Taglio di precisione polmone mouse Fette per la visualizzazione in diretta cellule dendritiche polmonare

L'obiettivo generale di questo metodo è utilizzare fette polmonari tagliate con precisione, o PCLS, per visualizzare la localizzazione e il traffico di diversi tipi di cellule immunitarie nel polmone. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come ad esempio i modelli di localizzazione e migrazione delle cellule immunitarie nel polmone. Il principale vantaggio di questa tecnica è che numerose interazioni possono essere visualizzate in tessuto vivo ex vivo che mantiene l'architettura tridimensionale del polmone.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla localizzazione e sul traffico delle cellule immunitarie durante l'infiammazione, può anche essere utilizzato per visualizzare la contrazione delle vie aeree e del tessuto muscolare liscio. Per isolare il tessuto polmonare, utilizzare prima le forbici per aprire la cute e il peritoneo dalla parte centrale dell'addome fino alla mascella di un topo di età compresa tra sei e dodici settimane, quindi spostare gli intestini lateralmente nella cavità addominale. Recidere la vena cava inferiore per drenare il sangue dai polmoni ed usare la punta affilata delle forbici per perforare il diaframma, consentendo così l'espansione della gabbia toracica.

Successivamente, utilizzare pinzette per staccare manualmente le ghiandole salivari e altri tessuti dalla trachea e, con pinzette fini, praticare un'incisione sulla trachea nel lato anteriore della banda cartilaginea più spessa, di dimensioni appena sufficienti a permettere il passaggio di un ago da 20 gauge. Ora infilare un ago da 20 gauge lungo 1,5 pollici su un tratto di tubo in polietilene e tagliare il tubo con un angolo di circa 45 gradi. Fissare l'ago a una siringa da un millilitro ed aspirare 0,8 millilitri di agarosio al 2% a basso punto di fusione a 40 gradi Celsius nella siringa.

Una volta caricato tutto l'agarosio, inserire l'estremità smussata del tubo nell'incisione e iniettare lentamente l'agarosio nei polmoni. Senza muovere l'ago né la siringa, fissare la siringa alla base in polistirene con del nastro adesivo per mantenere l'ago in posizione nella trachea e collocare l'animale in un ambiente a 4 gradi Celsius per almeno 10 minuti. Dopo che l'agarosio si è solidificato, utilizzare le forbici per asportare con attenzione i polmoni e posizionarli in una piastra da 3 centimetri contenente PBS ghiacciato.

Quindi ruotare il lobo per il taglio del tessuto in modo che la sezione interna del polmone, che si collega alla trachea, sia rivolta verso il basso. Per tagliare il tessuto polmonare, posizionare innanzitutto una piccola goccia di colla superattiva All Purpose No Run su un pistone metallico di siringa, spargendo la colla con un movimento circolare. Una volta applicata tutta la colla, utilizzare una pinzetta per afferrare immediatamente ma delicatamente il lobo escisso con la trachea rivolta verso il basso, e tamponare il lobo su un fazzoletto per rimuovere il liquido in eccesso.

Posizionare con attenzione il lobo essiccato sulla sommità dello stantuffo e tagliare qualsiasi tessuto in eccesso che si estenda oltre il bordo dello stantuffo. Abbassare lo stantuffo in modo che i lati della siringa metallica salgano e si chiudano sopra il tessuto, creando una camera con il polmone in fondo al cilindro della siringa, profonda non più di alcuni centimetri. Fissare con del nastro adesivo la parte inferiore della siringa per mantenere lo stantuffo in posizione.

Quindi versare con attenzione 40 gradi Celsius di agarosio al 2% a basso punto di fusione nella siringa, in modo che copra appena la sommità del lobo, e circondare la siringa metallica con un blocco refrigerante ghiacciato. Dopo uno o due minuti, inserire la siringa con il campione nel tagliatore automatico e allineare la lama nuova. Successivamente, riempire il serbatoio del buffer con PBS ghiacciato.

Allineare il motore passo-passo con la siringa del campione e rimuovere il nastro. Ruotare l'interruttore sulla posizione di avanzamento rapido, fino a quando il motore passo-passo tocca appena la parte posteriore del pistone. Impostare lo spessore del tessuto, la modalità di taglio singolo continuo, l'oscillazione e la velocità sul tagliacampioni.

Quindi premere start e utilizzare una spatola sottile per raccogliere ogni PCLS mentre cade nel serbatoio del buffer, posizionando le fette in pozzetti individuali di una piastra a 24 pozzetti contenente PBS freddo. Per l'acquisizione di immagini statiche dei PCLS, trasferire i campioni polmonari che contengono l'area anatomica di interesse in piatti individuali da tre centimetri contenenti un millilitro del cocktail di anticorpi appropriato di interesse. Dopo 30-60 minuti su ghiaccio con agitazione e protetti dalla luce, risciacquare le fette due volte con un millilitro di PBS freddo.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri di PBS in una nuova piastra rotonda con fondo in vetro da tre centimetri per ogni campione, e trasferire rapidamente le sezioni in ciascuna goccia, manipolando delicatamente i frammenti di tessuto in modo che si dispongano in piano. Quindi aspirare il PBS con una pipetta, e posizionare una goccia di mezzo di montaggio a temperatura ambiente sul vetrino, seguita da un'ampolla di vetro. Per acquisire l'immagine del tessuto, posizionare la piastra sul portacampioni di un microscopio confocale sotto un obiettivo 20x, e utilizzare lo strumento a tasselli per individuare e delimitare i margini del tessuto nell'impostazione di inviluppo convesso, riducendo così il tempo di scansione a tasselli.

Impostare quindi l'intervallo dello z-stack, avendo cura che gli intervalli impostati siano appropriati in diverse aree della sezione, in particolare lungo i bordi. Per l'immagine di cellule vive, dopo 30 minuti di incubazione nel cocktail di anticorpi di interesse, lavare le sezioni due volte con un millilitro di Leibovitz 10 freddo. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di Leibovitz 10 fresco in una camera di un coverglass con camere per ogni campione, seguito dal trasferimento immediato di ciascun PCLS nel mezzo, manipolando delicatamente i tessuti fino a quando non risultano distesi in piano.

Quindi utilizzare una pipetta per aspirare il mezzo da ogni camera e fissare ogni PCLS con un peso di platino. Pipettare con attenzione la matrice extracellulare appena preparata e fredda di ghiaccio su ciascun PCLS, avendo cura che il gel venga posizionato sopra le sezioni di polmone e che le sezioni non galleggino sulla superficie del gel. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, trasferire il vetrino in una camera per microscopio confocale preriscaldata, impostata a 37 gradi Celsius, sotto un obiettivo da 20x.

Quindi, impostare gli intervalli dello z-stack e dei tile in base all'intervallo desiderato tra i fotogrammi, utilizzando lo strumento tile per delimitare l'area di interesse nel tessuto e l'impostazione della griglia centrata per centrare il campione nel campo visivo. Le cellule dendritiche convenzionali CD11b positive si localizzano nel parenchima polmonare, mentre le cellule dendritiche convenzionali CD103 positive risiedono principalmente intorno alle vie aeree e nella zona sottopleurica. La colorazione doppia per CD88 e CD172a permette di distinguere i macrofagi alveolari CD172a negativi e CD88 positivi dai macrofagi interstiziali CD172a positivi e CD88 positivi, questi ultimi localizzati preferenzialmente nel parenchima e non nella zona sottiepiteliale.

La co-etichettatura per CD90.2, un noto marcatore delle cellule T, e la proteina fluorescente TdTomato, un transgene sotto il controllo trascrizionale di un fattore di trascrizione principale necessario per la linfangiogenesi, facilita l'identificazione delle strutture linfatiche nel polmone. Le cellule dendritiche convenzionali positive per CD103 si trovano in diverse aree anatomiche, inclusi l'epitelio delle vie aeree che esprime CD324, i vasi linfatici e la zona sottopleurica. Il movimento cellulare e le interazioni tra cellula e cellula possono essere registrati mediante imaging di cellule vive, come appena dimostrato.

Ad esempio, nell'esperimento rappresentativo, 16 ore dopo l'installazione orale di ova-LPS, le cellule dendritiche positive per CD103 possono essere chiaramente osservate nell'interazione con linfociti T specifici per ova trasferiti in modo adottivo nel corso di un periodo di quattro ore. Una volta acquisite, la preparazione del tessuto e le tecniche di sezionamento possono essere completate in due ore e mezza se eseguite correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di ottenere un'adeguata inflazione del polmone con agarosio e, successivamente, di mantenere le delicate fette di polmone il più possibile piatte per l'acquisizione delle immagini.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il trattamento dei PCLS con acetilcolina o metacolina, per rispondere ad ulteriori quesiti riguardo al segnale del calcio e alla contrattilità delle vie aeree in diverse condizioni patologiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare sezioni polmonari tagliate con precisione per visualizzare la localizzazione, il traffico e le interazioni delle cellule immunitarie nel polmone.