L'applicazione di geneticamente codificato fluorescente ossido nitrico (NO •) sonde, i geNOps, in tempo reale Imaging di NO • I segnali in singole cellule
16 marzo 2017
Questo manoscritto presenta protocolli per l'applicazione di nuove sonde di ossido nitrico (NO•) geneticamente codificate (geNOps) per monitorare le fluttuazioni di NO• di singole cellule in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza. La formazione di NO• innescata dal Ca2+ a livello delle singole cellule endoteliali è stata visualizzata combinando geNOps con un sensore chimico di Ca2+.
L'obiettivo generale di questo approccio di imaging è quello di monitorare i segnali dell'ossido nitrico in tempo reale a livello delle singole cellule utilizzando una nuova classe di sonde fluorescenti di ossido nitrico geneticamente codificate, le geNOps. Considerando l'importanza dell'ossido nitrico in biologia e fisiologia, una visualizzazione di questa molecola a livello cellulare o addirittura subcellulare è stata desiderata sin dalla sua scoperta. Visualizziamo i segnali dell'ossido nitrico con nuove sonde fluorescenti basate su proteine, le geNOps.
I geNOps rispondono direttamente e immediatamente all'ossido nitrico mediante quench a fluorescenza. Ciò significa che è possibile monitorare in tempo reale la cinetica della generazione, della diffusione e della degradazione dell'ossido nitrico in singole cellule. Il vantaggio principale di geNOps è che è possibile osservare i segnali di ossido nitrico con un'elevata risoluzione spaziale e temporale utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale.
Iniziare questa procedura sostituendo il tampone di conservazione della linea cellulare endoteliale o delle cellule HEK293 con un millilitro per pozzetto della soluzione di potenziamento del ferro (II) a temperatura ambiente. Incubare le celle per esattamente 20 minuti al buio. La procedura di caricamento del ferro è essenziale per ottenere la piena reattività delle sonde e può essere adattata a diversi tipi di celle e applicazioni.
Successivamente, lavare le cellule una volta con il tampone di conservazione e incubare ciascun pozzetto con due millilitri di tampone di conservazione per almeno due ore a temperatura ambiente per consentire alle cellule di equilibrarsi. Quindi, sostituire il tampone di conservazione con Fura-2AM da 3,3 micromolari in un millilitro di tampone di conservazione. Proteggere le cellule dalla luce e incubarle per 45 minuti.
Dopo 45 minuti, lavare due volte le cellule con il tampone di conservazione e incubarle nuovamente per almeno 30 minuti per consentire alle cellule di equilibrarsi. Per iniziare la procedura, fissare prima un vetrino coprioggetti da 30 millimetri rivestito con la linea cellulare endoteliale o cellule HEK293 in una camera di perfusione metallica. Accendere il sistema di imaging, quindi posizionare la camera di perfusione metallica sul microscopio.
Collegare il tubo di afflusso ai serbatoi tampone, quindi accendere il sistema di perfusione. Collegare ora l'efflusso a una pompa per vuoto, garantendo un flusso costante ed evitando lo scarico del vetrino. Avviare la perfusione per gravità con tampone di calcio fisiologico utilizzando un sistema di perfusione semiautomatico.
Quindi, definire le impostazioni di imaging utilizzando il rispettivo software. Seleziona le lunghezze d'onda di eccitazione 340 nanometri e 380 nanometri per l'imaging Fura-2 e 480 nanometri per l'eccitazione G-geNOp. Quindi, selezionare la regione di imaging spostando la tabella xyz del microscopio fino a quando diverse celle fluorescenti non sono a fuoco.
Quindi, definire le regioni di interesse. Disegna le regioni che coprono diverse singole celle fluorescenti intere per ogni campo di imaging. Successivamente, definisci una regione di sfondo di dimensioni simili.
Inizia a raccogliere dati su un microscopio a fluorescenza invertito e avanzato con un tavolino per campioni motorizzato e una sorgente di luce monocromatica. In alternativa, eccitare le cellule a 340 nanometri e 380 nanometri per Fura-2AM e 480 nanometri per G-geNOp, rispettivamente. Impostare i rispettivi tempi di esposizione in modo che un chiaro segnale di fluorescenza sia rilevabile nel tempo per tutti i canali.
Raccogli la luce emessa a 510 nanometri per Fura-2AM, 520 nanometri per G-geNOp utilizzando una telecamera CCD con un set di filtri appropriato composto dall'eccitatore da 500 nanometri, un dicroico da 495 nanometri e un emettitore da 510-520 nanometri. Quindi, registra un fotogramma totale ogni tre secondi. Registrare i primi tre minuti nel tampone di calcio fisiologico per ottenere la linea di base dei rispettivi segnali di fluorescenza.
Una volta osservata una fluorescenza basale stabile, passare all'istamina 100-micromolare o all'ATP contenente tampone di calcio fisiologico per stimolare le cellule per tre minuti. Successivamente, tornare al tampone fisiologico del calcio senza istamina o ATP e L-NNA per cinque minuti per rimuovere i composti dalle cellule. Successivamente, somministrare NOC-7 10-micromolare nel tampone fisiologico del calcio per due minuti utilizzando il sistema di perfusione.
Il donatore di ossido nitrico influisce fortemente sulla fluorescenza G-geNOp e di solito riduce le cellule di oltre il 20% in risposta a NOC-7 10-micromolare. Nelle cellule EA.hy926, l'effetto NOC-7 è più forte rispetto al quench di fluorescenza G-geNOp indotto dall'agonista. Successivamente, lavare via il composto che rilascia l'ossido nitrico per circa 10 minuti con il tampone di calcio fisiologico e interrompere la registrazione una volta recuperata la fluorescenza basale.
Qui sono mostrate le immagini rappresentative a fluorescenza ad ampio campo di cellule EA.hy926 che esprimono G-geNOp caricate con Fura-2AM. E qui, è il decorso temporale rappresentativo delle registrazioni simultanee dei segnali Fura-2 e G-geNOp in risposta all'istamina a 100 micromolari. Come indicato, l'istamina è stata rimossa dopo tre minuti utilizzando un sistema di perfusione.
Queste curve rappresentano le registrazioni simultanee dei segnali citosolici di calcio e ossido nitrico di una singola cellula endoteliale caricata con Fura-2AM che esprime transitoriamente G-geNOp. Le cellule sono state stimolate con istamina 100-micromolare per tre minuti in un tampone contenente calcio. E mostrati qui, sono i segnali rappresentativi di calcio e ossido nitrico registrati simultaneamente nel tempo di una cellula EA.hy926 che è stata pretrattata con L-NNA 500-micromolare prima della misurazione.
Le cellule sono state trattate con istamina 100 micromolari in presenza di calcio due millimolari. Questa figura mostra le curve medie che rappresentano i segnali citosolici dell'ossido nitrico in risposta all'ATP monomolare seguito da una stimolazione della seconda cellula con ATP 100-micromolare. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente di visualizzare i segnali dell'ossido nitrico in tempo reale con il minimo sforzo.
Credo che questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori per esplorare e ristudiare i segnali dell'ossido nitrico in vari modelli cellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la tecnologia geNOps per l'imaging in tempo reale dell'ossido nitrico nel tuo sistema modello.
Panoramica
Questo manoscritto presenta protocolli per l'utilizzo di sonde codificate geneticamente per l'ossido nitrico (NO•) (geNOps) per monitorare le fluttuazioni di NO• a singola cellula in tempo reale mediante microscopia a fluorescenza. Lo studio visualizza la formazione di NO• indotta da Ca2+ in singole cellule endoteliali.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Microscopia a fluorescenza
Contesto
- L'ossido nitrico svolge un ruolo cruciale in vari processi biologici.
- La visualizzazione in tempo reale di NO• a livello cellulare è stata un obiettivo di lunga data.
- Le sonde codificate geneticamente forniscono un approccio innovativo per il monitoraggio della dinamica di NO•.
- Una risoluzione spaziale e temporale elevata è realizzabile con la microscopia a fluorescenza convenzionale.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare protocolli per l'imaging in tempo reale dei segnali di ossido nitrico nelle singole cellule.
- Utilizzare geNOps per monitorare la generazione, la diffusione e la degradazione di NO•.
- Migliorare la comprensione del ruolo dell'ossido nitrico nella segnalazione cellulare.
Metodi utilizzati
- Preparazione della linea cellulare endoteliale o cellule HEK293 con soluzione booster di ferro(II).
- Utilizzo di Fura-2AM per l'imaging del calcio insieme a geNOps.
- Microscopia a fluorescenza per catturare dati in tempo reale sui segnali di NO• e calcio.
- Stimolazione delle cellule con istamina o ATP per osservare la risposta di NO•.
Principali risultati
- Visualizzazione con successo dei segnali di ossido nitrico in tempo reale.
- Dimostrati gli effetti di istamina e ATP sulla produzione di NO•.
- Stabilito un baseline per i segnali di fluorescenza prima e dopo la stimolazione.
- Mostrato la reattività delle geNOps ai donatori di ossido nitrico.
Conclusioni
- La tecnologia geNOps consente un'imaging efficace in tempo reale dell'ossido nitrico.
- Questo metodo può facilitare ulteriori ricerche sulla segnalazione dell'ossido nitrico in vari modelli cellulari.
- Studi futuri possono esplorare le implicazioni di NO• in diversi contesti fisiologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Real-time, single-cell imaging of nitric oxide (NO•) dynamics addresses a critical gap in understanding rapid signaling events relevant to disease biology and drug discovery. The geNOps platform enables high-resolution quantification of NO• generation and degradation, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This capability enhances predictive confidence for portfolio triage and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of NO• signaling kinetics in live cells for functional target interrogation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying stimulus-dependent NO• responses at the single-cell level.
- Facilitates pathway clarification by correlating NO• fluctuations with upstream triggers such as Ca2+ influx.
- Improves predictive confidence for advancing NO•-modulating targets.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, genetically encoded probe system for reproducible NO• detection in diverse cell models.
- Enables quantitative, real-time readouts suitable for assay standardization and downstream screening workflows.
- Supports dual-parameter imaging (e.g., NO• and Ca2+) for multiplexed assay development.
- Facilitates reliable evaluation of NO• donor compounds and pathway modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling NO• monitoring in physiologically relevant cell types.
- Supports translational biomarker development by linking NO• dynamics to functional cellular outcomes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation for NO•-related mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative NO• signaling data.
Pipeline & Workflow Integration
The geNOps technology integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway mapping by enabling real-time NO• signal quantification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Provides high-resolution temporal and spatial data for comparative analysis of NO• responses.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling NO• monitoring in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, genetically encoded platform adaptable across cell types and experimental setups.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in NO•-related pathways.
- Operational Value: Standardizes NO• detection with scalable, reproducible protocols for diverse R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust functional readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of NO•-modulating targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to advanced imaging systems with appropriate filter sets and software.
- Demands cross-team standardization of probe loading and imaging protocols.
- Adaptation may be necessary for different cell types or experimental conditions.
- Probe responsiveness depends on iron loading and cell-specific factors.
