Il processo iniziale di sviluppo di farmaci antitubercolari è ostacolato dalla traduzione inefficiente di composti con attività in vitro in efficacia in ambito clinico. Ciò è probabilmente dovuto alla mancanza di considerazione per le barriere di penetrazione cellulare fisiologicamente rilevanti che esistono nell'ospite infetto. Di recente abbiamo messo a punto un modello di infezione alternativo che genera grandi strutture aggregate di macrofagi contenenti M. tuberculosis (Mtb) densamente impacchettato al suo interno, adatto per i test di suscettibilità ai farmaci. Questo modello di infezione è economico, rapido e, soprattutto, compatibile con BSL-2. Qui, descriviamo le procedure sperimentali per generare strutture aggregate di Mtb/macrofagi che produrrebbero Mtb attraversata da macrofagi per test di suscettibilità ai farmaci. In particolare, dimostriamo come questo sistema di infezione possa essere direttamente adattato al formato di piastra a 96 pozzetti mostrando capacità di throughput per lo screening di librerie di composti contro Mtb. Nel complesso, questo test è un'aggiunta preziosa alla cassetta degli attrezzi per la scoperta di farmaci Mtb attualmente disponibile grazie alla sua semplicità, economicità e scalabilità.

Per confermare la robustezza di adattare questo modello infezione per 96 pozzetti formato piatto, abbiamo qui esaminato la sensibilità ai farmaci di Mtb derivato dal nostro 96-ben adattata modello di infezione alla rifampicina (RIF) e moxifloxacina (Moxi) secondo il modello di data nella figura 1A. Abbiamo dimostrato che la generazione di Mtb / macrofagi strutture aggregate chiave per questa analisi può essere prodotto in maniera affidabile in un format...

Nuovi modelli e saggi che migliorerebbero il processo di sviluppo precoce dei farmaci antitubercolari di prossima generazione sono altamente auspicabili. Qui, descriviamo un test rapido, economico e compatibile con BSL-2 per valutare l'efficacia del farmaco contro il Mycobacterium tuberculosis che può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare in modo riproducibile strutture aggregate di macrofagi infetti da Mycobacterium tuberculosis in formato piastra a 96 pozzetti, per test di suscettibilità ai farmaci mediante l'uso di un colorante di vitalità. Questo metodo può migliorare il processo iniziale di sviluppo farmacologico per composti anti-tubercolari, ostacolato dalla scarsa traducibilità dei composti candidati nell'ambiente clinico. Il principale vantaggio di questo modello infettivo semplice, economico e compatibile con livello di sicurezza biologica 2 (BSL-2) è la riproduzione di barriere fisiologicamente rilevanti alla penetrazione cellulare, simili ai granulomi tubercolari.Questo produce risultati di suscettibilità ai farmaci più predittivi dell'efficacia in vivo. Iniziare questa procedura preparando la M.tuberculosis esprimente la proteina fluorescente verde MC squared 6206, indicata in seguito come MTBGFP, per l'infezione. Tenere presente che si tratta di un ceppo avirulento, pertanto tutti i passaggi del protocollo descritto qui possono essere eseguiti in un laboratorio di sicurezza biologica di livello due.Per ogni piastra a 96 pozzetti da preparare, centrifugare 2,8 × 10⁸ MTBGFP a 3.200 × g per cinque minuti in una centrifuga con rotor a cestello oscillante. Al termine della centrifugazione, aspirare il soprannatante e aggiungere cinque millilitri di RPMIC per lavare i batteri. Pipettare su e giù per risospendere le cellule.Quindi centrifugare nuovamente. Dopo la seconda centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule batteriche in sette millilitri di RPMIC, quindi vortexare per 10 secondi. Successivamente, per ogni piastra a 96 pozzetti da preparare, centrifugare sette volte 10 alla sesta cellule monocitiche umane THP1 a 250 × g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule THP1 in sette millilitri di RPMIC. Successivamente, preparare una piastra a 96 pozzetti per l'infezione aggiungendo 200 microlitri di acqua sterile nei pozzetti delle righe A e H e delle colonne 1 e 12. Questo bordo di acqua impedirà l'evaporazione del mezzo di coltura.Aggiungere 200 microlitri di RPMIC nella colonna due, da B2 a G2, per il controllo di fondo o bianco. Per infettare il monocita THP1, utilizzare una pipetta per trasferire sospensione batterica MTBGFP preparata nella sospensione cellulare THP1 e mescolare aspirando e dispensando ripetutamente con la pipetta. La densità finale delle cellule THP1 è pari a cinque volte 10 alla quinta per millilitro e il corrispondente multiplo di infezione è 40.Successivamente, versare la sospensione di THP1 MTBGFP in un serbatoio da 25 millilitri e quindi, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri di sospensione di THP1 MTBGFP in tutte le restanti 96 pozzetti, da E3 a G11. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius, con 5%CO2, per sette-dieci giorni. Ogni due giorni durante l'incubazione, utilizzare una pipetta multicanale per sostituire il mezzo, rimuovendo lentamente 100 microlitri di mezzo usato dalla superficie di ogni pozzetto e aggiungendo delicatamente 100 microlitri di RPMIC preriscaldato.Quando si cambia il mezzo, è importante fare attenzione a non disturbare gli aggregati di macrofagi MTB sul fondo delle pozzette. Ogni giorno esaminare visivamente le pozzette utilizzando un microscopio a fluorescenza, dotato di illuminazione in campo chiaro e filtri per GFP, con un obiettivo da 4 a 10 X. Osservare le dimensioni degli aggregati di macrofagi MTB e acquisire immagini, se desiderato.Entro il giorno sette al dieci, gli aggregati di macrofagi MTB dovrebbero essere abbastanza grandi da poter procedere con il test di efficacia del farmaco, come descritto successivamente nel video. Per il test del farmaco, preparare due farmaci antitubercolari in triplice replicato su una nuova piastra a 96 pozzetti come segue. Innanzitutto, aggiungere 125 microlitri di mezzo 7H9C nei pozzetti B da due a G 10.Preparare successivamente i due farmaci a una concentrazione doppia rispetto alla concentrazione finale desiderata più alta, in un millilitro di 7H9C. Utilizzando una pipetta, aggiungere 250 microlitri di ciascun farmaco nei pozzetti B, C e D 11, e successivamente nei pozzetti E, F e G 11 rispettivamente, per i trattamenti in triplice replicato. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, diluire in modo seriale i farmaci in maniera due volte, trasferendo 125 microlitri da B 11 a G 11 nei pozzetti B 10 a G 10.Mescolare aspirando e dispensando cinque volte con la pipetta a ogni passaggio. Continuare a trasferire 125 microlitri da una colonna all'altra da destra a sinistra lungo la piastra, fermandosi dopo la colonna quattro. Dopo aver mescolato la colonna quattro, scartare 125 microlitri in un contenitore per rifiuti.Le colonne due e tre non devono contenere alcun farmaco. Questo consentirà di utilizzarle come controllo di fondo e come controllo positivo per la crescita. Successivamente, prelevare la piastra a 96 pozzetti contenente i macrofagi infettati da MTB dall'incubatore.Senza inclinare la piastra, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere 150 microlitri di mezzo dalle pozzette B da due a G 11. Successivamente, inclinare la piastra come mostrato qui, inserire le punte della pipetta sul bordo inferiore delle pozzette ed eliminare il mezzo rimanente, circa 50 microlitri. Poiché gli aggregati di MTB e macrofagi aderiscono al fondo della pozzetta, non dovrebbe andare perso alcun materiale.Tuttavia, la rimozione del mezzo deve essere il più delicata possibile e si deve fare attenzione ad evitare la risospensione durante questo processo. Aggiungere delicatamente 100 microlitri di mezzo 7H9C alle pozzette B da due a G 11 della piastra, che contengono gli aggregati di macrofagi MTB. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri del farmaco contenuto nella piastra a 96 pozzette alle corrispondenti pozzette della piastra di infezione.Quindi posizionare la piastra in un sacchetto sigillato e incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius. Il saggio con resazurina si basa sulle specie ossidanti prodotte dal MTB metabolicamente attivo per convertire la resazurina blu in resorufina fluorescente di colore rosa. Il cambiamento di colore e fluorescenza può essere utilizzato come marcatore surrogato per determinare la quantità di crescita batterica.Preparare una soluzione madre di resazurina a una concentrazione finale di 8 milligrammi per millilitro in acqua. Filtrare attraverso una membrana in PVDF con un diametro dei pori di 22 micrometri per sterilizzare. Preparare una soluzione di lavoro in resazurina mescolando la soluzione madre, acqua e Tween-80 in un rapporto di due a uno a uno.Le concentrazioni finali sono di 4 milligrammi per millilitro di resazurina e del 5% di Tween-80. Utilizzando un lettore di piastre, impostare un programma per leggere la fluorescenza con eccitazione a 530 nanometri e emissione a 590 nanometri per 24 ore ogni 30 minuti a 37 gradi Celsius. Preriscaldare il lettore di piastre a 37 gradi Celsius.Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 microlitri di soluzione di lavoro di resazurina nei pozzetti da B2 a G11 della piastra trattata con il farmaco. Posizionare la piastra sul lettore e avviare il programma. Per confermare la robustezza dell'adattamento di questo modello di infezione al formato di piastra a 96 pozzetti, la suscettibilità del MTB alla rifampicina (RIF) e alla moxifloxacina (moxy) è stata valutata come descritto in questo video.Come mostrato qui, le strutture aggregate di macrofagi MTB sono state generate con successo in un formato a piastra a 96 pozzetti, consentendo così la compatibilità con analisi ad alto rendimento. Per misurare quantitativamente la conversione del resazurin come indicatore della crescita batterica, la fluorescenza dei singoli pozzetti è stata monitorata in modo cinetico per 24 ore. La presenza di cellule MTB vitali è determinata dalla conversione del colorante resazurin blu nella sua forma ridotta rosa, che si riflette quantitativamente nei valori relativi di fluorescenza al punto di tempo di saturazione.Questi grafici rappresentativi in miniatura mostrano le unità di fluorescenza risultanti riportate sull'asse Y rispetto al tempo riportato sull'asse X. Per generare le curve di uccisione per la suscettibilità ai farmaci, i pozzetti trattati con rifampicina e moxifloxacina sono stati normalizzati al controllo senza farmaco con crescita massima di MTB, corrispondente al 100% di sopravvivenza. I segnali di fondo dei controlli vuoti sono stati sottratti da ogni pozzetto campione.La percentuale di sopravvivenza è stata riportata in grafico per ciascuna singola concentrazione del trattamento farmacologico al fine di generare una curva di uccisione. Questi dati mostrano che la concentrazione inibitoria minima, definita come la concentrazione più bassa dell'antibiotico alla quale si osserva un'inibizione della crescita del 90%, è superiore a due microgrammi per millilitro, sia per la rifampicina che per la moxifloxacina, nei confronti del MTB derivato dal nostro modello di infezione. Pertanto, la concentrazione inibitoria minima di questi due farmaci nei confronti del MTB, determinata utilizzando il nostro modello di infezione e il nostro saggio, rispecchia in modo più accurato l'attività di questi farmaci in vivo.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare in modo affidabile e riproducibile strutture aggregate di macrofagi infettati da MTB per test di suscettibilità ai farmaci mediante il saggio con resazurina. Seguendo questa procedura, è facile modificare il modello di farmaco passando da due farmaci, come mostrato, a un pannello di libreria di 58 farmaci, consentendo uno screening ad alto rendimento dei farmaci.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra un test per valutare l'efficacia dei farmaci contro l'infezione da Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Viene generato un modello di infezione in vitro contenente aggregati di Mtb/macrofagi che imita l'infezione in vivo. Dopo l'introduzione di antibiotici adeguati, la loro efficacia viene testata tramite il dosaggio della resuzarina per monitorare la sopravvivenza dei batteri con l'aumentare delle concentrazioni di farmaci.

Un test per valutare l'efficacia di un farmaco contro un modello di infezione da Mycobacterium tuberculosis

Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all'interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

La quantificazione rapida ed efficiente della crescita intracellulare di M. tuberculosis è fondamentale per perseguire terapie migliori contro la tubercolosi (TB). Questo protocollo descrive un test di rilevamento colorimetrico basato sul brodo utilizzando un sistema di coltura liquida automatizzato per quantificare la crescita di Mtb nei macrofagi trattati con terapie candidate dirette dall'ospite.

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

La determinazione delle unità formanti colonie (CFU) è la tecnica gold standard per quantificare i batteri, tra cui il Mycobacterium tuberculosis che può richiedere settimane per formare colonie visibili. Qui descriviamo un micro-CFU per la determinazione di CFU con una maggiore efficienza temporale, una riduzione dello spazio di laboratorio e del costo dei reagenti e la scalabilità per esperimenti a media e alta produttività.

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Questo studio ha sviluppato un test per lo screening ad alto rendimento contro Mycobacterium abscessus con un ceppo doppio reporter di recente creazione, utilizzando la fluorescenza e la luminescenza per valutare rapidamente la vitalità batterica. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che mirano a selezionare nuovi farmaci contro questo batterio resistente ai farmaci.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Questo studio fornisce un protocollo per valutare l'interazione del Mycobacterium tuberculosis con il sensore microbico SLAMF1. I saggi sono stati condotti su macrofagi umani derivati da monociti utilizzando la citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza. Gli strumenti descritti sono rilevanti per lo studio delle interazioni tra patogeni e immunorecettori.

Saggi di fluorescenza per lo studio dell'interazione del Mycobacterium tuberculosis con il recettore immunitario SLAMF1

Mycobacterium tuberculosis forma biofilm droga tolleranti, quando coltivate in determinate condizioni. Qui si descrivono i metodi per la coltura M. biofilm tubercolosi e che determinano la frequenza di persistenti droga tolleranti. Questi protocolli saranno utili per ulteriori studi sui meccanismi di tolleranza al farmaco in M. tubercolosi.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

La tubercolosi e la malaria sono due delle infezioni più diffuse negli esseri umani e le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Abbiamo stabilito un sistema modello sperimentale per lo studio esito della malaria, tubercolosi coinfezione nei topi dopo la sfida con entrambi i patogeni tramite il loro percorso naturale di infezione.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Un microarray amplificazione combina asimmetrica amplificazione PCR e ibridazione microarray in una sola camera, che semplifica significativamente workflow microarray per l'utente finale. La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray, che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Scopri un test high-throughput per valutare l'efficacia dei farmaci contro Mycobacterium tuberculosis in macrofagi. Questo metodo compatibile BSL-2 utilizza un colorante di vitalità per screening rapidi e predittivi.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi

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