Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging a fluorescenza è monitorare i cambiamenti nel traffico proteico di membrana e nella distribuzione intracellulare. Questo metodo fornisce informazioni sui cambiamenti nel traffico proteico, come l'effetto di mutazioni genetiche o agenti farmacologici sul tasso di consegna delle vescicole e sull'espressione proteica sulla superficie cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le misure possono essere eseguite rapidamente, ad alta risoluzione, in tempo reale, senza distruggere il campione.

48 ore prima dell'imaging, le cellule di neuroblastoma 2A di topo vengono trasfettate con un costrutto plasmidico contenente SEP, un fluoroforo sensibile al pH incorporato nella regione extracellulare della proteina di interesse. Quando le cellule trasfettate sono pronte per l'imaging, con fluorescenza a riflessione interna totale o microscopia TIRF, aggiungere due millilitri di soluzione extracellulare a pH 7,4 o ECS alle cellule. Posizionare un piatto di cellule sul tavolino di traslazione e utilizzare i supporti del tavolino per fissare il piatto in posizione.

In modalità epifluorescenza, mettere a fuoco il microscopio e individuare le cellule trasfettate fluorescenti. Le celle rimarranno focalizzate su diversi piani di messa a fuoco. Individuare singole celle isolate per procedere con TIRF.

Nel programma di imaging, impostare il tempo di esposizione su 200 millisecondi e ottimizzare l'intensità della fluorescenza impostando il guadagno EM. Trasforma il raggio laser in TIRF utilizzando il motore passo-passo per traslare il raggio attraverso l'obiettivo in modo graduale. Man mano che l'angolo critico si avvicina, il raggio traslerà visibilmente attraverso il bordo della parabola fino a convergere nel punto di riflessione interna totale sul piano del campione, punto in cui il raggio non è più visibile lungo il bordo della parabola.

Verificare che le celle siano in modalità TIRF regolando la manopola di messa a fuoco. Nella TIRF, è possibile mettere a fuoco un solo piano di cellule, producendo un'immagine altamente definita con un'alta risoluzione della membrana plasmatica. Per iniziare questa procedura, individuare le singole cellule sane trasfettate nel piano di imaging.

Acquisire un'immagine focalizzata delle cellule a pH 7,4. I recettori marcati con SEP sulla membrana plasmatica e sul reticolo endoplasmatico dovrebbero essere visibili. Blocca rapidamente il raggio laser dal raggiungere il campione per evitare lo sbiancamento delle foto.

Utilizzare un software di imaging per microscopio in grado di registrare più posizioni XY per registrare le posizioni del tavolino corrispondenti a ciascuna cellula. In questo modo, è possibile acquisire immagini di 20-30 celle per piatto mentre si utilizza il software per registrare la posizione di ciascuna cella. Dopo aver raccolto tutte le immagini cellulari a pH 7,4, rimuovere manualmente il pH 7,4 ECS mediante pipettaggio senza toccare la piastra.

Aggiungere con cautela due millilitri di pH 5,4 ECS al piatto e attendere 10 minuti. Durante questo periodo, salvare le immagini acquisite in precedenza. Con lo stesso insieme di condizioni utilizzate per raccogliere immagini a pH 7,4, spostare il tavolino in ciascuna posizione salvata e acquisire un'immagine della stessa cella a pH 5,4.

Le cellule dovrebbero apparire meno definite poiché tutta la fluorescenza rilevata proviene da recettori marcati SEP confinati nel reticolo endoplasmatico. Salvare le immagini delle celle a pH 5,4. Per visualizzare le inserzioni di singole vescicole, sostituire prima il terreno di coltura delle cellule trasfettate con due millilitri di pH 7,4 ECS.

Quindi, posizionare la piastra di cellule trasfettate sul tavolino del microscopio e utilizzare i supporti per tavolino per fissare la piastra in posizione. Focalizzare una singola cella in TIRF come dimostrato in precedenza. Se in dotazione, impostare la messa a fuoco automatica in modo che la messa a fuoco non si sposti durante il periodo di imaging.

Registra una serie di 1.000 fotogrammi in modo continuo, acquisendo immagini a una frequenza fotogrammi di 200 millisecondi. Durante questo periodo saranno visibili esplosioni di fluorescenza, corrispondenti a vescicole a basso traffico di pH che si fondono con la membrana plasmatica, esponendo il SEP al pH extracellulare 7,4. Per iniziare l'analisi della fluorescenza SEP per determinare la localizzazione subcellulare, aprire le immagini cellulari utilizzando un software di analisi delle immagini come ImageJ.

Sottrarre lo sfondo dalle immagini a pH 5,4 e pH 7,4 utilizzando l'impostazione della palla rotante. Utilizzando la soglia basata sull'intensità per quantificare la fluorescenza da una singola cella a pH 7,4, selezionare prima l'immagine, regolare e la soglia. Quindi seleziona manualmente una regione di interesse intorno alla cella.

Utilizzando la funzione di misurazione integrata nella scheda Analizza, misurare l'area della cella, l'intensità media e la densità integrata. Ripetere queste misurazioni per la stessa cella a pH 5,4. Dopo aver ottenuto la densità integrata per le immagini cellulari a pH 7,4 e 5,4, calcolare la densità integrata nella membrana plasmatica sottraendo il valore di pH 5,4 dal valore di pH 7,4.

La differenza corrisponde al numero relativo di recettori sulla membrana plasmatica all'interno della regione di eccitazione TIRF. Come misura del traffico, calcolare la percentuale relativa di recettori marcati con SEP situati sulla membrana plasmatica rispetto ai restanti recettori visibili nel volume di eccitazione TIRF dividendo la densità integrata nella membrana plasmatica per la densità integrata totale a pH 7,4, moltiplicata per 100. Per analizzare gli eventi di inserimento di una singola vescicola, aprire la serie di 1.000 immagini TIFF utilizzando il software di analisi delle immagini.

Sottrarre lo sfondo da tutti i fotogrammi utilizzando l'impostazione della palla rotante. Regola il bilanciamento del colore della registrazione per massimizzare le regioni intense corrispondenti agli eventi di inserimento delle vescicole. Conta manualmente le raffiche di fluorescenza che durano più di tre fotogrammi o 600 millisecondi.

Questo esempio di immagine cellulare a pH 7,4 mostra i recettori situati sulla membrana plasmatica e sul reticolo endoplasmatico. A pH 5,4, i recettori sulla membrana plasmatica non emettono fluorescenza, quindi sono visibili solo i recettori residenti nel reticolo endoplasmatico. La differenza tra la densità integrata della fluorescenza a pH 7,4 e pH 5,4 corrisponde ai recettori localizzati sulla membrana plasmatica.

Gli eventi di inserzione di una singola vescicola vengono visualizzati a pH 7,4 come un'esplosione di fluorescenza sulla membrana plasmatica, della durata di almeno 600 millisecondi. Immediatamente prima di un inserimento, non è presente alcuna esplosione distinguibile. Un aumento dell'intensità della fluorescenza si osserva quando arriva una vescicola di trasporto che trasporta SEP.

I recettori marcati con SEP si diffondono quindi attraverso la membrana plasmatica fino a renderli indistinguibili dai recettori precedentemente inseriti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti per piatto, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare i cambiamenti nella distribuzione delle proteine tra il reticolo endoplasmatico periferico e la membrana plasmatica.