Question 1

Cos'è l'RNA-seq e in che modo differisce dai microarray?

Accepted Answer

RNA-seq è una tecnica di sequenziamento ad alto rendimento che misura la sequenza e la quantità di tutto l'RNA espresso in una popolazione cellulare, chiamato trascrittoma. A differenza dei microarray, che ricercano sequenze di RNA note, RNA-seq può profilare espressione genica da organismi con genomi non sequenziati e misurare accuratamente una gamma più ampia di livelli di espressione dei trascritt, specialmente a livelli molto bassi o molto alti.

Question 2

Perché l'rRNA viene rimosso prima della preparazione della libreria RNA-seq?

Accepted Answer

La maggior parte dell'RNA nelle cellule è RNA ribosomiale (rRNA), che è il componente centrale del macchinario di produzione proteica della cellula. Rimuovere l'rRNA facilita il recupero di altri tipi di trascritto per una misurazione accurata. L'rRNA viene tipicamente rimosso ibridazzando il campione con oligonucleotidi complementari attaccati a perline magnetiche, quindi utilizzando un magnete per separare l'rRNA dal resto del campione.

Question 3

Come vengono convertiti i campioni di RNA in DNA per il sequenziamento?

Accepted Answer

Poiché l'RNA è intrinsecamente soggetto a degradazione, viene prima retrotrascritto in DNA a doppio filamento. Le sequenze di oligonucleotidi chiamate adattatori vengono poi ligate sui frammenti di DNA. Questi adattatori contengono regioni costanti che fungono da siti di legame per i primer per l'amplificazione PCR e sequenze uniche chiamate codici a barre che identificano i frammenti di ciascun campione.

Question 4

Che ruolo giocano i codici a barre nella preparazione della libreria RNA-seq?

Accepted Answer

I codici a barre sono sequenze oligonucleotidiche uniche contenute all'interno di adattatori che identificano tutti i frammenti di DNA provenienti da un singolo campione. Ciò consente di mescolare e sequenziare contemporaneamente librerie provenienti da campioni diversi. Dopo il sequenziamento, i codici a barre consentono ai ricercatori di ordinare e analizzare le letture in base al campione di origine.

Question 5

Come viene valutata la qualità dei dati RNA-seq durante il sequenziamento?

Accepted Answer

La qualità del sequenziamento è indicata dal punteggio Q, che riflette la probabilità di identificare una base errata. I punteggi Q superiori a 30 corrispondono a meno di una possibilità su 1.000 di una lettura errata. Inoltre, le sequenze di DNA di riferimento aggiunte a bassa concentrazione servono come controllo di qualità, e il loro recupero al tasso previsto indica che tutte le sequenze della libreria sono rappresentate uniformemente.

Question 6

Cosa può rivelare l'RNA-seq sulle differenze di espressione genica tra i campioni?

Accepted Answer

L'RNA-seq può identificare geni che sono espressi in modo differenziale in diverse condizioni confrontando i trascrittomi tra campioni. I ricercatori possono contare il numero di letture per trascritto per misurare l'abbondanza di RNA. Anche per gli organismi senza genomi sequenziati, le informazioni sui trascrittomi possono essere confrontate con altre specie sequenziate per identificare geni con livelli di espressione aumentati o diminuiti.

Question 7

Come viene utilizzato l'RNA-seq per studiare le interazioni RNA-proteina?

Accepted Answer

L'RNA-seq può essere adattato per identificare i trascrittibili ai quali si lega una proteina di interesse mediante immunoprecipitazione della proteina con anticorpi e definizione degli RNA legati attraverso il sequenziamento. Quando i complessi RNA-proteina vengono incrociati all'inizio, l'analisi del sequenziamento può mappare il sito di incrocio e identificare il sito di legame della proteina sull'RNA fino al livello del nucleotide.

Sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq) - Quiz di valutazione