Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

L'obiettivo generale di questo procedimento è generare e quantificare un'ampia gamma di sottotipi di cardiomiociti indotti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali chiave riguardo la conversione di lignaggio specifica per sottotipo durante il riprogrammazione cardiaco, come ad esempio i segnali necessari che regolano l'assemblaggio del sarcomero e la specificazione del sottotipo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un metodo per quantificare gli effetti sulla specificazione del sottotipo cardiaco, essenziale per condurre studi meccanicistici.

Per iniziare, isolare i fibroblasti embrionali di topo da embrioni allo stadio E 12,5. Conservarli in azoto liquido come descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, raccogliere le cellule plat-E e seminarle a un milione di cellule per pozzetto in una piastra a sei pozzetti, in modo che le cellule raggiungano una confluenza del 70-80% entro 24 ore.

Coprire le cellule con il mezzo di trasfezione e incubarle in condizioni di coltura standard. Il giorno prima dell'esperimento, prendere un tubo conico in polistirene da 15 millilitri e mescolare 60 microlitri di mezzo con siero ridotto con sei microlitri di reagente per la trasfezione per ogni reazione. Incubare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dato che il reagente di trasfezione richiede l'aggiunta diretta del reagente nel mezzo con siero ridotto per evitare qualsiasi diminuzione dell'efficienza di trasfezione. Successivamente, aggiungere un totale di due microgrammi di cocktail GHMT per ogni reazione, e battere delicatamente il tubo per mescolare. Incubare la reazione per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere la miscela alle cellule plat-E in modo goccia a goccia.

Registrare la data e l'ora della trasfezione. Incubare le cellule plat-E trasfettate durante la notte. Un'ora prima di seminare i fibroblasti embrionali di topo, preparare una piastra a 24 pozzetti per immunoistochimica aggiungendo prima delle coprioggetti rivestiti di fibronectina da 12 millimetri in ogni pozzetto.

Successivamente, aggiungere 300 microlitri di soluzione di collagene bovino in ogni pozzetto e incubare la piastra per un'ora. Verso la fine dell'incubazione, scongelare una provetta congelata di fibroblasti embrionali murini HCN4GFP. Scongelare rapidamente le cellule, lavarle una volta con mezzo per fibroblasti preriscaldato e determinare la concentrazione di cellule vitali.

Quindi aspirare la soluzione di rivestimento nella piastra a 24 pozzetti e piastrare immediatamente 30.000 cellule per pozzetto sui coverslip rivestiti con collagene e fibronectina. 24 ore dopo la trasfezione, filtrare il mezzo retrovirale attraverso un filtro in acetato di cellulosa privo di surfattanti con dimensione dei pori di 0,45 micron e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere la polibrena a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro.

Ricaricare con attenzione le cellule plat-E con due millilitri di mezzo di trasfezione fresco. Cambiare il mezzo troppo rapidamente potrebbe causare il distacco delle cellule. Le cellule plat-E correttamente mantenute producono in media dieci milioni di unità infettive per millilitro.

Elevata espressione e intensità di GFP in oltre il 95% delle cellule, tipicamente correla con una corretta generazione mediata da GHNT di miociti simili a cardiomiociti indotti. Successivamente, aspirare il mezzo dei fibroblasti embrionali coltivati e aggiungere il mezzo retrovirale appena raccolto. Quindi, reinserire la piastra metilcellulosa nell'incubatrice e incubare tutta la notte.

Il giorno successivo, trasferire nuovamente il mezzo dalle cellule plat-E ai fibroblasti embrionali. Scartare le cellule plat-E dopo la seconda raccolta del virus. 48 ore dopo l'induzione, aspirare il mezzo condizionato e lavare le cellule una volta con PBS.

Quindi aggiungere 500 microlitri di mezzo pre-riscaldato indotto per miociti simili a miociti cardiaci per ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Sostituire il mezzo ogni due o tre giorni per i successivi 12 giorni. A 14 giorni dall'induzione, aspirare con attenzione il mezzo e risciacquare ogni pozzetto con 300 microlitri di PBS freddo di ghiaccio.

Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 250 microlitri di una soluzione al 4% di paraformaldeide per pozzetto, quindi incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, permeabilizzare le cellule lavando i pozzetti tre volte per cinque minuti con 300 microlitri di Triton X-100 0,1% in PBS. Aspirare il liquido in eccesso dopo l'ultimo lavaggio, quindi aggiungere un buffer universale di blocco in quantità di 300 microlitri per pozzetto.

Bloccare per 10 minuti a temperatura ambiente. Colorare una coppia di vetri coprioggetto durante la notte con gli anticorpi monoclonali murini anti-alfa actenina, policlonali avicoli anti-GFP e policlonali di coniglio anti-NPPA per identificare i miociti pacemaker simili nei miociti atriali indotti. Il giorno seguente, lavare le pozzette e aggiungere l'anticorpo secondario appropriato come descritto nel protocollo di testo allegato.

Dopo ulteriori lavaggi, aggiungere 2,4 microlitri di mezzo di montaggio su un vetrino da microscopio in vetro. Prelevare un'immersione dalla piastra a 24 pozzetti e rimuovere la soluzione in eccesso. Quindi trasferirla sul vetrino con il mezzo di montaggio.

Per ogni vetrino, partire da un bordo ed eseguire una scansione in alto e in basso nel canale fluorescente rosso per identificare le cellule positive per l'alfa-actinina e per i sarcomeri. Le striature sarcomeriche sono più facili da identificare alla lunghezza d'onda di 555 nanometri. Una volta identificate, passare al canale verde e annotare se le cellule risultano positive.

Quindi passare al computer per analizzare la lunghezza d'onda nel rosso estremo a 647 nanometri per rilevare la colorazione di NPPA o MYL2. Le cellule che risultano positive per l'alfa-actinina, positive per il sarcomero, negative per Hnc4-GFP e positive per Nppa sono miociti indotti simili agli atriali. La colorazione per Nppa apparirà paranucleare e puntiforme.

Prima, contare il numero di cellule 24 ore dopo la semina, come descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, ispezionare visivamente ogni cellula su un'ampolla per verificare una corretta colorazione dell'alfa-actinina e dei sarcomeri, e registrare il numero di cellule positivamente colorate per entrambi i marcatori. Quindi, dividere questo valore per il numero effettivo totale di cellule seminate.

Un esperimento medio di riprogrammazione produrrà circa l'uno percento di cellule che risultano positive per l'alfa-actinina e per i sarcomeri. Al giorno 14, l'esperimento può essere interrotto e valutato per l'organizzazione dei sarcomeri. Questo viene identificato dalla colorazione positiva per l'alfa-actinina mostrata in rosso.

Solo le cellule che mostrano un'organizzazione dei sarcomeri sono in grado di contrarsi spontaneamente, quindi questa è una buona verifica iniziale. Nell'immagine sono mostrati cardiomiociti indotti simili a cellule del nodo del seno provenienti da topi transgenici con reporter Hcn4-GFP. Tre cellule in questa vista mostrano un'organizzazione dei sarcomeri.

Tre gruppi cellulari positivi per Hcn4-GFP sono presenti al centro dell'immagine e possono essere identificati come un tipo di cellula pacemaker. Una cellula in basso a sinistra può essere osservata con la colorazione per l'alfa-actinina, ma non presenta organizzazione dei sarcomeri né marcatori sottotipici identificabili. In questa popolazione di cardiomiociti indotti simili ai ventricolari, la cellula centrale mostra organizzazione dei sarcomeri; questa cellula risulta anche positiva per il marcatore della catena leggera della miosina MYL-2, un marcatore specifico per i cardiomiociti ventricolari.

Una volta acquisite le competenze necessarie, la semina e la trasfezione delle cellule plat-E possono essere eseguite in un'ora. L'induzione dei fibroblasti embrionali murini richiede da una a due ore, mentre la quantificazione del myto in una piastra completa a 24 pozzetti dura circa otto ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che fibroblasti embrionali murini sani e virus ad alto titolo sono fondamentali per un esperimento di riprogrammazione di successo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare e quantificare singoli sottotipi di cardiomiociti indotti.