Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

L'obiettivo generale di queste procedure è studiare come le variazioni nell'espressione genica, all'interno delle cellule in via di sviluppo o nel loro ambiente circostante, influenzino i processi temporali durante lo sviluppo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali, come ad esempio se il momento della specificazione del destino cellulare sia controllato da geni espressi in maniera cell-autonoma all'interno di una cellula oppure in maniera non cell-autonoma nelle cellule adiacenti. Il principale vantaggio di questa tecnica risiede nella possibilità di seguire singole cellule progenitrici in un vertebrato in vivo mentre si sviluppano in ambienti geneticamente distinti.

La procedura sarà dimostrata da Stefanie Dudczig, assistente di ricerca del mio laboratorio. Dopo aver preparato gli embrioni di pesce zebra e gli aghi per microiniezione con Morpholini o mRNA, secondo il protocollo descritto, immergere la punta dell'ago in una goccia di olio minerale posta in una piastra. Misurare il volume di iniezione premendo il pedale, e regolare la pressione del gas e/o il tempo di durata finché il volume di iniezione non corrisponde a un nanolitro, misurato con una piastra micrometrica oppure, in alternativa, con un reticolo oculare.

Posizionare un vetrino su una piastra di Petri e, con una pipetta di trasferimento, depositare gli embrioni allo stadio di singola cellula lungo il bordo del vetrino. Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento fine, rimuovere la maggior quantità possibile di liquido per evitare movimenti durante le iniezioni. Quindi, utilizzando una punta di pipetta Microloader con metà della punta sottile recisa, allineare gli embrioni in una singola colonna.

Quindi, abbassare l'ago verso un embrione allo stadio di singola cellula e penetrare il corione e il tuorlo con un'unica movimento fluido. Una volta che la punta dell'ago è centrata nel tuorlo, premere una volta il pedale e microiniettare un nanolitro di mRNA H2AGFP o H2BRFP nel tuorlo dell'embrione allo stadio singolo. Rimuovere l'ago di iniezione, spostare la piastra contenente gli embrioni per portare l'embrione successivo in posizione e continuare le iniezioni fino a quando l'intera colonna di embrioni è stata iniettata.

Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, inclinare la piastra di 30-45 gradi ed utilizzare un flusso delicato di mezzo E3 da una bottiglia con beccuccio per trasferire gli embrioni iniettati in una nuova piastra di Petri pulita. A tre ore dalla fecondazione, utilizzare un microscopio a fluorescenza con un ingrandimento da 2X a 5X e un filtro RFP per verificare la presenza del segnale di marcatura negli embrioni donatori. Selezionare gli embrioni ben sviluppati con un segnale fluorescente intenso.

Dopo aver preparato le lastre per iniezione e le piastre di Petri secondo il protocollo descritto, tagliare la punta di una pipetta Pasteur di vetro a forma allungata e finemente tirata a una lunghezza che permetta una comoda manovrabilità, utilizzando un coltello al diamante per incidere l'ago mentre lo si ruota fino a quando la punta non cade. Assicurarsi che il taglio sia dritto. Successivamente, per evitare di danneggiare gli embrioni dechorionati, lucidare la pipetta di trasferimento di vetro passando la superficie tagliata nella fiamma di un becco Bunsen in modo da ottenere estremità lisce.

Per dechorionare gli embrioni, posizionare embrioni ospiti e donatori ben sviluppati in due beute Erlenmeyer di vetro separate da 10 millilitri e rimuovere la maggior quantità possibile di liquido. Aggiungere 5 millilitri della soluzione di proteasi 0,5 milligrammi per millilitro precedentemente preparata in ciascuna beuta e agitare delicatamente gli embrioni osservandoli al microscopio stereoscopico. Continuando ad agitare, non appena il primo embrione esce dalla coriona, utilizzare il mezzo E3 per eseguire tre risciacqui rapidi al fine di rimuovere la soluzione di proteasi, versando fuori la maggior parte del liquido e riempiendo nuovamente la beuta versando delicatamente il mezzo E3 lungo il bordo.

Interrompere la dechorionazione enzimatica con un rapido ma delicato risciacquo non appena si osservano i primi embrioni dechorionati. Per i trapianti, selezionare esclusivamente embrioni dechorionati con una massa cellulare simmetrica e senza evidenti deformazioni o danni al tuorlo. Per eseguire il trapianto alla fase di blastula, montare l'ago nel portaghi e collegarlo al tubo del dispositivo di trapianto.

Verificare la tenuta ermetica azionando manualmente la siringa per aspirare e rilasciare liquido attraverso l'ago. Successivamente, con una pipetta di vetro, trasferire gli embrioni donatori nella prima colonna dello stampo in agarosio. Quindi trasferire gli embrioni ospiti nelle colonne da due a sei dello stampo in agarosio.

Appoggiare delicatamente l'ago di trapianto sulle cellule blastomeriche di un embrione donatore ed aspirare lentamente circa da 20 a 50 cellule all'interno dell'ago. Evitare di aspirare il tuorlo. Utilizzando il micromanipolatore, sollevare l'ago di trapianto dall'embrione donatore.

Spostare la piastra di iniezione a sinistra e inserire la punta dell'ago di trapianto attraverso il lato della massa cellulare, fino al polo animale del primo embrione ospite. Depositare da cinque a dieci cellule in prossimità della superficie, seguendo una mappatura del destino cellulare che indica come questa zona dia origine al campo oculare del prosencefalo. Per montare gli embrioni per l'analisi di imaging, aspirare al massimo cinque embrioni in una pipetta di trasferimento in plastica e lasciare che gli embrioni si accumulino nella punta per effetto della gravità.

Toccare la pipetta di trasferimento sulla superficie di un tubo di plastica precedentemente preparato contenente agarosio a basso punto di fusione all'1%, permettendo agli embrioni di affondare nel tubo limitando al contempo la quantità di E3 trasferita. Successivamente, trasferire i cinque embrioni dal tubo di plastica con agarosio a una piastra di Petri contenente da 0,5 a un millilitro di agarosio e, utilizzando la stessa pipetta di trasferimento, rimuovere l'agarosio in eccesso in modo che ne rimanga soltanto una piccola goccia. Utilizzare una pipetta micro-loader con la punta spezzata per allineare gli embrioni lateralmente, fino a quando l'agarosio non si solidifica.

Proseguire quindi montando fino a cinque embrioni alla volta, in gocce singole di agarosio. Se si esegue l'acquisizione con un microscopio diritto, evitare di posizionare gli embrioni entro un centimetro dal bordo della piastra di Petri. Utilizzare ulteriore agarosio al 1% a basso punto di fusione per unire tra loro le gocce di agarosio lungo il lato della piastra, per prevenire spostamenti o movimenti laterali durante l'acquisizione delle immagini.

Scegliere embrioni con l'angolo di montaggio corretto, un battito cardiaco vigoroso e alcune cellule donatrici trapiantate principalmente nel quadrante ventrale anteriore della retina in via di sviluppo, dove inizia l'onda di espressione genica. Eseguire l'acquisizione delle immagini seguendo il protocollo descritto nel testo. Come mostrato in questa figura, la microiniezione di un nanolitro di mRNA nel tuorlo di embrioni allo stadio a singola cellula determina l'espressione della proteina reporter fluorescente entro tre ore dalla fecondazione, momento in cui vengono selezionati i donatori più brillanti.

24 ore dopo la fecondazione, gli embrioni con cellule donatrici trapiantate nelle posizioni retiniche rilevanti sono stati sottoposti a imaging a intervalli per 16-24 ore. Questa immagine confocale di una singola sezione ottica in Z mostra la sovrapposizione del campo chiaro nei canali rossi nell'occhio in via di sviluppo, con alcune cellule donatrici marcate in rosso all'interno di un ambiente ospite altrimenti non marcato. Questi micrografici provengono da imaging a intervalli delle cellule donatrici di tipo selvatico in via di sviluppo da embrioni transgenici atoh7:gapGFP trapiantati in un ospite di tipo selvatico non marcato.

L'inizio dell'espressione del transgene è indicato per alcune cellule, come mostrato qui. Una volta acquisita padronanza, le microiniezioni possono essere eseguite in due ore, mentre la selezione, il trattamento e il trapianto degli embrioni possono essere completati in tre ore nello stesso giorno. Successivamente o in parallelo a queste procedure, possiamo anche fissare gli embrioni a età specifiche per analisi post mortem.

Ad esempio, possiamo quantificare quali proporzioni di cellule donatrici esprimono un certo gene o proteina, presentano una specifica morfologia oppure si sono spostate in una determinata posizione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare geneticamente gli embrioni di pesce zebra e generare chimere tra donatore e ospite geneticamente distinti. Dovresti inoltre essere in grado di montare gli embrioni per l'acquisizione di immagini in vivo con tecnica time-lapse, al fine di rispondere a domande che non potrebbero essere affrontate analizzando tessuti fissati.