Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di isolare la proteina G-quadruplex elicasi G4 Resolvase1 da un sistema di espressione batterica utilizzando un esclusivo passaggio di purificazione ATP dipendente per isolare un enzima quasi puro e cataliticamente attivo. Questo metodo può aiutare i ricercatori a ottenere per noi la proteina ricombinante G4 Resolvase1 quasi pura e cataliticamente attiva in un'ampia gamma di saggi biochimici in vitro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che esclude l'enzima mal ripiegato o comunque cataliticamente inattivo dalla preparazione proteica.

L'idea di utilizzare l'ATP per eluire l'elicasi G-quadruplex è nata dopo che non è stato in grado di eluire l'enzima cataliticamente attivo dalle sfere G4, anche a concentrazioni di sale eccezionalmente elevate. Preparare e coltivare grandi colture batteriche che esprimono G-quadruplex Resolvase1 o G4R1 come descritto nel protocollo di testo. Scongelare il pellet batterico in tre millilitri di tampone TN a temperatura ambiente.

Tenere le bottiglie in mano e agitarle per scongelare e risospendere il pellet batterico. Una volta scongelato e sospeso in modo relativamente uniforme, portare il volume fino a cinque millilitri con il tampone TN. Successivamente, sciogliere 20 milligrammi di lisozima in 250 microlitri di acqua per coltura e aggiungerli ai batteri risospesi.

Lascia che il lisozima digerisca i batteri per circa 5-10 minuti mentre fai roteare le bottiglie in mano. Il colore della sospensione inizierà a schiarirsi leggermente man mano che la digestione procede e la sospensione sarà relativamente non viscosa. Aggiungere 250 microlitri di cocktail di inibitori della proteasi abbreviato PIC.

Quindi, aggiungere un'aliquota da 10 microlitri di leupeptina e mescolare accuratamente. Posizionare la sospensione sul ghiaccio e aggiungere 10 millilitri di tampone TN freddo e 22 microlitri di beta mercaptoetanolo o BME. Trasferire la sospensione in un tubo da 50 millilitri.

Sonica i batteri sul ghiaccio con un sonicatore digitale impostato al 30% di ampiezza. Pulsare a due secondi acceso e due secondi spento per un minuto. Ripetere la sonicazione tre volte, lasciando raffreddare i campioni sul ghiaccio per almeno due minuti tra le fasi di sonicazione.

Quindi, aggiungere un volume uguale di citrato di sodio salino freddo quattro X o SSC più BME, PIC e leupeptin e mescolare la sospensione. In una centrifuga da tavolo preraffreddata a quattro gradi Celsius, centrifugare i lisati a 2.300 volte G per 20 minuti. Quindi trasferire il surnatante in provette fresche preraffreddate da 50 millilitri.

Prendi un millilitro di perle paramagnetiche di streptavidina, o sospensione SPB per coltura, e trasferiscilo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Pellettare l'SPB con un magnete. Quindi lavare l'SPB due volte con due X SSC più cinque millimolari EDTA PH8.

Quindi, risospendere l'SPB lavato in 200 microlitri della stessa soluzione. Aggiungere un'aliquota di DNA G4 a tre OD alla sospensione SPB. Miscelare rapidamente pipettando su e giù più volte.

Quindi, posizionare le provette su un rotatore e ruotarle a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Dopo questo periodo di rotazione, bloccare l'SPB legato a G4 aggiungendo un millilitro di lattoalbumina allo 0,4% e tenere in ghiaccio fino al momento del bisogno. Per legare il ricombinante G4R1 marcato con istidina alle perle di cobalto, aggiungere un millilitro di liquame di perle di cobalto a ciascuna provetta da 50 millilitri contenente il lisato batterico chiarificato.

Incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente su un rotatore. Dopo l'incubazione, centrifugare le perle di cobalto a 110 volte G per cinque minuti in una centrifuga da tavolo a quattro gradi Celsius. Aspirare il liquido con cura e lasciare un paio di millilitri di liquido per non disturbare le perle di cobalto pellettate.

Quindi, lavare le perline con 10-15 millilitri di freddo quattro X SSC più BME e pellettare le perline come prima. Versare il successivo lisato chiarificato sulle perle di cobalto pellettate. Incubare per altri 20 minuti a temperatura ambiente sul rotatore e lavare le perle con 10-15 millilitri di quattro X SSC più BME.

Quindi, pellettare le perline a 100 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo un secondo lavaggio, aspirare il liquido e lasciare circa due millilitri di perline e liquido sul fondo del tubo. Trasferire le perle di cobalto legate alle proteine in una provetta da due millilitri preraffreddata utilizzando un puntale per pipetta a foro largo un millilitro.

Centrifugare brevemente le perle nella provetta da due millilitri ad alta velocità in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius. Rimuovere delicatamente ed eliminare il surnatante mediante pipettaggio, facendo attenzione a non perdere le perle di cobalto legate alle proteine. Pipettare 0,5 millilitri di tampone di eluizione dell'istidina, o HEB, sulle perle e risospenderle capovolgendo il tubo.

Quindi incubare le perle di cobalto in HEB su un rotatore per cinque minuti in una cella frigorifera. Quindi, centrifugare la sospensione a 18.000 volte G in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius per un minuto. Rimuovere delicatamente la proteina contenente il surnatante mediante un accurato pipettaggio, lasciando una piccola quantità di liquido sopra le perle di cobalto.

Trasferire il surnatante in una provetta da 15 millilitri preraffreddata. Ripetere questi passaggi per un totale di tre eluizioni HEB. Quindi eluire una volta con EDTA 0,2 molare a PH 6,0.

Il colore delle perle di cobalto cambierà dal rosa al bianco man mano che l'EDTA chela il cobalto. Dopo che questa quarta e ultima eluizione è stata trasferita nella provetta da 15 millilitri, pipettare il tampone di eluizione residuo dalle perle di cobalto utilizzando un puntale di caricamento in gel all'estremità di un puntale per pipetta da un millilitro. Immergendo la punta sul fondo della provetta è possibile raccogliere le proteine residue contenenti il tampone di eluizione.

Pilotare il G4 SPB preparato sul lato del tubo con un magnete ed eliminare il surnatante. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone a tre X res al G4 SPB e pipettare per miscelare. Pipettare l'SPB G4 sospeso in un tampone a tre X res nella provetta da 15 millilitri contenente circa due millilitri di proteine contenenti HEB EDTA.

Incubare per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con agitazione occasionale in modo che le perle non si depositino. Dopo aver lavato la proteina legata alla proteina G4 SPB come descritto nel protocollo di testo, pellettare il G4 SPB con un magnete sul ghiaccio e risospendere le perle in 100 microlitri di tampone di eluizione preriscaldato. Trasferire immediatamente le perle in una provetta per PCR preriscaldata e incubare per 30 secondi a 37 gradi Celsius.

Aggiungere prontamente 12 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e pipettare energicamente su e giù da 20 a 30 volte. La combinazione dell'alto contenuto di sale e ATP contenuto nel tampone di eluizione serve a eluire il ricombinante G4R1 dalle sfere G4. Pellettare immediatamente il G4 SPB con un magnete e trasferire la proteina contenente eluizione in una nuova provetta per PCR su ghiaccio.

Dopo aver ripetuto l'eluizione e il trasferimento, il prodotto finale è costituito da circa 200 microlitri di tampone di eluizione contenente il ricombinante purificato G4R1. Infine, eseguire il test di attività enzimatica di controllo qualità per verificare se il ricombinante altamente attivo G4R1 è stato purificato come descritto nel protocollo di testo. Il test G4 fornisce una misura dell'attività enzimatica ricombinante di G4R1.

Nell'intervallo da 0,2 a 0,013 microlitri nell'enzima si osserva tipicamente che il 50% di 0,2 picomoli di DNA tetramolecolare G4 marcato con tetrametilrodamina viene convertito in monomeri. Il numero di Coomassie del ricombinante purificato G4R1 indica una singola banda alla dimensione prevista di 120 kilodalton con una banda contaminante minore a circa 75 kilodalton. Questa banda può rappresentare il tronco ricombinante G4R1 che ha mantenuto la sua capacità di legare le perle di DNA G4 in eluizione in modo ATP dipendente.

La banda di interesse viene quantificata rispetto a una curva standard delle proteine. Questo protocollo ottiene in genere 200 microlitri di enzima purificato da 20 a 100 nanomolari per un litro di coltura batterica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare la proteina G4 Resolvase1 da un sistema di espressione batterica utilizzando un'esclusiva fase di purificazione ATP dipendente per isolare un enzima quasi puro e cataliticamente attivo.

Una volta padroneggiato, e con la preparazione preliminare dei pellet di batteri congelati, la purificazione del G4R1 ricombinante può essere eseguita in circa sei ore. Per mantenere l'attività catalitica ottimale dell'enzima è importante mantenere il preparato in ghiaccio, se non diversamente specificato. Utilizzare sempre inibitori della proteasi.

Evitare la formazione di bolle nei tubi. Congelare rapidamente l'enzima purificato ed evitare inutili cicli di congelamento e scongelamento. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori del settore per definire con precisione le affinità di legame e le attività dell'elicasi di questa proteina a un'ampia gamma di substrati di DNA e RNA.

Questo metodo può essere adattato anche per la purificazione di altri enzimi dell'acido nucleico ATP dipendenti per i quali il prodotto della reazione enzimatica non è più un substrato legante per l'enzima.