Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare la proteina elicasi G-quadruplex G4 Resolvase1 da un sistema di espressione batterica, utilizzando un passaggio di purificazione unico dipendente dall'ATP per ottenere un enzima quasi puro e cataliticamente attivo. Questo metodo può aiutare i ricercatori a ottenere una proteina ricombinante G4 Resolvase1 quasi pura e cataliticamente attiva, da utilizzare in una vasta gamma di saggi biochimici in vitro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che esclude enzimi mal ripiegati o comunque cataliticamente inattivi dalla preparazione proteica.

L'idea di utilizzare l'ATP per eluire l'elicasi del G-quadruplex è nata dopo aver riscontrato l'impossibilità di eluire l'enzima cataliticamente attivo dai G4-beads, anche a concentrazioni di sale eccezionalmente elevate. Preparare e coltivare ampie colture batteriche che esprimono la G-quadruplex Resolvase1 o G4R1 come descritto nel protocollo testuale. Scongelare il pellet batterico in tre millilitri di buffer TN a temperatura ambiente.

Tenere le provette in mano e agitare delicatamente per scongelare e risospendere il pellet batterico. Una volta scongelato e risospeso in modo relativamente uniforme, portare il volume a cinque millilitri con tampone TN. Successivamente, sciogliere 20 milligrammi di lisozima in 250 microlitri di acqua per ogni coltura e aggiungere ai batteri risospesi.

Lasciare che la lisozima digerisca i batteri per circa cinque-dieci minuti, agitando delicatamente i flaconi a mano. Il colore della sospensione comincerà ad attenuarsi leggermente durante la digestione, e la sospensione risulterà relativamente poco viscosa. Aggiungere 250 microlitri di cocktail inibitore delle proteasi, abbreviato PIC.

Quindi, aggiungere un’aliquota di 10 microlitri di leupeptina e mescolare accuratamente. Porre la sospensione sul ghiaccio e aggiungere 10 millilitri di tampone TN freddo e 22 microlitri di beta-mercaptoetanolo o BME. Trasferire la sospensione in un tubo da 50 millilitri.

Sonicare i batteri sul ghiaccio con un sonicator digitale impostato al 30% di ampiezza. Impostare impulsi di due secondi accesi e due secondi spenti per un minuto. Ripetere la sonicazione tre volte, lasciando raffreddare i campioni sul ghiaccio per almeno due minuti tra un passaggio e l'altro.

Successivamente, aggiungere un volume uguale di soluzione fredda di salina citrato sodico 4X (SSC) più BME, PIC e leupeptina, quindi mescolare la sospensione. In una centrifuga da banco preriscaldata a quattro gradi Celsius, centrifugare i lisati a 2.300 × g per 20 minuti. Trasferire quindi il soprannatante in nuove provette da 50 millilitri preriscaldate.

Prelevare un millilitro di sospensione di perle paramagnetiche di streptavidina, o SPB, per ogni coltura e trasferirlo in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Pellettare le SPB utilizzando un magnete. Quindi lavare le SPB due volte con SSC 2 X più EDTA 5 millimolare a pH 8.

Successivamente, risospendere il SPB lavato in 200 microlitri della stessa soluzione. Aggiungere un'aliquote di tre OD di DNA G4 alla sospensione di SPB. Mescolare rapidamente aspirando e dispensando più volte con la pipetta.

Successivamente, posizionare i tubi su un agitatore rotante e ruotare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Al termine di questo periodo di rotazione, bloccare l'SPB legato a G4 aggiungendo un millilitro di lattalbumina allo 0,4% e mantenere sul ghiaccio fino al momento dell'utilizzo. Per legare la G4R1 ricombinante con tag istidinico alle perle di cobalto, aggiungere un millilitro di sospensione di perle di cobalto in ciascun tubo da 50 millilitri contenente il lisato batterico chiarificato.

Incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente su un agitatore rotante. Dopo l'incubazione, centrifugare le perle di cobalto a 110 ×g per cinque minuti in una centrifuga da banco a quattro gradi Celsius. Aspirare con attenzione il liquido, lasciando un paio di millilitri di liquido per evitare di disturbare le perle di cobalto pellettizzate.

Quindi, lavare le perle con 10-15 millilitri di SSC 4X freddo più BME e centrifugare le perle come in precedenza. Versare il successivo lisato chiarificato sulle perle di cobalto pellettizzate. Incubare per ulteriori 20 minuti a temperatura ambiente sul rotatore e lavare le perle con 10-15 millilitri di SSC 4X più BME.

Quindi, centrifugare le perle a 100 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo un secondo lavaggio, aspirare il liquido e lasciare circa due millilitri di perle e liquido sul fondo del tubo. Trasferire le perle al cobalto con proteine legate in un tubo da due millilitri preraffreddato utilizzando una punta per pipetta da un millilitro con orifizio largo.

Centrifugare brevemente le perle nel tubo da due millilitri a velocità elevata in un microcentrifuga a quattro gradi Celsius. Rimuovere delicatamente e scartare il soprannatante mediante pipetta, avendo cura di non perdere le perle al cobalto a cui è legata la proteina. Pipettare 0,5 millilitri di buffer di eluizione all'istidina, o HEB, sulle perle e risospendere le perle capovolgendo il tubo.

Quindi incubare le perle di cobalto in HEB su un agitatore rotante per cinque minuti in una stanza fredda. Successivamente, centrifugare la sospensione a 18.000 ×g in un microcentrifugo a quattro gradi Celsius per un minuto. Rimuovere con attenzione il soprannatante contenente le proteine mediante pipettaggio accurato, lasciando una piccola quantità di liquido sopra le perle di cobalto.

Trasferire il soprannatante in un tubo da 15 millilitri preraffreddato. Ripetere questi passaggi per un totale di tre eluzioni con HEB. Quindi effettuare un'eluzione con EDTA 0,2 M a pH 6,0.

Il colore delle perle di cobalto cambierà dal rosa al bianco quando l'EDTA chela il cobalto. Dopo che questa quarta ed ultima eluizione è stata trasferita nel tubo da 15 millilitri, pipettare il tampone di eluizione residuo dalle perle di cobalto utilizzando una punta per caricamento gel all'estremità di una punta da un millilitro. Spingendo la punta fino al fondo del tubo è possibile raccogliere il tampone di eluizione residuo contenente proteine.

Avvicinare il G4 SPB preparato al lato del tubo utilizzando un magnete e rimuovere il soprannatante. Successivamente, aggiungere un millilitro di buffer 3X res al G4 SPB e pipettare per mescolare. Pipettare quindi il G4 SPB sospeso nel buffer 3X res nel tubo da 15 millilitri contenente circa due millilitri di HEB EDTA con proteine.

Incubare per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con agitazione occasionale in modo che le perle non si depositino. Dopo aver lavato le G4 SPB legate alla proteina come descritto nel protocollo testuale, pellettare le G4 SPB con un magnete su ghiaccio e risospendere le perle in 100 microlitri di tampone di eluizione preriscaldato. Trasferire immediatamente le perle in una provetta PCR preriscaldata e incubare per 30 secondi a 37 gradi Celsius.

Aggiungere immediatamente 12 microlitri di cloruro di sodio 5 M e pipettare vigorosamente su e giù da 20 a 30 volte. La combinazione dell'elevata concentrazione di sale e dell'ATP presente nel buffer di eluizione permette l'eluizione della G4R1 ricombinante dalle perline G4. Pellettare immediatamente le perline G4 SPB mediante magnete e trasferire l'eluato contenente la proteina in una nuova provetta PCR posta sul ghiaccio.

Dopo aver ripetuto l'eluzione e il trasferimento, il prodotto finale è costituito da circa 200 microlitri di tampone di eluizione contenente G4R1 ricombinante purificato. Infine, eseguire il saggio di controllo qualità dell'attività enzimatica per verificare se è stato purificato G4R1 ricombinante altamente attivo, come descritto nel protocollo testuale. Il saggio G4 fornisce una misura dell'attività enzimatica di G4R1 ricombinante.

Nell'intervallo compreso tra 0,2 e 0,013 microlitri dell'enzima, si osserva tipicamente che il 50% di 0,2 picomoli di DNA G4 tetramolecolare marcato con tetrametilrodamina viene convertito in monomeri. La colorazione con Coomassie del G4R1 ricombinante purificato mostra una singola banda alla dimensione attesa di 120 chilodalton, con una banda contaminante minore a circa 75 chilodalton. Questa banda potrebbe rappresentare una forma troncata del G4R1 ricombinante che ha mantenuto la capacità di legare le perle di DNA G4 ed eluire in maniera dipendente dall'ATP.

La banda di interesse viene quantificata rispetto a una curva standard di proteine. Questo protocollo consente tipicamente di ottenere 200 microlitri di enzima purificato compresi tra 20 e 100 nanomolari per ogni litro di coltura batterica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare la proteina G4 Resolvase1 da un sistema di espressione batterica, utilizzando un passaggio di purificazione unico dipendente dall'ATP per isolare un enzima quasi puro e cataliticamente attivo.

Una volta acquisita dimestichezza e con la pregressa preparazione delle pastiglie di batteri congelati, la purificazione della G4R1 ricombinante può essere eseguita in circa sei ore. Per mantenere l'attività catalitica ottimale dell'enzima, è importante mantenere la preparazione sul ghiaccio, salvo diversa indicazione. Utilizzare sempre inibitori delle proteasi.

Evitare la formazione di bolle nelle provette. Congelare rapidamente l'enzima purificato ed evitare cicli di congelamento-scongelamento non necessari. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori del settore per definire con precisione le affinità di legame e le attività elicasiche di questa proteina verso un'ampia gamma di substrati di DNA e RNA.

Questo metodo può essere adattato anche per la purificazione di altre enzimi nucleici dipendenti dall'ATP per cui il prodotto della reazione enzimatica non è più un substrato di legame per l'enzima.