Name: Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri la riprogrammazione diretta di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti mediante i fattori di trascrizione GHMT. Questo metodo permette di generare e quantificare sottotipi cardiaci specifici per studi di biologia rigenerativa.

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A.F.-P. è stato supportato dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship con sovvenzione n. 2015165336. N.V.M è stato sostenuto da sovvenzioni del NIH (HL094699), del Burroughs Wellcome Fund (1009838) e della March of Dimes (#5-FY14-203). Ringraziamo Young-Jae Nam, Christina Lubczyk e Minoti Bhakta per i loro importanti contributi allo sviluppo del protocollo e all'analisi dei dati. Ringraziamo anche John Shelton per il prezioso contributo tecnico e i membri del laboratorio Munshi per la discussione scientifica.

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono le pratiche degli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal cura e l&#39;uso a UT Southwestern Medical Center. 1. Isolamento di HCN4-GFP E12.5 embrionali di topo fibroblasti (MEF) <ol><li> Impostare accoppiamenti cronometrati tra omozigoti maschi HCN4-GFP e CD-1 femmine. </li><li> Sacrifica femmina incinta a E12.5 dal biossido di carbonio l&#39;eutanasia e la successiva dislocazione cervicale. <ol><li> Rimuovere corna uterine con dissettore come descritto in precedenza 22, 23, e metterli in una capsula di Petri sul ghiaccio con soluzione salina 1x tampone fosfato (PBS) senza Ca 2+ e Mg 2+. </li></ol></li><li> Eseguire tutti i passaggi successivi nella cappa di coltura utilizzando la tecnica sterile. <ol><li> Rimuovere gli embrioni dall&#39;utero e amniotico sac con le forbici e pinze dissezione. Mantenere la placenta allegata per una migliore maneggevolezza. pregnant CD-1 le femmine in genere partoriscono tra 10 e 14 cuccioli. </li><li> Utilizzando dissezione pinze, prendere gli embrioni isolate e rapidamente sciacquare due volte in 70% (v / v) EtOH. NOTA: I lavaggi devono essere veloci per ridurre al minimo la morte delle cellule. </li><li> Togliere la testa, gli arti, la coda, e gli organi interni, compreso il cuore dagli embrioni isolate. </li><li> Posizionare il tessuto rimanente in un 10 cm Piatto con 1 ml di PBS 1x e tritare finemente usando una lama di rasoio sterile a circa 1 mm 3 dimensioni. </li><li> Trasferire il tessuto tritato in una provetta da 50 ml con PBS. </li><li> Spin a 300 xg per 3 min. Con attenzione aspirare l&#39;eccesso di PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di sterile 0,25% tripsina-EDTA per ogni embrione. Incubare le cellule in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 15 min. Mescolare delicatamente il tubo ogni 4 min. Over-digestione del tessuto abbasserà notevolmente la resa. </li><li> miscela di cellule Vortex a velocità massima (3.200 rpm) per 4 s. </li><li> Aggiungere 2 ml di media fibroblasti per embrioni e mescolare. Filtro tttraverso un colino cella di 100 micron con una pipetta per aiutare le cellule attraverso il filtro. Fare riferimento alla Tabella 1 per la formulazione di tutti i mezzi successive. </li><li> Spin a 300 xg per 4 minuti. Con attenzione aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungere 10 ml di mezzi di fibroblasti fresca per 3 embrioni e triturare 6-10 volte. </li><li> Piastra le cellule in 1 15 cm piatto di coltura di tessuti per ogni 3 embrioni preparati. Cultura overnight a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione durante la notte, sostituire il supporto con freschi 30 ml di supporti per piastra. Mettere le cellule di nuovo nel incubatore durante la notte. NOTA: Verificare la presenza di contaminazione delle cellule HCN4-GFP + sotto un microscopio a fluorescenza. La cultura dovrebbe essere GFP - e diventare solo GFP + sulla riprogrammazione. </li><li> Il giorno dopo, le cellule raccolto con 3 ml di fresca pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA. Contare e congelare le cellule. Tipicamente, congelare cellule a 3 x 10 6 cellule per ml. Il Yie previstold dovrebbe essere di 3 x 10 6 cellule per dell&#39;embrione. </li></ol></li></ol> 2. Retrovirus Produzione e riprogrammazione Attenzione: il seguente protocollo richiede la produzione e la gestione dei retrovirus infettive. Effettuare le seguenti operazioni in un armadio biosicurezza di livello 2 sotto BSL-2 linee guida e tecnica sterile. Utilizzare il 10% di candeggina per smaltire tutti i materiali esposti a retrovirus. <ol><li> La produzione Retrovirus e preparazione MEF NOTA: Il seguente protocollo è per la produzione di retrovirale in 6 pozzetti e infezioni MEF in piastre da 24 pozzetti. Per gli altri formati, fare riferimento alla Tabella 2. MEF sono placcati in occasione della Giornata -1, così dovrà essere coordinata in modo appropriato per ogni esperimento (fare riferimento alla sezione 2.3 e Figura 2) la tempistica. <ol><li> Mantenere le cellule secondo le raccomandazioni del produttore Plat-E (PE). In breve, le cellule cultura PE in DMEM supplementato con 10% FBS, 1 mg / ml puromycin, 10 mg / ml blasticidin, la penicillina, e streptomicina. cellule Passage 1: 4 ogni due giorni in cui la cultura raggiunge il 70-90% di confluenza. </li><li> Giorno -2: Il giorno prima trasfezione, le cellule seme Plat-E a cellule 1 x 10 6 / bene su un 6-pozzetti nei media trasfezione. Le cellule devono essere 70-80% confluenti al momento della transfezione. </li></ol></li><li> Trasfezione utilizzando un agente trasfezione commerciale. NOTA: I reagenti commerciali devono essere a temperatura ambiente (RT) prima di trasfezione. Per la trasfezione del DNA, aggiungere ogni DNA plasmide retrovirale singolarmente (G, H, M e T) per formare un cocktail GHMT 9. <ol><li> Giorno -1: In una provetta di polistirene da 15 ml conica, mescolare 60 ml di mezzi siero ridotti con 6 ml di trasfezione reagente per la reazione per un formato 6-pozzetti. Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Dal momento che il reagente di trasfezione usato qui si lega alla plastica, undd direttamente ai media siero ridotta per evitare qualsiasi diminuzione di efficienza di trasfezione. </li><li> Aggiungere un totale di 2 mg di GHMT cocktail a reazione e delicatamente toccare per mescolare. Non farlo vortice. Incubare la reazione per 15 minuti a RT. </li><li> Aggiungere il composto dal punto 2.2.3 alle cellule PE in maniera saggia goccia. </li><li> Incubare le cellule trasfettate Plat-E durante la notte in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Registrare il tempo di trasfezione. </li></ol></li><li> Semina di HCN4-GFP fibroblasti embrionali di topo. <ol><li> 1 h prima della placcatura MEF, preparare un 24-pozzetti per immunocitochimica. <ol><li> Aggiungere un fibronectina coprioggetto 12 millimetri per pozzetto. </li><li> Pozzi cappotto con 300 ml di soluzione di collagene bovino (ad esempio, SureCoat) e incubare in un incubatore a 37 ° per 1 ora. </li><li> soluzione di rivestimento Aspirare immediatamente prima placcatura MEF. </li></ol></li><li> Scongelare una fiala congelata di HCN4-GFP MEF e lavare x1 con fibrobl pre-riscaldatosupporti AST a 500 xg per 5 min. </li><li> Determinare la vitalità delle cellule utilizzando trypan esclusione blu o coloranti simili. Calcolare il numero di cellule vitali per ml di coltura utilizzando la seguente formula: % cellule vitali = [1.00 - (Numero di celle blu / numero di cellule totali)] x 100 <ol><li> Calcolare il numero totale di cellule vitali utilizzando la seguente formula: Le cellule vitali =% cellule vitali x fattore di diluizione x 10.000 x volume totale della sospensione cellulare </li></ol></li><li> Seed 3 x 10 4 cellule per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti con collagene bovino coprioggetto soluzione fibronectina precedentemente preparato. </li></ol></li><li> La trasduzione e riprogrammazione di MEF NOTA: Secondo le note del produttore, corretta manutenzione cellule Plat-E producono un titolo medio di 1 x 10 7 unità di infezione / mL. Anche se il titolo non viene misurato direttamente per ogni esperimento, un controllo GFP è sempre inclusa come un surrogato per l&#39;efficienza infezione.Espressione alta GFP e l&#39;intensità (GFP +&gt; 95%) correla generalmente con successo generazione GHMT-mediata di iCLMs. <ol><li> Giorno 0: 24 ore dopo la trasfezione, filtrare il medium retrovirale PE attraverso una dimensione del filtro di acetato 0,45 micron-pori senza tensioattivi di cellulosa e trasferimento in un tubo da 15 ml. Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 8 mg / mL. ricostituire con attenzione le cellule con 2 ml di terreno fresco trasfezione. NOTA: Le cellule facilmente staccano dalla piastra se il supporto è cambiato troppo rapidamente. </li><li> Aspirare il mezzo di coltura delle MEF e aggiungere il supporto retrovirale appena raccolti; esso dovrebbe produrre 1,7 ml di mezzi per pozzetto di un 6-pozzetti. Aggiungere ~ 800 ml per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Rientro piatto MEF per l&#39;incubatore e incubare una notte. </li><li> Giorno 1: ripetere le fasi 2.4.1 e 2.4.2. Eliminare le celle dopo la collezione di virus 2 °. Rientro MEF infetti per l&#39;incubatore e lasciarli riposare durante la notte. </li><li> 2 ° giorno: 48 ore dopo l&#39;induzione, aspirare il cellulare condizionata media e lavare x1 con PBS 1x. Aggiungere i media iCLM 500 ml di pre-riscaldato per pozzetto di una piastra ben 24. </li><li> Sostituire i media iCLM ogni 2 - 3 giorni. Placca di 14 giorni dopo l&#39;induzione virale per immunocitochimica (ICC) analisi della riprogrammazione cardiaco. </li></ol></li></ol> 3. Immunocolorazione di MEF riprogrammato <ol><li> 14 giorni post-induzione, aspirare accuratamente la media. </li><li> Lavare ogni pozzetto con 300 ml di 1x PBS ghiacciato. Aspirare la soluzione in eccesso. </li><li> Fissare le cellule con 250 ml di paraformaldeide soluzione al 4% (PFA) per pozzetto di una piastra ben 24. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente. NOTA: fisso cellule possono essere conservate in PBS a 4 ° C per 1 - 2 settimane prima colorazione. </li><li> cellule permeabilize da Wells lavaggio x3 con 300 microlitri di 0.1% PBS-TritonX 100 (PBST). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Aspirare la soluzione in eccesso dopo l&#39;ultimo lavaggio. </li><li> Blocco per 10minuti a temperatura ambiente con 1x universale blocchetto a 300 ml / pozzetto. </li><li> Preparare buffer di colorazione (ICC): Aggiungere 1: 1 di PBS 1x e 1x universale tampone di bloccaggio. Diluire gli anticorpi primari nel buffer di colorazione ICC e incubare anticorpi notte a 4 ° C. Fare riferimento alla sezione materiale per diluizioni raccomandate. <ol><li> Macchia un paio di diapositive con il mouse α-actinina, αGFP pollo e coniglio NPPA per iPM e l&#39;identificazione iAM. </li><li> Macchia un paio di diapositive con il mouse α-actinina, αGFP pollo e di coniglio per MYL2 iPM e IVM identificazione. </li></ol></li><li> Il giorno seguente, lavare i pozzetti x3 con 300 microlitri di 0.1% PBST. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Aspirare la soluzione in eccesso dopo l&#39;ultimo lavaggio. </li><li> Preparare le diluizioni degli anticorpi secondari nel buffer ICC colorazione. Fare riferimento alla sezione materiale per diluizioni raccomandate. Incubare anticorpi secondari 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. <ol><li> Macchia tutte le diapositive con il seguente antibodie secondarias: il mouse Alexa-555, pollo Alexa-488, e coniglio Alexa-647. </li></ol></li><li> Lavare pozzi x3 con 300 microlitri di 0.1% PBST. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Proteggere dalla luce. </li><li> Aggiungere 2,4 ml di mezzo di montaggio contenenti 1,5 mg / mL di 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) su un vetrino per microscopio. Rimuovere con attenzione il vetrino dal pozzo della piastra 24 pozzetti, rimuovere la soluzione in eccesso, e trasferire al vetrino con mezzi di montaggio. Premere delicatamente il vetrino per rimuovere l&#39;eccesso di volume e l&#39;aria. </li><li> diapositive Seal con smalto preferito o sigillante di plastica. Conservare diapositive montate a 4 ° C al riparo dalla luce. </li></ol> 4. Identificazione di cardiache sottotipi Utilizzando Microscopia confocale NOTA: Per l&#39;imaging, un microscopio confocale dotato di almeno 2 rivelatori fluorescenti capaci di rilevazione spettrale a 405, 488, 555 e 639 nm lunghezza d&#39;onda necessaria per identificare IPM, Iams, e IVMS. imagcellule e utilizzando un piano-Apochromat 20X / 0.75 obiettivo o migliore. Utilizzando il software di analisi di immagine del produttore, la digitalizzazione delle immagini dello zoom può ottenere immagini di qualità ad immersione 40X-petrolio. <ol><li> libreria Immagine: prendere immagini a 8 bit con DAPI, Alexa-488, Alexa-555, e Alexa-647 canali (cap.). Pixel tempo di sosta di 6 s, 1024 dimensione del frame, passo la linea a 2, e la media dei 2 è sufficiente per immagini ad alta risoluzione. </li><li> Per ogni diapositiva, iniziare da un bordo e iniziare la scansione su e giù nel canale rosso fluorescente (ch.) Per le cellule sarcomere + α-actinina + (Fare riferimento alla Figura 3 e Figura 5A per gli esempi). striature sarcomere sono più facili da identificare visivamente nella lunghezza d&#39;onda 555 nm. <ol><li> Una volta che un α-actinina + cellule sarcomere + è stato identificato, passare alla ch verde. e di tenere nota se è positivo (IPM). Passare al computer per valutare il far-rosso 647 ch. (IAM o IVM). Nota: le celle che sonoα-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 - sono designati come IPMS. Espressione GFP sarà visto in tutta la cella (Figura 4A). </li><li> diapositive macchia con α-actinina (mouse Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), NPPA (coniglio-Alexa647) e DAPI. Le cellule che sono α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / NPPA + sono iAM. NPPA colorazione apparirà perinucleare e puntiformi (Figura 4B). </li><li> diapositive macchia con α-actinina (mouse Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), MYL2 (coniglio-Alexa647). Cellule positive per la α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / + MYL2 sono IVMS. MYL2 colorazione esporrà una forma striato lungo il filamento sarcomero. A causa di variazioni nella qualità della colorazione e Z-plane, striature non sono sempre facilmente visibili (Figura 4C). </li></ol></li></ol> NOTA: Per valutare il numero effettivo di MEF potenzialmente riprogrammati, 2 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti vengono seminate in parallelo ai pozzetti sperimentali sono raccolte un giorno dopo la placcatura. Il numero totale di cellule piastrate è quindi determinata dalla media dei due pozzetti. Questo diventa le cellule totali effettivi cromato (atotal). <ol><li> sarcomere + <ol><li> Visivamente ogni cella su un vetrino per la corretta α-actinina + / sarcomero + (pannelli di destra Figura 3) e registrare (Figura 5B-i). </li><li> Tabulare il numero totale di α-actinina + / + sarcomere su ogni vetrino e dividere per le cellule totali effettivi cromato (atotal) (Figura 5B-III). Ad esempio, se atotal = 12.500 cellule, e 100 cellule sono state alfa-actinina + / + sarcomere poi, 0,8% dei MEF placcati stati riprogrammato. Una mediareprograming esperimento produrrà cellule 1% alfa-actinina + / sarcomero + (Figura 5C). </li></ol></li><li> sottotipo + NOTA: Per le seguenti operazioni, fare riferimento alla Figura 5B / C per un flusso di lavoro rappresentante iCLM quantificazione. In breve, per ogni sarcomero + cellulare, tabulare se è unica sia per il sottotipo (Figura 5B-i). Calcolare% sottotipo (Figura 5B-iii) dividendo il numero di cellule sottotipo + sul sarcomere media + cellule x 100 (Figura 5B-i). Per calcolare l&#39;assoluta efficienza% sottotipo (Figura 5B-IV), dividere il numero sottotipo + cellulare da figura 5B-i per il numero totale di cellule seminate x 100 (Figura 5B-ii). <ol><li> Per le celle ciascuno di α-actinina + / + sarcomere, valutare se sono GFP +, NPPA +, o MYL2 <sup&gt; +. </li><li> Tabulare numero totale di α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 -, actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / NPPA +, e α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - + cellule / MYL2 (Figura 5B-i). </li><li> Per calcolare la percentuale di ciascun sottotipo, dividere il numero di cellule Sottotip + per il numero totale di α-actinina + / + cellule sarcomere in che pure e moltiplicare per 100. GHMT genera IPMS, Iams, e IVMS più o meno uguali rapporti (Figura 5B-III). </li><li> Per calcolare il numero assoluto di sottotipo + cellule, dividere il numero totale di sottotipo + cellule per la condizione sperimentale atotal e moltiplicare per 100 (Figura 5B-ii). Su IPMS media rappresentano lo 0,3% della popolazione cellulare infettata totale, Iams 0,3%, eIVMS 0,25% (Figura 5B-iv). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il presente studio fornisce una strategia a riprogrammazione diretta per la conversione di MEF in un insieme diversificato di sottotipi cardiaci tramite espressione retrovirus-mediata della trascrizione cardiaco fattori Gata4, MEF2C, Tbx5, e Hand2 (GHMT). Utilizzando un approccio immunocolorazione multiplex in combinazione con un PM-specifica del mouse giornalista, siamo in grado di identificare iAM, IVMS, e IPMS ad una risoluzione di singola cellula. Tale test permette una sperimentazione in vitro sistema in g...

Il cuore è il primo organo funzionale a sviluppare nell&#39;embrione 1, 2. In combinazione con il sistema circolatorio, fornisce l&#39;ossigeno, nutrienti, e un meccanismo di smaltimento durante lo sviluppo. Tre settimane dopo la fecondazione, il cuore umano batte per la prima volta e la sua regolamentazione adeguata è mantenuta da cardiomiociti (CMS). La perdita irreversibile di queste cellule specializzate è quindi la questione fondamentale sottostante insufficienza cardiaca progressiva. Mentre alcuni organismi come zebrafish e Xenopus hanno il potenziale per la rigenerazione cardiaca, cuore adulto dei mammiferi è più limitata 3, 5, 6. Così, data la funzione critica del cuore, non è sorprendente che la malattia di cuore è la principale causa di morte nel mondo, che rappresentano 600.000 morti nel solo 7 negli Stati Uniti. Ilto, è terapie a base di cellule per riparare o sostituire il miocardio danneggiato in modo efficiente sono di grande interesse clinico. Lo studio fondamentale di Yamanaka e colleghi hanno mostrato che 8 espressione forzata di quattro fattori di trascrizione è sufficiente per convertire i fibroblasti completamente differenziate di cellule staminali pluripotenti. Tuttavia, la capacità tumorigenico di tutte le strategie di cellule staminali pluripotenti è stata una preoccupazione fondamentale per il loro uso per scopi terapeutici. Questo ha motivato il campo scientifico per la ricerca di metodi alternativi per transdifferenziare cellule, evitando uno stadio di pluripotenza. Recentemente, diversi gruppi hanno dimostrato la fattibilità di questa strategia per la visualizzazione di conversione diretta dei fibroblasti di topo a cellule cardiomiociti come indotte (iCLMs) con l&#39;espressione ectopica di fattori di trascrizione Gata4, MEF2C, Tbx5, e più tardi, Hand2 (GMT e GHMT rispettivamente) 9, 10. Furthermore, la stessa strategia può essere eseguita in vivo e in tessuti umani di derivazione 9, 11, 12. Recenti studi hanno evidenziato fattori complementari o vie di segnalazione che possono essere modulati per migliorare ulteriormente l&#39;efficienza riprogrammazione cardiaco 13, 14, 15. Presi insieme, questi studi dimostrano il potenziale di transdifferenziazione diretta per terapie rigenerative. Tuttavia, la scarsa efficienza della riprogrammazione CM, i meccanismi molecolari sconosciuti, riproducibilità incoerente a causa delle differenze metodologiche 16, e la natura eterogenea del iCLMs rimangono senza indirizzo. Al fine di valutare direttamente iCLM eterogeneità, abbiamo progettato un saggio unicellulare discreto e robusto per l&#39;individuazione di sviluppo sarcomere e cardiaco specificatio lignaggion-due necessarie caratteristiche di cardiomiociti funzionali. Ci sono almeno tre tipi principali di CM nel cuore come definite dalla loro posizione e uniche proprietà elettriche: atriale (AM), ventricolare (VM) e pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. In una combinazione orchestrato, permettono il corretto pompaggio di sangue. Durante la ferita del cuore, uno o tutti i sottotipi potrebbero essere interessati, e il tipo di terapia cellulare dovrebbero essere affrontate caso per caso. Attualmente, la maggior parte delle strategie si concentrano sulla generazione complessiva di cardiomiociti, mentre poco lavoro è stato fatto per studiare i meccanismi molecolari che regola specifica sottotipo. Il seguente studio dettagli come quantificare correttamente sarcomeri ben organizzati e identificare un insieme diversificato di sottotipi di cardiomiociti. Utilizzando un pacemaker (PM) topo giornalista SPECIFICI, siamo in grado di applicare un iapproccio mmunocytochemical distinguere miociti atriali indotte-like (IAM), miociti ventricolari come indotta (IVM), e indotti miociti PM-like (IPMS) 21. Sulla base delle nostre osservazioni, solo le cellule che presentano l&#39;organizzazione sarcomere sono in grado di battere spontanea. Questa piattaforma unica riprogrammazione permette di valutare il ruolo di alcuni parametri nell&#39;organizzazione sarcomere, specifica sottotipo, e l&#39;efficienza della riprogrammazione CM ad una risoluzione di singola cellula.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Componente di terreni iCLM, terreni Plat-E, fibroblasti e terreni di trasfezione</td></tr><tr><td>Terreno 199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11150059</td><td>Componente di terreni iCLM</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>Componente di terreni iCLM, terreni Plat-E, fibroblasti e terreni di trasfezione</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td>Componente dei terreni iCLM</td></tr><tr><td>Soluzione vitaminica MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>Componente dei terreni iCLM</td></tr><tr><td>Aminoacidi MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>Componente dei terreni iCLM</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>Componente dei terreni iCLM</td></tr><tr><td>Antibiotici-Antimicotici</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Componente dell'integratore B-27 iCLM media</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Componente dei terreni iCLM</td></tr><tr><td>Siero di cavallo inattivato termicamente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td>Componente dei terreni iCLM</td></tr><tr><td>NaPyruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>Componente dei terreni iCLM</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1514022</td><td>Componente dei terreni Plat-E e dei terreni per fibroblasti</td></tr><tr><td>Puromicina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11139-03</td><td>Componente del terreno Plat-E</td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp; &nbsp;</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>Componente del terreno Plat-E</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Componente del terreno per fibroblasti</td></tr><tr><td>Scansione laser confocale LSM700</td><td>Zeiss</td><td>Per analisi confocale</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione FuGENE 6 Reagente</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Reagente di trasfezione&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM Siero Ridotto Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Reagente di trasfezione&nbsp;</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Reagente di induzione. Utilizzare ad una concentrazione finale di 8 &mu; M/mL</td></tr><tr><td>Platinium-E (PE) Linea cellulare di packagin retrovirale</td>, <td>cellula ecotropicaBiolabs</td><td>RV-101</td><td>Linea cellulare di pacatura retrovirale</td></tr><tr><td>Tripsina 0,25% EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Per MEFs e dissociazione Plat-E</td></tr><tr><td>Topo anti &alfa;-actinina (clone EA-53)</td><td>Anticorpo Sigma</td><td>A7811</td><td>per analisi confocale. Utilizzare in 1:200</td></tr><tr><td>Pollo anti-GFP IgY Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td>Anticorpo per analisi confocale. Utilizzare in scala 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti-NPPA&nbsp;</td><td>Anticorpo Abgent</td><td>AP8534A</td><td>per analisi confocale. Utilizzare a 1:400</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti Myl2 IgG&nbsp;</td><td>ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>Anticorpo per analisi confocale. Utilizzare in soluzione 1:200</td></tr><tr><td>Vectashield con DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>Colorante per analisi confocale</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1,0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat Fibronectina 12 mm Vetrini coprioggetti</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>Vetrini coprioggetti per analisi confocali</td></tr><tr><td>100 &mu; filtro cellulare m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m Siringhe filtri SFCA 25MM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-740-106</td><td>Per filtrazione virus</td></tr><tr><td>6 mL Siringhe</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>Per filtrazione virus</td></tr><tr><td>Capra anti-Pollo IgY (H& L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>Anticorpo secondario per analisi confocale. Utilizzare a 1:400</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio A647 IgG(H+L)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>Anticorpo secondario per analisi confocale. Utilizzare in 1:400</td></tr><tr><td>IgG(H+L) anti-topo di capra A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>Anticorpo secondario per analisi confocale. Utilizzare a 1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml</td><td>Per permeabilizzazione cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS di Dulbecco senza CaCl2 e MgCl2 (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Power Block 10x Reagente bloccante universale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>Diluire a 1x in H2O</td></tr><tr><td>16% Soluzione acquosa di paraformaldeide (PFA)</td><td>Scienze dell'elettromicroscopia&nbsp;</td><td>15710</td><td>Utilizzare al 4% diluito in dH2O</td></tr><tr><td>piastre da 6 cm&nbsp;</td><td>Piastre Olympus</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr>a<td>6 pozzetti</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale da 10 cm</td><td>Corning</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 cm&nbsp; Piastre per coltura tissutale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Corning</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 mL</td><td>Corning</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano allo 0,4%</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Per la vitalità</td></tr><tr><td>Alcool etilico a prova 200</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

valutare cardiomiociti sottotipi a seguito di riprogrammazione fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

La riprogrammazione diretta di un tipo di cellula in un altro è recentemente emersa come un potente paradigma per la medicina rigenerativa, la modellazione delle malattie e la specificazione del lignaggio. In particolare, la conversione di fibroblasti in miociti indotti simili ai cardiomiociti (iCLM) da parte di Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5 (GHMT) rappresenta un'importante via per la generazione de novo di miociti cardiaci in vitro e in vivo. Prove recenti suggeriscono che il GHMT genera una maggiore diversità di sottotipi cardiaci rispetto a quanto precedentemente apprezzato, sottolineando così la necessità di un approccio sistematico alla conduzione di ulteriori studi. Prima che la riprogrammazione diretta possa essere utilizzata come strategia terapeutica, tuttavia, le basi meccanicistiche della conversione del lignaggio devono essere comprese in dettaglio per generare specifici sottotipi cardiaci. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di iCLM mediante riprogrammazione mediata da GHMT di fibroblasti embrionali di topo (MEF). 
Descriviamo metodi per l'isolamento del MEF, la produzione retrovirale e l'infezione da MEF per realizzare una riprogrammazione efficiente. Per determinare l'identità del sottotipo delle cellule riprogrammate, descriviamo in dettaglio un approccio passo-passo per l'esecuzione dell'immunocitochimica sulle iCLM utilizzando un set definito di anticorpi compatibili. Vengono inoltre presentati i metodi per la microscopia confocale, l'identificazione e la quantificazione delle iCLM e dei sottotipi individuali atriali (iAM), ventricolari (iVM) e pacemaker (iPM). Infine, discutiamo i risultati rappresentativi degli esperimenti di riprogrammazione diretta prototipici e sottolineiamo importanti aspetti tecnici del nostro protocollo per garantire un'efficiente conversione del lignaggio. Nel complesso, il nostro protocollo ottimizzato dovrebbe fornire un approccio graduale per consentire agli investigatori di condurre esperimenti di riprogrammazione cardiaca significativi che richiedono l'identificazione di singoli sottotipi di CM.

Approfittando della PM-specifica del mouse giornalista, abbiamo sviluppato una strategia immunocolorazione multiplex per identificare i diversi miociti endogeni come illustrato nella figura 1. Seguendo la procedura di riprogrammazione mostrati nella Figura 2, l&#39;induzione di CM specifici del sottotipo può essere rilevato fin dal giorno 4 21, anche se ad un basso tasso. Entro il giorno 14, l&#39;esperimento può essere fermato e ...

Questo manoscritto descrive un protocollo passo-passo per la generazione e la quantificazione di diversi sottotipi cardiaci riprogrammati utilizzando una somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è generare e quantificare un'ampia gamma di sottotipi di cardiomiociti indotti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali chiave riguardo la conversione di lignaggio specifica per sottotipo durante il riprogrammazione cardiaco, come ad esempio i segnali necessari che regolano l'assemblaggio del sarcomero e la specificazione del sottotipo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un metodo per quantificare gli effetti sulla specificazione del sottotipo cardiaco, essenziale per condurre studi meccanicistici.Per iniziare, isolare i fibroblasti embrionali di topo da embrioni allo stadio E 12,5. Conservarli in azoto liquido come descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, raccogliere le cellule plat-E e seminarle a un milione di cellule per pozzetto in una piastra a sei pozzetti, in modo che le cellule raggiungano una confluenza del 70-80% entro 24 ore.Coprire le cellule con il mezzo di trasfezione e incubarle in condizioni di coltura standard. Il giorno prima dell'esperimento, prendere un tubo conico in polistirene da 15 millilitri e mescolare 60 microlitri di mezzo con siero ridotto co

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Biologia dello sviluppo

Singoli profili di espressione delle cellule consente la dettagliata analisi di espressione genica di cellule singole. Noi descrivere i metodi per l'isolamento dei cardiomiociti, e preparare il lisati risultante sia per microarray intero trascrittoma o qPCR di obiettivi specifici.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

Descriviamo qui un protocollo per la generazione di iCM utilizzando la somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Tbx5 e Mef2c in un costrutto policistico. Questo protocollo produce una popolazione relativamente omogenea di cellule riprogrammate con una migliore efficienza e qualità ed è prezioso per studi futuri sulla riprogrammazione di iCM.

Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5

Un regolamento messa a punto della trascrizione genica alla base embrionali decisione destino della cellula. Qui, descriviamo immunoprecipitazione della cromatina utilizzati per indagare regolazione epigenetica di entrambi differenziazione cardiaca delle cellule staminali e sviluppo cardiaco di embrioni di topo.

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

Questo protocollo descrive un metodo passo-passo per l'isolamento riproducibile e la coltura a lungo termine di cardiomiociti di topo adulto con alta resa, purezza e vitalità.

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Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo attraverso la sovraespressione di un insieme minimo di fattori di trascrizione. Questa tecnologia può essere tradotta nel sistema umano per fornire piattaforme per studi futuri sull'emopoiesi, la malattia ematologica e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

Per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti, presentiamo protocolli che utilizzano due linee di topi transgenici: Myh6-H2B-mCh topi transgenici, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Qui, presentiamo un metodo per sfruttare in modo efficiente il potenziale di differenziazione cardiache di giovane fonti di cellule staminali mesenchimali umane al fine di generare cellule funzionali, contraenti, del cardiomyocyte-come in vitro.

In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

Qui presentiamo un metodo affidabile per riprogrammare i fibroblasti embrionali primari in cardiomiociti funzionali tramite sovraespressione di GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) al fianco di inibizione di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo genera pestaggio cardiomyocytes fin dal post-traduzionali di 7 giorni con fino a 60% efficienza.

Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti

Descriviamo qui, l'istituzione e l'applicazione di una linea di reporter del mouse Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (indicata come αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito) per la valutazione della riprogrammazione cardiaca. I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) isolati dal ceppo murino vengono convertiti in cardiomiociti indotti (iCM), consentendo una valutazione comoda ed efficiente dell'efficienza di riprogrammazione e della maturazione funzionale...

Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

Scopri la riprogrammazione diretta di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti mediante i fattori di trascrizione GHMT. Questo metodo permette di generare e quantificare sottotipi cardiaci specifici per studi di biologia rigenerativa.

Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo (Video) | JoVE Journal

Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

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