Name: Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Impara a monitorare il traffico e la localizzazione subcellulare delle proteine di membrana utilizzando recettori pHluorin-tag e microscopia TIRF in cellule neuroblastoma di topo. Questo metodo offre imaging ad alta risoluzione in tempo reale.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, dal National Institute on Drug Abuse DA 038817 e dal National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. Colture cellulari e trasfezione <ol><li> Mantenere il mouse neuroblastoma 2 bis (N2a), le cellule in terreni di coltura. <ol><li> Fare 500 ml N2a terreni di coltura da 200 ml di mezzo Aquila Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, 250 ml ridotti mezzi siero, 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml di penicillina / streptomicina (100x). </li><li> Mantenere le cellule in un pallone T75 a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Dividi celle 1:15 quando necessario, o circa il 80-90% di confluenza. Questo è tipicamente 2-3 volte a settimana. </li></ol></li><li> Coat 35 millimetri di vetro piatto fondo con poli-D-lisina. <ol><li> In un armadio biosicurezza flusso laminare, aggiungere 200 ml di 0,1 mg / ml di poli-D-lisina su vetro regione inferiore sterile piastra da 35 mm. </li><li> Mettere in un piatto di 37 ° C incubatore per 1 ora. </li><li> Lavare accuratamente piatto con DDH 2 O 3-4 volte. </li><li> Lasciare piatti a completamente a secco per più di 1 ora. </li><li> Sterilize piatti che utilizzano la luce UV nell&#39;armadio biosicurezza, se necessario. </li></ol></li><li> Piastra cellule N2a per l&#39;imaging TIRFM. <ol><li> Rimuovere i supporti crescita da cellule aderenti. </li><li> Staccare cellule dal matraccio incubando con 1 ml 1x tripsina (+ EDTA) per 5 min a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Inattivare tripsina con l&#39;aggiunta di 9 ml di terreni di crescita. Media mix, tripsina, e le cellule distaccate con una pipetta. </li><li> Visivamente contare cellule utilizzando un emocitometro e calcolare il volume corretto per aggiungere 90.000 cellule per ogni vetro rivestito piatto fondo poli-D-lisina. Questa densità è necessario per trasfezione efficiente e di imaging singola TIRF cellulare. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreni di crescita per ogni piatto fondo di vetro contenente 90.000 cellule. </li><li> Incubare il piatto a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 16-24 ore. </li></ol></li><li> N2a trasfezione <ol><li> Ottenere un costrutto plasmide contenente un fluoroforo settembre incorporatonella regione extracellulare della proteina di interesse. Tecniche di clonazione standard come amplificazione PCR 5 possono essere usate per generare il costrutto. NOTA: Sep dovrebbe essere incorporato nella regione extracellulare della proteina di membrana in modo che risiede all&#39;interno del lume del reticolo endoplasmatico o traffico vescicole ed è esposto a soluzione extracellulare quando sulla membrana plasmatica. Settembre è simile per dimensioni a GFP e strategie di clonaggio simili possono essere utilizzati. </li><li> Sostituire i mezzi di crescita su cellule placcato con 1,5 ml ridotta supporti siero (es Opti-MEM), circa 30 minuti prima dell&#39;aggiunta del reagente di trasfezione. NOTA: al farmaco in studio indotto cambiamenti nella recettori, un&#39;adeguata concentrazione di farmaco può essere aggiunto al momento della trasfezione. </li><li> Aggiungere 500 ng di ogni plasmide desiderato costruire a 250 microlitri ridotto supporto siero (tubo 1). </li><li> Aggiungere 2 ml di reagente di trasfezione ad un tubo separato containing 250 ml di mezzi siero ridotto. Incubare tubo 2 a temperatura ambiente per 5 min. Il rapporto di reagente di trasfezione di DNA plasmidico deve essere ottimizzata per esprimere ciascuna proteina di interesse. </li><li> Combinare provette 1 e 2 per ottenere una soluzione contenente 500 ml di trasfezione reagente e mix plasmide. Incubare a temperatura ambiente per 25 min. </li><li> Aggiungere i 500 microlitri miscela trasfezione le cellule pre-plated per un volume totale di 2 ml per piatto. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 24 ore. </li><li> Dopo 24 ore, rimuovere il mix trasfezione e lavare le cellule con mezzi di crescita e quindi aggiungere 2 ml di terreni di crescita per ogni piatto. NOTA: Se un farmaco è stato aggiunto al momento della transfezione, esso può essere riempito di nuovo in questa fase. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 24 ore. </li><li> celle di immagine 48 ore dopo la trasfezione. </li></ol></li></ol> 2. Imaging cellulare dal vivo da Total InTernal Riflessione microscopia a fluorescenza (TIRFM) <ol><li> Imaging istituito <ol><li> Eseguire l&#39;imaging con un microscopio a fluorescenza set-up invertito con una fase di scansione, come mostrato in Figura 1. Ciò richiede l&#39;allineamento di una sorgente laser DPSS 488 nm, un motore passo-passo per regolare 488 la posizione del fascio nm, e un&#39;alta apertura numerica (NA 1.49) 60X o 100X obiettivo ad immersione. </li><li> Far passare il raggio laser attraverso il filtro di eccitazione appropriata (banda passante 488/10 nm). Allineare il fascio laser polarizzato attraverso una singola fibra modalità collegata ad un lanciatore montato un motore passo-passo. In modalità epifluorescenza, il fascio di eccitazione è centrato nel mezzo dell&#39;apertura posteriore dell&#39;obiettivo. </li><li> Per raggiungere TIRF, utilizzare il motore passo-passo per tradurre il fascio laser focalizzato attraverso l&#39;apertura posteriore della lente obiettivo fino a raggiungere l&#39;angolo critico e del fascio non viene trasmessa attraverso il campione e viene invece totalmente riflessa vetro-cell interfaccia. </li><li> Catturare immagini utilizzando un EMCCD (512 x 512 pixel), controllata con software di imaging (ad es Metamorph) con il filtro di emissione appropriata montati nel percorso di emissione (525/50 nm). </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di imaging <ol><li> Preparare 200 ml di soluzione extracellulare (ECS) mescolando 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES e 10 mM di glucosio in DDH 2 O. soluzioni fotografici di NaCl, KCl, MgCl 2, e CaCl 2 può essere preparato in anticipo e combinato con HEPES freschi e glucosio nel giorno di imaging. </li><li> Regolare il pH di una soluzione contenente 100 ml ECS a pH 7,4. Regolare le restanti 100 ml di ECS ad un pH di 5,4. Lavare le cellule trasfettate con 2 ml di ECS (pH 7,4). </li><li> Aggiungere 2 ml di ECS (pH 7.4) alle cellule trasfettate prima di imaging. </li></ol></li><li> L&#39;imaging cellulare Live in TIRF <ol><li> Accendere l&#39;intero sistema, sapg 488 nm laser, macchina fotografica, fase di traduzione, e il programma di imaging. Mettere a fuoco il fascio epifluorescenza e regolare la potenza di circa 1 MW presso l&#39;obiettivo 60X. </li><li> Aggiungere l&#39;olio con l&#39;obiettivo e mettere un piatto di cellule trasfettate sulla fase di traduzione. Fissare il piatto in posizione con supporti di scena per assicurarsi che non si muove rispetto alla fase in modo che le cellule possono essere ripreso più volte. </li><li> In modalità epifluorescenza, mettere a fuoco il microscopio e individuare le fluorescenti, cellule transfettate. Le cellule rimangono concentrati in diversi piani di messa a fuoco. Individuare singole cellule isolate, per procedere con TIRF. </li><li> Nel programma di imaging, impostare il tempo di esposizione a 200 msec e ottimizzare l&#39;intensità di fluorescenza impostando il guadagno EM. </li><li> Transizione il fascio laser in TIRF traducendo il fascio attraverso l&#39;obiettivo in modo graduale utilizzando il motore passo-passo. All&#39;avvicinarsi angolo critico, il fascio visibilmente tradurre attraverso il bordo del piatto fino converge a The punto di riflessione interna totale sul piano del campione. </li><li> Verificare che le cellule sono in modalità TIRF regolando la manopola di messa a fuoco. In TIRF, solo piano di cellule può essere focalizzata (cioè circa 150 nm dall&#39;interfaccia vetro), producendo un&#39;immagine molto definita con alta risoluzione della membrana plasmatica. </li></ol></li><li> Imaging settembre per determinare la localizzazione subcellulare <ol><li> Individuare sani, trasfettate, singole cellule nel piano di imaging. </li><li> Acquisire una immagine focalizzata di cella a pH 7,4. Settembre etichettato recettori sulla membrana plasmatica e reticolo endoplasmatico dovrebbe essere visibile. </li><li> bloccare rapidamente il fascio laser di raggiungere il campione per evitare photobleaching. </li><li> Memorizzare le posizioni di scena corrispondenti a ciascuna cella utilizzando software di imaging microscopio in grado di registrare più posizioni xy. </li><li> Ripetere i passaggi 2.4.1-2.4.4 per 20-30 cellule per piatto, mentre utilizzando il software per registrare la posizione di ogni cella. </li><li> After tutte le immagini delle cellule a pH 7.4 sono raccolti, rimuovere manualmente la soluzione a pH 7.4 ECS con una pipetta. Non toccare il piatto come questo potrebbe spostare le posizioni di scena memorizzati. </li><li> Aggiungere con cautela 2 ml di pH 5.4 ECS al piatto e attendere 10 min. Durante questo tempo, salvo immagini precedentemente acquisite. </li><li> Sotto la serie identiche di condizioni utilizzate per raccogliere immagini a pH 7.4, spostare il palco per ciascuna posizione salvata e acquisire un&#39;immagine della stessa cella a pH 5.4. Le cellule dovrebbero guardare meno definiti dal momento che tutti fluorescenza rilevata è originario dal reticolo endoplasmatico confinato settembre etichettato recettori. Salvare le immagini delle cellule pH 5.4. </li></ol></li><li> Imaging singoli eventi di inserimento delle vescicole in cellule vive <ol><li> Sostituire mezzi di crescita delle cellule trasfettate con 2 ml pH 7,4 ECS, o con Leibovitz L-15 media. Il pH del Leibovitz L-15 media è CO 2 indipendenti, permettendo di imaging avvenire per un lungo periodo di tempo se necessario. </li><li> Placvia e il piatto di cellule transfettate sul palco del microscopio. Fissare e mettere a fuoco una singola cella in TIRF seguente precedente punto 2.3. </li><li> Se presente, impostare la messa a fuoco automatica in modo che la messa a fuoco non deriva durante il periodo di imaging. </li><li> Registrare una serie di 1.000 fotogrammi, catturando continuamente le immagini ad un frame rate di 200 msec. Sequenze di fluorescenza saranno visibili in questo periodo, corrispondente a vescicole basso traffico pH fondersi con la membrana plasmatica, esponendo SEP al pH extracellulare 7.4. </li><li> Individuare un&#39;altra singola cellula e ripetere il passo precedente. Ripristinare autofocus, se necessario. </li></ol></li></ol> 3. Immagine analisi ed elaborazione dei dati <ol><li> Analizzando settembre fluorescenza per determinare localizzazione subcellulare <ol><li> Aprire le immagini delle celle utilizzando un software di analisi delle immagini, come Metamorph o ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Sottrarre il fondo sia dal pH 5,4 e pH 7,4 immagini utilizzando l&#39;impostazione rotolamento della sfera.</li><li> Utilizzare una soglia basato intensità di quantificare la fluorescenza da una singola cellula. selezionare manualmente una regione di interesse attorno alla cella nell&#39;immagine del pH 7,4. </li><li> Misurare l&#39;area delle cellule, intensità media, e la densità integrata utilizzando un plugin di ImageJ o utilizzando la funzione integrata &quot;Misura&quot; nella scheda Analizza. </li><li> Ripetere passaggi 3.1.1-3.1.3 per la stessa cella a pH 5,4, adeguando la soglia basato intensità e regione di interesse nello stesso modo. </li><li> Dopo la densità integrato è ottenuto per immagini cellulari sia a pH 7.4 e 5.4, calcolare la membrana plasmatica densità integrato sottraendo il valore pH 5.4 dal 7.4 pH. La differenza corrisponde ai recettori numero relativo sulla membrana plasmatica all&#39;interno della regione TIRF eccitazione. </li><li> Come misura di traffico, calcolare la percentuale relativa di settembre etichettato recettori situati sulla membrana plasmatica rispetto ai restanti recettori visibili nelle excitati TIRFsul volume dividendo la membrana plasmatica della densità integrata dalla densità totale integrato a pH 7.4, moltiplicato per 100. </li></ol></li><li> Analizzando gli eventi di inserimento singolo vescicole <ol><li> Aprire la serie di 1.000 immagini TIFF utilizzando il software di analisi delle immagini. Sottrarre il fondo da tutti i fotogrammi con l&#39;impostazione rotolamento della sfera. </li><li> Regolare il bilanciamento del colore della registrazione per massimizzare le regioni intensi corrispondenti alle vescicole eventi di inserimento. contare manualmente le raffiche di fluorescenza che durano più di 3 fotogrammi (&gt; 600 msec). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

La sensibilità pH SEP consente recettori residenti sulla membrana plasmatica di distinguerli dai recettori intracellulari nel reticolo endoplasmatico, e può essere utilizzato per risolvere gli eventi di inserimento del recettore porta-vescicole 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Diverse tecniche tra ...

Le variazioni di espressione dei recettori, la distribuzione, e l&#39;assemblaggio sono stati collegati a una vasta gamma di malattie, tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la fibrosi cistica, e la tossicodipendenza 1, 2, 3, 4, 5. Ad esempio, la nicotina e altri ligandi nicotinici influenzano il traffico di recettori nicotinici (nAChR) che portano a cambiamenti di traffico, di espressione, e upregulation 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. La nicotina aumenta il numero totale di nAChR assemblate all&#39;interno di una cella, aumenta il traffico verso la membrana plasmatica, und altera l&#39;assemblaggio di subunità per favorire una versione ad alta sensibilità di alcuni sottotipi. Risolvere i cambiamenti distinti nel traffico, il montaggio, e l&#39;espressione dei recettori in un modello di malattia fornisce dettagli cruciali meccanicistici che sono essenziali per definire bersagli farmacologici. Un approccio ideale sarebbe rapidamente distinguere tra recettori intracellulari e quelli localizzati sulla membrana plasmatica. Ciò è particolarmente impegnativo nei casi in cui una maggioranza di una particolare proteina intracellulare risiede, come ad esempio con nAChR. Dal momento che la maggior parte dei nAChR sono localizzate al reticolo endoplasmatico, le misure tradizionali non hanno la risoluzione spazio-temporale necessario per individuare la localizzazione e il traffico di modifiche lungo la via secretoria. Traffico di recettore e di espressione studi di nAChR sono stati principalmente condotti utilizzando radioligand vincolanti 11, saggi biotinylation 12, western blotting 13, o immunoprecipitazione techniq<html> UES 12. Questi dipendono dalla specificità di legame di una molecola giornalista o fissazione di cellule e non hanno la capacità di distinguere tra simultaneamente residente membrana plasmatica e recettori intracellulari. Pertanto, gli studi di dinamica di montaggio canale ionico e vescicole hanno in gran parte affidamento su basso-throughput tecniche elettrofisiologiche 14. risoluzione spaziale e temporale superiore è possibile con i progressi nella microscopia a fluorescenza. Molecole giornalista geneticamente codificate, come la proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti, eliminare i problemi di legame non specifico e aumentano la sensibilità 15. Una variante sensibile pH di GFP, noto come superecliptic pHluorin (SEP), può essere utilizzata per sfruttare differenze di pH intrinseche tra compartimenti all&#39;interno di una cella per determinare la localizzazione 5, 7, 8,ref &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. settembre fluorescente quando il pH è superiore a 6, ma rimane in uno stato off a pH inferiore. Pertanto, i recettori contrassegnate con SEP loro lato luminale vengono rilevati quando presente nel reticolo endoplasmatico ( ER) o dopo l&#39;inserimento nella membrana plasmatica (PM), ma non quando confinato in una vescicola traffico. manipolazione del pH extracellulare in contatto con recettori sulla membrana plasmatica altera conseguentemente la fluorescenza e quindi il rilevamento di questi recettori. Se la stessa cella viene sequenzialmente ripreso sia a pH extracellulare neutro e poi un pH inferiore a 6, la differenza tra le immagini è attribuita a recettori situati sulla membrana plasmatica. Questo consente la misurazione simultanea di intracellulare (ER periferica) e recettori membrana plasmatica residenti 5, 7, 8 </sup&gt;, 9. eventi di inserimento vescicole singolo possono essere risolti quando il pH extracellulare è neutrale. Una volta che un basso vescicole traffico pH fonde con la membrana plasmatica, lato luminale della vescicola è esposta alla soluzione extracellulare neutra, causando una transizione rilevata come una raffica di fluorescenza 7, 18, 19, 20. Settembre permette di misurare recettori localizzati alla membrana plasmatica e periferico reticolo endoplasmatico, e fornisce un mezzo per misurare il traffico di recettori tra queste regioni subcellulari 5, 7, 18. Per ottenere una risoluzione più alta a livello della membrana plasmatica, un recettore con la SEP geneticamente codificato viene ripreso al microscopio a riflessione interna totale fioritura (TIRFM). Questo metodo è particolarmenteutile se la maggior parte dei recettori sono localizzati a regioni intracellulari, poiché TIRFM aumenta la visibilità della membrana plasmatica. TIRFM consente anche la risoluzione della dinamica di traffico dei singoli vescicole che trasportano i recettori SEP-etichettati su inserimento nel PM. Riflessione totale avviene all&#39;interfaccia tra materiali con differenti indici di rifrazione, come tra una cella e un vetro di copertura antiscivolo 21, 22. Settembre fluorescente quando irradiato con 488 nm di eccitazione, che è orientata per ottenere la riflessione interna totale all&#39;interfaccia della soluzione vetro e cellule. Questo produce un&#39;onda evanescente che penetra circa 150 nm nel campione, solo fluorofori emozionanti all&#39;interno di questo volume. Solo Settembre contenente recettori in un ambiente pH neutro in questo intervallo di eccitazione vengono rilevati, corrispondenti a quelli residenti sulla membrana plasmatica o periferica reticolo endoplasmatico. Dal momento che il rilevamento è limitata to di eccitazione dal onda evanescente, fluorescenza di fondo della regione intracellulare è ridotto e il rapporto segnale-rumore viene aumentato 21, 22. Inoltre, poiché la radiazione non penetra la massa della cella, photodamage è minimizzato che permette l&#39;imaging cellulare dal vivo nel corso del tempo. Come risultato, TIRFM accoppiato con geneticamente codificato settembre fornisce l&#39;alta risoluzione e la sensibilità richiesta per misurare subcellulari localizzazione e traffico dinamiche di recettori di membrana lungo la via secretoria.

<table><tbody><tr><td>Reagent/Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per colture cellulari con tappo filtrante, sterili, Greiner Bio One, 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri con fondo in vetro da 35 mm, sterili</td><td>Cell E& G</td><td>GBD00002-200</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>vwr</td><td>215017510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium&lrm; (DMEM), Fisher Scientific ad alto contenuto di glucosio</td><td></td><td>11-965-084&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero Ridotto Medium</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino, Certificato, Origine USA, Standard (Filtrato Sterile)&nbsp;</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x), senza rosso fenolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td></td></tr><tr><td>Terreno L-15 di Leibovitz, senza rosso fenolo</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina</td> opzionale <td>Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td>Mescolare delicatamente; Non vorticare</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione per obiettivi&nbsp;</td><td>Tipo Olympus</td><td>F</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Fotocamera Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo a immersione in olio 60X, 1.49 NA</td><td>Olympus</td><td>APON 60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Stadio motorizzato</td><td>Prior</td><td>IXPROXY</td><td></td></tr><tr><td>Attuatore motorizzato (motore passo-passo)</td><td>Thorlabs</td><td>ZST213</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph (o altro programma di imaging)</td><td>Laser Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm</td><td>Market Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibra</td> <td>monomodaleThorlabs</td><td>SM450</td><td></td></tr><tr><td>Specchi</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E01</td><td></td></tr><tr><td>Dicroico 488 nm LP</td><td>Semrock</td><td>Di02-R488-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda, 488 nm</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda, 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando recettori phluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

La comprensione traffico di membrana di proteine, il montaggio, e l&#39;espressione richiede un approccio che distingue tra coloro che risiedono in organelli intracellulari e quelli localizzati sulla membrana plasmatica. misure tradizionali a base di fluorescenza non hanno la capacità di distinguere le proteine ​​di membrana che risiedono in diversi organelli. Taglio metodologie all&#39;avanguardia trascendono i metodi tradizionali di accoppiamento fluorofori pH-sensibile con microscopia a riflessione interna totale in fluorescenza (TIRFM). TIRF illuminazione eccita il campione fino a circa 150 nm dall&#39;interfaccia di vetro-campione, riducendo così bassa, aumentando il rapporto segnale rumore e migliorando risoluzione. Il volume di eccitazione in TIRFM comprende la membrana plasmatica e organelli vicine, come il pronto soccorso periferico. Superecliptic pHluorin (SEP) è una versione sensibile pH di GFP. Geneticamente codifica settembre nel dominio extracellulare di una proteina di membrana di interesse posiziona il fluoroforo sulato luminale del ER e nella regione extracellulare della cella. SEP fluorescente quando il pH è superiore a 6, ma rimane in uno stato off a valori di pH inferiori. Pertanto, i recettori etichettati con settembre fluorescenza quando risiedono nel reticolo endoplasmatico (ER) o dopo l&#39;inserimento nella membrana plasmatica (PM), ma non quando si trova ad una vescicola tratta o altri organelli, come il Golgi. Il pH extracellulare può essere regolata a dettare la fluorescenza dei recettori sulla membrana plasmatica. La differenza di fluorescenza tra le immagini TIRF a pH neutro e extracellulare acido per la stessa cella corrisponde a un numero relativo di recettori presenti sulla membrana plasmatica. Questo permette la misurazione simultanea di recettori intracellulari residenti e membrana plasmatica. eventi di inserimento vescicole singolo può anche essere misurato quando il pH extracellulare è neutro, corrispondente ad un basso vescicole traffico pH fusione con la membrana plasmatica e la transizione in uno stato fluorescente. Questo Versatile tecnica può essere sfruttata per studiare la localizzazione, espressione, e il traffico di proteine ​​di membrana.

Settembre incorporazione in un recettore consente la rilevazione diretta di tale recettore in una cellula vivo. Accoppiato con TIRFM, questo permette la valutazione dei livelli di espressione relativi sulla membrana plasmatica e la distribuzione dei recettori all&#39;interno delle sedi subcellulari nella regione di TIRF eccitazione. singoli eventi di traffico delle vescicole possono essere risolti. Livelli di espressione relativa...

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging a fluorescenza è monitorare i cambiamenti nel traffico delle proteine di membrana e nella loro distribuzione intracellulare. Questo metodo fornisce informazioni sui cambiamenti nel traffico proteico, come l'effetto di mutazioni genetiche o di agenti farmacologici sulla velocità di consegna delle vescicole e sull'espressione proteica sulla superficie cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le misurazioni possono essere eseguite rapidamente, con alta risoluzione, in tempo reale e senza distruggere il campione.48 ore prima dell'acquisizione delle immagini, le cellule di neuroblastoma murino 2A vengono trasfettate con un costrutto plasmidico contenente SEP, un fluoroforo sensibile al pH inserito nella regione extracellulare della proteina di interesse. Quando le cellule trasfettate sono pronte per l'acquisizione delle immagini mediante microscopia a fluorescenza con riflessione totale interna o microscopia TIRF, aggiungere due millilitri di soluzione extracellulare (ECS) a pH 7,4 alle cellule. Posizionare una piastra di cellule sullo stadio di traslazione e utilizzare i supporti dello stadio per fissare saldamente la p

utilizing-phluorin-tagged-receptors-to-monitor-subcellular

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Biology

Biologia

Questo rapporto descrive l'uso di imaging cellulare dal vivo e le tecniche di fotosbiancante per determinare l'espressione di superficie, vie di trasporto e la cinetica di traffico esogeno espresso, sensibile al pH GFP-tagged proteine ​​a livello della membrana plasmatica dei neuroni.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Etichettando i domini extracellulari dei recettori di membrana con pHluorin superecliptic, e da imaging questi recettori di fusione in neuroni di topo in coltura, si può visualizzare direttamente i singoli eventi di inserzione vescicolari dei recettori della membrana plasmatica. Questa tecnica sarà determinante per chiarire i meccanismi molecolari che regolano l'inserimento recettore alla membrana plasmatica.

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

Descriviamo qui l'uso di una variante di proteina fluorescente verde sensibile al pH, la pHluorina, per studiare la dinamica spazio-temporale dei recettori di guida dell'assone che trafficano sulla superficie cellulare. Il recettore taggato con pHluorina è espresso sia in coltura cellulare che in vivo, utilizzandol'elettroporazione dell'embrione del pulcino.

Uso di pHluorin per valutare la dinamica dei recettori di guida axon nella coltura cellulare e nell'embrione del pulcino

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma, utilizzando un costrutto di sinaptobrevina2-pHluorin e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Viene inoltre riportata la strategia sviluppata per l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Traffico Receptor modula la segnalazione e la cellula di risposta ai ligandi ed è, a sua volta, sensibile alle condizioni di cellulari, tra cui la segnalazione ligando-indotta. Qui, descriviamo una tecnica potente e flessibile per la valutazione quantitativa farmaco-indotta traffico recettoriale utilizzando immunomarcatura e analisi colocalizational.

Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational

La quantificazione accurata degli eventi di traffico vescicolare spesso fornisce informazioni chiave sui ruoli di specifiche proteine e sugli effetti delle mutazioni. Questo articolo presenta metodi per l'utilizzo della pHluorina supereclittica, una variante della GFP sensibile al pH, come strumento per la quantificazione degli eventi endocitici nelle cellule viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e la citometria a flusso.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Qui vi presentiamo un protocollo per celle di immagine che esprimono fluorescenti tipo angiotensina recettori 1a proteina-tag verde durante endocitosi avviate dal trattamento angiotensina II. Questa tecnica comprende lisosomi etichettatura con un secondo marcatore fluorescente, e quindi utilizzando software per analizzare la co-localizzazione di recettori e lisosomi in tre dimensioni nel tempo.

Imaging cellulare dal vivo e analisi 3D del recettore dell&#39;angiotensina di tipo 1a tratta degli transfettati embrionali umane cellule renali Utilizzando Microscopia confocale

Qui, vengono descritti metodi non invasivi per la localizzazione delle proteine di membrana dei fotorecettori e la valutazione della degenerazione retinica nell'occhio composto Drosophila utilizzando la fluorescenza eGFP.

Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine con tag eGFP

Impara a monitorare il traffico e la localizzazione subcellulare delle proteine di membrana utilizzando recettori pHluorin-tag e microscopia TIRF in cellule neuroblastoma di topo. Questo metodo offre imaging ad alta risoluzione in tempo reale.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

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