Etichettatura fluorescente colorante di eritrociti e leucociti per studiare la dinamica del flusso nella circolazione retinica del mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la circolazione delle cellule sanguigne nella retina del topo mediante un oftalmoscopio a laser a scansione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulle malattie retiniche, come ad esempio quali siano le dinamiche delle cellule bianche e rosse del sangue a livello del pavimento retinico e in che modo le loro dinamiche di flusso possano contribuire alla patogenesi della malattia. I principali vantaggi di questa tecnica sono la capacità di riflettere diversi fenotipi patologici e la notevole facilità di esecuzione.

Questa procedura sarà dimostrata dai membri del nostro team, Praveen, Bo Bo e Neha. Per isolare lo strato di cellule sanguigne del topo, posizionare il sangue intero appena raccolto sopra una soluzione al 1:1 di polisaccaride e sodio diatrizoato in un tubo da due millilitri. Quindi centrifugare il tubo per 30 minuti.

Successivamente aspirare e scartare il sopranatante plasmatico. Quindi raccogliere con attenzione il buffy coat, composto da leucociti, e lo strato sottostante di eritrociti in provette separate. Successivamente lavare gli eritrociti con PBS 1X per rimuovere eventuali contaminanti e risospendere in un volume di PBS.

Trasferire quindi aliquote di mezzo millilitro della sospensione in provette per microcentrifuga. Centrifugare le aliquote, eliminare il sopranatante e aggiungere circa 200 microlitri di PBS 40% 1X ai globuli rossi pellettati. Mescolare bene.

E incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti, aggiungere 100 microlitri di ICG a ciascuna sospensione. Mescolare i tubi mediante inversione, quindi incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti.

Successivamente aggiungere 300 microlitri di PBS 1X e incubare per un'ora con agitazione delicata a 37 gradi Celsius. Quindi centrifugare le sospensioni, conservare le cellule in pellet e risospendere in un millilitro di PBS 1X. Continuare a lavare le cellule con PBS 1X fino a quando il sopranatante non diventa limpido.

Dopo aver travasato il soprannatante, aggiungere un volume uguale di BSA al 1% in PBS per ottenere un ematocrito del 50% di eritrociti marcati con ICG. Successivamente, procedere con la raccolta del buffy coat. Lavare innanzitutto le cellule una volta con 10 millilitri di PBS 1X per rimuovere eventuali contaminanti.

Centrifugare nuovamente i campioni, quindi risospendere il pellet in 900 microlitri di PBS 1X. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di fluoresceina sodica al 10% e incubare le cellule a temperatura ambiente per due minuti. Infine, lavare i linfociti marcati tre volte con 10 millilitri di PBS 1X.

Centrifugare e risospendere in 100 microlitri di PBS 1X. Per preparare gli eritrociti marcati con ICG per l'iniezione, diluire prima un'aliquote per iniezione fino a un ematocrito del 5% o dell'1%. Anestetizzare il topo e dilatare le sue pupille.

Applicare quindi un unguento oftalmico su entrambi gli occhi. Posizionare una lente a contatto su uno degli occhi. Ora eseguire l'immagine del topo utilizzando una telecamera confocale a scansione laser con una lente positiva da 25 diottrie per compensare la rifrazione dell'occhio.

Posizionare con cura la cornea fresca direttamente sulla testa ottica della macchina SLO. Successivamente, accendere il modulo di imaging e spostarlo fino a quando il nervo ottico si trova al centro dello schermo di imaging. Quindi, con un angolo di 30 gradi, acquisire le immagini del fondo oculare in infrarosso.

Successivamente, acquisire un video del fondo oculare in infrarosso. Accendere il filtro ICG da 790 nanometri, impostare la modalità della telecamera su somma ad alta velocità e mantenere l'angolo di visione tra 15 e 30 gradi. Impostare quindi l'intensità ICG a 85 per tutte le letture.

Sul pannello di controllo, fare clic sul pulsante di acquisizione per registrare un video di base a 8,8-15 fotogrammi al secondo per un minuto. Successivamente, caricare 100 microlitri di eritrociti marcati con ICG in una siringa per insulina con ago da 30 gauge ed iniettare le cellule nella vena della coda oppure iniettarle per via retroorbitale. Immediatamente dopo l'iniezione, acquisire una nuova immagine del fondo infrarosso e un nuovo video con filtro ICG.

Dopo aver acquisito i video, esportarli in formato TIFF per l'analisi delle immagini. Elaborare le immagini utilizzando il pacchetto software di imaging disponibile gratuitamente, MHJ. Dopo aver aperto il file, impostare l'intervallo tra i fotogrammi del video per le misurazioni della velocità.

Quindi aprire il plugin MtrackJ. Dal menu, selezionare il tracciamento e attivare l'opzione per passare all'indice del fotogramma successivo dopo aver aggiunto un punto. Ora individuare una cellula di interesse e seguirla in ciascun fotogramma.

Dal menu, fare clic su aggiungi per aggiungere una nuova traccia, quindi fare clic sulla cellula scelta. Continuare quindi a fare clic sulla posizione attuale della cellula man mano che le immagini avanzano da un fotogramma all'altro. Una volta completato il tracciamento, modificare l'opzione di visualizzazione della traiettoria tra le scelte disponibili e selezionare di mostrare solo i punti della traccia al tempo corrente.

Continuare a fare clic fino a quando non viene visualizzata la traiettoria della cellula, quindi salvare il percorso. Procedere ora con il tracciamento della cellula successiva utilizzando il comando di aggiunta e procedendo come per la prima cellula. Dopo aver tracciato tutte le cellule di interesse, aprire la visualizzazione di tutte le misurazioni dei percorsi utilizzando l'opzione di misura.

Quindi salvare l'output per ulteriori analisi. I globuli rossi marcati con ICG al 1,5% sono stati visualizzati nella circolazione retinica di topi C57 black 6J utilizzando un ematocrito dell'1% o del 5%; le cellule erano distinguibili, ma con ematocrito dell'1% le cellule marcate sono state visualizzate più facilmente. Con entrambe le concentrazioni iniettate, è stato osservabile un certo grado di eritrostasi nella regione parapapillare, ed è risultato più evidente con l'ematocrito del 5%.

I leucociti sono stati marcati con fluoresceina sodica al 1% e visualizzati come cellule verdi mediante microscopia a fluorescenza. È stato osservato un certo grado di aggregazione. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in sei ore se svolta correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante dilatare le pupille per acquisire immagini e video retinici di qualità.