Profilatura delle espressioni con Microarray

I microarray di DNA sono strumenti ampiamente utilizzati per misurare contemporaneamente l'espressione di molti geni diversi. Sono costituiti da migliaia di sonde, ognuna delle quali rappresenta un gene diverso, immobilizzate su "chip" o vetrini e si basano su ibridazioni complementari per valutare l'espressione genica in diverse condizioni biologiche.

Questo video coprirà i principi di base della tecnologia dei microarray, un protocollo per la profilazione dell'espressione genica utilizzando microarray e alcune applicazioni attuali.

Iniziamo discutendo i principi del profilo di espressione genica e della tecnologia dei microarray.

Uno dei primi metodi sviluppati per valutare l'espressione genica nei campioni biologici è il Northern blotting, che comporta il "sondaggio" per specifiche molecole di RNA immobilizzate sulle membrane. Le sonde "a flottante" riconoscono sequenze di RNA complementari nel campione e sono tipicamente etichettate con molecole radioattive o fluorescenti in modo che possano essere visualizzate.

I progressi nella microfabbricazione, nel sequenziamento del genoma e in altre tecnologie hanno portato allo sviluppo del biochip microarray. Come i Northern blots, i microarray si basano sul principio del legame complementare tra la sonda e le sequenze di acidi nucleici del campione. A differenza dei Nordici, tuttavia, nei microarray sono le sonde oligonucleotidiche che vengono immobilizzate su un vetrino o un chip. I campioni "fluttuanti" sono generati da RNA isolato da cellule o organismi di interesse, che viene trascritto inversamente in DNA complementare o "c". Questo può essere etichettato direttamente con molecole fluorescenti, oppure le loro quantità possono essere ulteriormente amplificate dalla trascrizione in vitro in cRNA. Il campione viene quindi ibridato al chip. Poiché le sonde su microarray progettati per diverse applicazioni possono essere "sense", il che significa che le loro sequenze sono nella stessa direzione dell'RNA espresso di un organismo, o "antisenso", i ricercatori devono garantire che la direzionalità del filamento del campione sia complementare a quella delle sonde.

I dati "grezzi" sull'intensità della fluorescenza per ogni punto specifico del gene sul chip possono quindi essere quantificati ed elaborati. I dati possono essere sottoposti a ulteriori test statistici, come il test t dello studente, per determinare se i segnali di fluorescenza – e quindi i livelli di espressione – per un gene di interesse sono significativamente diversi tra due tipi di cellule o condizioni sperimentali.

I ricercatori possono anche utilizzare questi dati per "raggruppare" o raggruppare geni basati su modelli di espressione simili. Ad esempio, quando si confrontano i modelli di espressione tra due popolazioni cellulari, alcuni geni possono essere trovati per dimostrare i cambiamenti di espressione di quantità approssimativamente equivalenti nella stessa direzione, e quindi sarebbero raggruppati insieme. I ricercatori possono rappresentare queste relazioni in un tipo di diagramma ad albero o "dendrogramma" in cui altezze e disposizioni di "rami" indicano quanto siano simili o dissimili i modelli di espressione genica. Questo tipo di analisi può fornire informazioni sulle reti geniche, poiché i geni "raggruppati" possono partecipare agli stessi percorsi biologici.

Ora che abbiamo discusso i principi della metodologia dei microarray, diamo un'occhiata a un tipico esperimento di microarray.

Per garantire la qualità dell'RNA isolato, gli spazi di lavoro e le apparecchiature devono essere trattati con sostanze chimiche che inattivano le RNasi, enzimi che altrimenti distruggerebbero l'RNA. L'RNA viene quindi isolato da campioni di interesse e purificato, e la sua concentrazione e integrità sono determinate attraverso la spettrofotometria.

Questo RNA campione viene convertito in cDNA e quindi in cRNA. Successivamente, il campione viene etichettato con molecole fluorescenti e frammentato, e la sua qualità e quantità possono essere nuovamente controllate, momento in cui è possibile valutare anche l'estensione dell'etichettatura fluorescente.

Il cRNA etichettato viene quindi miscelato con una "soluzione di ibridazione" prima di caricarsi su un microarray. Per facilitare l'ibridazione di successo, un "mixer" viene posizionato sul chip per formare "camere di ibridazione". Il mix di ibridazione viene quindi aggiunto lentamente all'array. Bisogna fare attenzione per evitare bolle d'aria, in quanto queste possono interferire con il legame del campione a regioni specifiche sul microarray e provocare un segnale falso negativo. Una volta aggiunto il campione, i chip vengono incubati alla temperatura appropriata per un massimo di 24 ore.

Dopo l'ibridazione, il mixer viene rimosso dal chip, il campione non legato viene lavato via e l'array viene accuratamente asciugato mediante centrifugazione in una centrifuga specializzata che tiene il vetrino. Il chip essiccato viene inserito in uno scanner microarray e la macchina viene regolata in modo che i segnali più luminosi osservati su un chip non siano eccessivamente saturi. Il microarray viene quindi scansionato e viene prodotta un'immagine dell'intero chip.

Una volta che il chip è stato scansionato, il file immagine viene caricato nel software di estrazione dei dati e valutato per eventuali irregolarità del segnale. I dati estratti dall'immagine del microarray sono sottoposti a una serie di manipolazioni statistiche, tra cui la trasformazione del log_2, che consente ai ricercatori di rappresentare numericamente i dati in termini di aumenti o diminuzioni di piega nell'espressione genica; così come la normalizzazione, che tiene conto delle differenze di segnale tra i chip microarray. Questi dati elaborati possono quindi essere ulteriormente analizzati.

Ora che abbiamo dimostrato come viene eseguito il profilo di espressione con i microarray, diamo un'occhiata a come i microarray possono essere utilizzati in esperimenti specifici.

I ricercatori spesso impiegano microarray per valutare come l'espressione genica cambia durante un processo biologico, come la differenziazione cellulare. Qui, gli scienziati hanno valutato i livelli di microRNA, che sono piccoli RNA a 22 nucleotidi coinvolti nella messa a punto dell'espressione genica, in tre tipi di cellule umane che rappresentano diversi stadi di sviluppo della retina. Confrontando l'espressione di microRNA tra queste cellule, i ricercatori sono stati in grado di identificare i geni potenzialmente coinvolti nella differenziazione e nello sviluppo del tessuto retinico.

I microarray possono anche essere utilizzati per valutare le differenze di espressione tra diverse cellule o tipi di tessuto. In questo esperimento, un modello di roditore di disturbo da stress post-traumatico, o PTSD, è stato stabilito esponendo i ratti a scosse elettriche. I neuroni sono stati raccolti da diverse regioni del cervello e l'RNA è stato isolato. I microarray sono stati quindi utilizzati per identificare l'espressione differenziale dei geni associati ai mitocondri in questi neuroni, fornendo informazioni sui complessi meccanismi molecolari alla base del PTSD.

Infine, i ricercatori stanno anche applicando microarray agli studi sul cancro, nella speranza che possano essere identificati nuovi biomarcatori di malattia. Come risultato di infezioni da virus durante la nostra evoluzione, i genomi umani contengono sequenze genetiche virali denominate "retrovirus endogeni" o ERV, alcuni dei quali sono ancora attivamente espressi. Qui, l'espressione di ERV nei tessuti prostatici cancerosi e normali è stata confrontata utilizzando microarray. Questo metodo ha permesso ai ricercatori di individuare diversi ERV che sono stati sovraregolati nel cancro alla prostata, rendendoli potenziali biomarcatori che possono essere utilizzati per diagnosticare la malattia.

Hai appena visto il video di JoVE sul profilo di espressione genica usando microarray. Questo video ha trattato i principi di base della tecnologia microarray, un protocollo per la profilazione delle espressioni e le applicazioni di questa tecnica. Come sempre, grazie per aver guardato!