Taglio di precisione polmone mouse Fette per la visualizzazione in diretta cellule dendritiche polmonare

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare fette polmonari tagliate con precisione, o PCLS, per visualizzare la localizzazione e il traffico di vari tipi di cellule immunitarie nel polmone. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come la localizzazione e i modelli di migrazione delle cellule immunitarie nel polmone. Il vantaggio principale di questa tecnica è che diverse interazioni possono essere visualizzate nel tessuto vivo ex vivo che mantiene l'architettura tridimensionale del polmone.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla localizzazione e sul traffico delle cellule immunitarie durante l'infiammazione, può anche essere utilizzato per visualizzare le vie aeree e la contrazione del tessuto muscolare liscio. Per prelevare il tessuto polmonare, utilizzare prima le forbici per aprire la pelle e il peritoneo dal centro dell'addome fino alla mascella di un topo di età compresa tra sei e 12 settimane e spostare l'intestino sul lato della cavità addominale. Taglia la vena cava inferiore per drenare il sangue dai polmoni e usa la punta affilata delle forbici per perforare il diaframma per consentire l'espansione della gabbia toracica.

Successivamente, usa una pinza per estrarre manualmente le ghiandole salivari e altri tessuti dalla trachea e usa una pinza sottile per praticare un'incisione nella trachea sul lato anteriore della fascia di cartilagine più spessa, abbastanza grande da consentire la penetrazione di un ago calibro 20. Ora fai scorrere un ago calibro 20 da 1,5 pollici su una sezione di tubo in polietilene e taglia il tubo con un angolo di circa 45 gradi. Collegare l'ago a una siringa da un millilitro e aspirare 0,8 millilitri di agarosio a 40 gradi Celsius 2% a basso punto di fusione nella siringa.

Quando tutto l'agarosio è stato caricato, inserire l'estremità smussata del tubo nell'incisione e iniettare lentamente l'agarosio nei polmoni. Senza muovere l'ago o la siringa, fissare la siringa alla base di polistirolo per fissare l'ago all'interno della trachea e riporre l'animale in una posizione di conservazione a 4 gradi Celsius per almeno 10 minuti. Una volta che l'agarosio si è solidificato, usa le forbici per asportare accuratamente i polmoni e mettili in un piatto di tre centimetri contenente PBS ghiacciato.

Quindi ruotare il lobo per l'affettatura dei tessuti in modo che la sezione interna del polmone che si collega alla trachea sia rivolta verso il basso. Per affettare il tessuto polmonare, posizionare prima una piccola goccia di supercolla gel All Purpose No Run su uno stantuffo della siringa di metallo, distribuendo la colla con un movimento circolare. Quando tutta la colla è stata applicata, usa una pinza per afferrare immediatamente ma delicatamente la trachea del lobo asportato con il lato rivolto verso il basso e tampona il lobo su un fazzoletto per rimuovere il liquido in eccesso.

Posizionare con cautela il lobo essiccato sopra lo stantuffo e tagliare il tessuto in eccesso che si estende oltre il bordo dello stantuffo. Spostare lo stantuffo verso il basso in modo che i lati della siringa di metallo si muovano verso l'alto e sopra il tessuto, creando un pozzetto con il polmone nella parte inferiore dello stelo della siringa profondo non più di diversi centimetri. Fissare con del nastro adesivo la parte inferiore della siringa per tenere lo stantuffo in posizione.

Quindi versare con cura 40 gradi Celsius 2% di agarosio a basso punto di fusione nella siringa in modo che copra appena la parte superiore del lobo e circondare la siringa di metallo con un blocco di raffreddamento ghiacciato. Dopo uno o due minuti, caricare la siringa del campione nell'affettatrice automatica e allineare la lama fresca. Quindi, riempire il serbatoio tampone con PBS ghiacciato.

Allineare l'azionamento del motore passo-passo con la siringa del campione e rimuovere il nastro. Ruotare l'interruttore in posizione di avanzamento rapido, fino a quando l'azionamento del motore passo-passo tocca appena la parte posteriore dello stantuffo. Impostare lo spessore del tessuto, la singola fetta continua, l'oscillazione e le impostazioni di velocità sull'affettatrice.

Quindi premere start e utilizzare una spatola sottile per raccogliere ogni PCLS mentre cade nel serbatoio tampone, posizionando le fette in pozzetti individuali di una piastra a 24 pozzetti contenente PBS ghiacciato. Per l'imaging PCLS statico, trasferire i campioni polmonari che contengono l'area anatomica di interesse in singoli piatti di tre centimetri contenenti un millilitro del cocktail di anticorpi appropriato di interesse. Dopo 30-60 minuti su ghiaccio a dondolo e al riparo dalla luce, sciacquare le fette due volte con un millilitro di PBS ghiacciato.

Quindi, aggiungi 50 microlitri di PBS in un nuovo piatto rotondo con fondo di vetro da tre centimetri per campione e trasferisci rapidamente le fette in ogni goccia, manipolando delicatamente i pezzi di tessuto in modo che siano sparsi in piano. Quindi aspirare il PBS con una pipetta e posizionare una goccia di terreno di montaggio a temperatura ambiente sul vetrino, seguita da un vetrino coprioggetti. Per visualizzare il tessuto, posizionare la capsula su un tavolino per microscopio confocale sotto un obiettivo 20x e utilizzare lo strumento piastrella per individuare e contrassegnare i bordi del tessuto nell'impostazione del guscio convesso per ridurre il tempo della scansione delle piastrelle.

Quindi impostare l'intervallo z-stack, facendo attenzione che gli intervalli impostati siano appropriati in più aree della fetta, in particolare lungo i bordi. Per l'imaging di cellule vive, dopo 30 minuti di incubazione nel cocktail di anticorpi di interesse, sciacquare le fette due volte con un millilitro di Leibovitz 10 freddo. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di Leibovitz 10 fresco in una fessura di un vetro di copertura a camera per campione, seguito dal trasferimento immediato di ciascun PCLS al terreno, manipolando delicatamente i tessuti fino a quando non sono distesi in piano.

Quindi utilizzare una pipetta per aspirare il terreno da ciascuna camera e ancorare ogni PCLS con un peso di platino. Pipettare con cura la matrice extracellulare ghiacciata appena preparata su ciascun PCLS, facendo attenzione che il gel sia posizionato sopra le fette polmonari e che le fette non galleggino sopra il gel. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, trasferire il vetrino in una camera per microscopio confocale preriscaldata impostata a 37 gradi Celsius con un obiettivo 20x.

Quindi, impostare gli intervalli z-stack e tile in base all'intervallo desiderato tra i fotogrammi, utilizzando lo strumento affianca per indicare l'area di interesse nel tessuto e l'impostazione della griglia centrata per centrare il campione nel campo visivo. Le cellule dendritiche convenzionali CD11b si localizzano nel parenchima polmonare, mentre le cellule dendritiche convenzionali CD103 positive risiedono principalmente intorno alle vie aeree e all'area subpleurica. La co-colorazione per CD88 e CD172a, permette la distinzione dei macrofagi alveolari CD172a negativi, CD88 positivi, dai macrofagi interstiziali CD172a positivi, CD88 positivi, questi ultimi sono preferenzialmente localizzati nel parenchima, e non nell'area subepiteliale.

La co-marcatura di CD90.2, un noto marcatore delle cellule T, e della proteina di fluorescenza TdTomato, un transgene sotto il controllo trascrizionale di un fattore di trascrizione principale necessario per la linfoagiogenesi, facilita l'identificazione delle strutture linfatiche nel polmone. Le cellule dendritiche convenzionali CD103 positive si trovano in diverse aree anatomiche, tra cui l'epitelio delle vie aeree che esprime CD324, i linfatici e l'area subpleurica. Il movimento cellulare e le interazioni cellula-cellula possono essere registrati utilizzando l'imaging cellulare vivo, come appena dimostrato.

Ad esempio, nell'esperimento rappresentativo, 16 ore dopo l'installazione orale di ovuli-LPS, le cellule dendritiche CD103 positive possono essere chiaramente osservate interagire con le cellule T specifiche per gli ovuli trasferite in modo adottivo per un periodo di quattro ore. Una volta padroneggiate, la preparazione dei tessuti e le tecniche di affettamento possono essere completate in due ore e mezza se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottenere un buon gonfiaggio polmonare di agarosio e di mantenere successivamente le delicate fette polmonari il più piatte possibile per l'imaging.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il trattamento della PCLS con acetilcolina o metacolina, per rispondere a ulteriori domande sulla segnalazione del calcio e sulla contrattilità delle vie aeree in varie condizioni di malattia. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come generare fette polmonari tagliate con precisione per visualizzare la localizzazione, il traffico e le interazioni delle cellule immunitarie nel polmone.