Name: Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Scopri un metodo di purificazione ATP-dipendente per isolare l'enzima G4 Resolvase1 attivo da sistemi batterici. Questa tecnica fornisce proteina quasi pura per saggi biochimici in vitro.

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Vorremmo ringraziare i nostri fonti di finanziamento, tra cui un dono generoso della Fondazione Ware (a JPV), Il National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (a PJS), e fondi di avvio Università Ball State (a PJS). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
<li>Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+understanding+the+stability+of+G-quadruplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes.</a> Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).</li>
<li>Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+prevalent+putative+quadruplex+sequence+motifs+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+quadruplexes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence of quadruplexes in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).</li>
<li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26883636">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li>
<li>Eddy, J., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+correlates+with+potential+for+G4+DNA+formation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).</li>
<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
<li>Lai, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+helicase+RHAU+is+an+essential+gene+and+critical+for+mouse+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis.</a> Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
<li>BD Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf">http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf</a> (2016).</li>
<li>Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+G4+quadruplex+telomerase+RNA+unwinding+by+the+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU.</a> Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).</li>
<li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo rappresenta un&#39;espressione, purificazione e quantificazione schema altamente efficiente per l&#39;isolamento del prodotto genico DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, chiamato anche Rhau e DHX36) (Figura 1). Questo protocollo utilizza due fasi di purificazione: His-tag affinità purificazione su perline affinità cobalto e purificazione enzimatica su perline G4-DNA-coniugato. Quest&#39;ultimo passo è unico in quanto sfrutta l&#39;affinità stretta, alta specificità e l&#39;attività catalitica s...

strutture G4 sono strutture secondarie altamente stabili di acido nucleico che si formano nelle regioni ricche di guanina del DNA e RNA. Strutture G4 sono stabilizzati tramite interazioni Hoogsteen-bonding e coordinare l&#39;incollaggio all&#39;interno della cavità centrale con monovalenti cationi (es. K + e Na +) che contribuiscono in modo significativo alla notevole stabilità termica delle strutture G4 1, 2. I primi bioinformatica studi hanno suggerito che il genoma umano contiene&gt; 375.000 &quot;potenziali G4 che formano motivi&quot; 3, 4. Altre stime studio recenti suggeriscono che il numero di G4 motivi è superiore di un fattore del 2,5 5, mentre un altro studio prevede 716,310 potenziali sequenze distinte G4 formano nel genoma umano 6. G4-forming sequenze sono evolutivamente conservata e non disperse in modo casuale ingenoma. Motivi G4 sono arricchiti in gene regioni codificanti, e verso l&#39;alto del 40% di tutti i promotori dei geni contengono G4 motivi 7. È interessante notare che il grado di arricchimento di motivi G4 in un gene è stata dimostrata per suggerire la funzione del gene. Ad esempio, proto-oncogeni e geni coinvolti nello sviluppo hanno significativamente maggiore arricchimento delle strutture G4 di geni oncosoppressori 8, 9. Con le alte stabilità termica, una presenza quasi onnipresente in tutto il genoma, e il potenziale per influenzare in modo significativo i principali processi cellulari, non è sorprendente scoprire che la cellula si è evoluta enzimi per gestire queste strutture. Uno di questi enzimi è G4 Resolvase1 (G4R1, chiamato anche Rhau e DHX36), che abbiamo caratterizzato come la fonte della maggior parte dei tetramolecular G4-DNA attività risolvere in (HeLa), le cellule umane 10. Da allora, è stato dimostrato that G4R1 ermeticamente lega e cataliticamente snoda tetramolecular e unimolecolare G4-DNA e G4-RNA con i più stretti KD riportato per una proteina G4 vincolante 11, 12, 13. Inoltre, l&#39;attività G4-risolutivo G4R1 è stata implicata in un&#39;ampia gamma di processi biochimici e cellulari, tra telomero / telomerasi biologia 11, 14, 15, 16, trascrizione e splicing 17, 18, 19, 20, di sviluppo 21, ematopoiesi 21, e immune regolazione 22, 23. Con una preponderanza di sequenze G4 situato specificamente nel genoma e diversificata p cellularerocesses che G4R1 è stato recentemente implicato di essere coinvolti con, la capacità di esprimere in modo efficiente e purificare altamente attiva rG4R1 sarà della massima importanza per chiarire i meccanismi biochimici e comportamenti di questa proteina. Qui, dimostriamo un romanzo espressione e di schema di purificazione (Figura 1) che sfrutta l&#39;ATP-dipendente, l&#39;attività G4-risolutivo rG4R1 per isolare in modo efficace enzima attivo. Questo schema potrebbe essere adattato per purificare altri enzimi acido nucleico ATP-dipendente in cui il prodotto della reazione enzimatica non è più un substrato per il legame, come è il caso per G4R1.

<table><tbody><tr><td>Plasmide TriEx4-DHX36</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS cellule competenti</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Terrific Brodo</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 &; g/mL in piastre batteriche/grandi colture</td></tr><tr><td>Carbenicillina (testata su colture cellulari vegetali)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &; micro; g/mL in piastre batteriche/grandi colture</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima (da albume d'uovo di gallina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.</td><td>1963-B</td><td>o da fonte standard</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.</td><td>1966</td><td>o da fonte standard</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCl, pH 8,8</td><td></td><td></td><td>Per colata di gel risolutivo (per gel di quantificazione delle proteine); Da fonte standard</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6,8</td><td></td><td></td><td>Per colata di gel impilabile (per gel di quantificazione delle proteine); Da fonte standard</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acetato, pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.</td><td>1981</td><td>o da fonte standard</td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td></td><td></td><td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (1&nbsp; M solution)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.</td><td>1665</td><td>o da fonte standard</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin emisolfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina perle paramagnetiche</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8&nbsp;</td><td>Fornitura scientifica universale Co.</td><td>0718</td><td>o da fonte standard</td></tr><tr><td>0,2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.</td><td></td><td>Dalla fonte standard; inizialmente regolare il pH con NaOH, quindi regolare nuovamente il pH con HCl. &nbsp;</td></tr><tr><td>A-lattoalbumina (Tipo 1 da latte bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Perle di affinità per metalli di cobalto</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-Istidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico, glaciale</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (da fonte batterica)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide/Bis al 40% (37,5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>per produrre un tampone di corsa in gel proteico (192 mM di glicina, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>10% di sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.</td><td>1667</td><td>per la produzione di tampone di corsa in gel proteico (192 mM di glicina, 25 mM di Tris Base, 0,1% di SDS); o da fonte standard</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>o da fonte standard</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>per produrre un tampone di corsa in gel proteico (192 mM di glicina, 25 mM di base Tris, 0,1% SDS); Da fonte standard</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range Protein MW markers</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilato Z33 oligo ("Z33-Bio")</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5' AAA GTG ATG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotina 3'</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")Oligos</td> <td>Etc</td><td></td><td>5' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'</td></tr><tr><td>Piastra TLC rivestita di fluoro</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% in H2O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Lampada</td><td></td><td></td> UV multibanda <td>In grado di emettere luce UV a 365 nm</td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo (con rotore a secchiello oscillante)</td><td></td><td></td><td>In grado di essere raffreddato a 4 gradi </td></tr><tr><td>C Microcentrifuga</td><td></td><td></td><td>in grado di essere raffreddata a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>O equivalente in grado di erogare impulsi di sonicazione (30% di ampiezza, 2 s ON/2 s OFF)</td></tr><tr><td>50 &deg; C bagnomaria</td><td></td><td></td><td>Per la formazione di Z33 in quadruplex</td></tr><tr><td>37 &deg; Incubatore C per batteri</td><td></td><td></td><td>Per le trasformazioni batteriche e la crescita notturna iniziale di grandi colture di Rosetta2 E. coli trasformate con TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &deg; C/14&nbsp; &deg; Incubatore a scuotimento C per batteri</td><td></td><td></td><td>Per la crescita e l'induzione proteica di grandi colture di Rosetta2 E. coli trasformate con lo spettrofotometro</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> TriEx4-DHX36 <td>in grado di leggere OD600; in grado di leggere le concentrazioni di oligomeri in base alla sequenza di basi (come Biorad SmartSpec 3000)</td></tr><tr><td>Termometro</td><td></td><td></td><td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Provette</td><td></td> per strisce PCR<td></td><td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Provette per centrifuga da 15 e 50 mL (polipropilene)</td><td></td><td></td><td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga (2,0 mL)</td><td></td><td></td><td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Flaconi da centrifuga da 500 mL (polipropilene)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>Array standard di puntali per pipette e pipette sierologiche Da</td><td></td><td></td><td>fonte standard</td></tr><tr><td>Puntali</td><td></td><td></td> per il caricamento del gel <td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Pipetta</td><td></td><td></td> a ripetizione automatica <td>Per l'aliquotazione rapida di rG4R1; Da fonte standard</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td></td><td></td><td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td> liquido <td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Ghiaccio</td><td></td><td></td> secco <td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Tampone campione Laemlli&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per l'esecuzione di gel per lastre di grandi dimensioni</td><td>Biorad</td><td></td><td>Abbiamo utilizzato l'apparato cellulare Protean II xi di Biorad</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12301D</td><td>Utilizziamo un magnete di One Lambda (ora un marchio Thermo Fisher Scientific); e Life è anche una sussidiaria di Thermo, e quindi il magnete qui elencato dovrebbe essere un ricambio adatto</td></tr><tr><td>per le lame</td><td></td><td></td> <td>di rasoioDa fonte standard</td></tr><tr><td>Carta da filtro e imbuto</td><td></td><td></td><td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Casseruola</td><td></td><td></td> in vetro <td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Agitatore</td><td></td><td></td> orbitale <td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Kimwipes Da</td><td></td><td></td><td>fonte standard</td></tr><tr><td>Protezioni</td><td></td><td></td> per fogli trasparenti <td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Scanner e associati Software</td><td></td><td></td> TWAIN <td>Da fonte standard</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> di analisi delle immagini <td>come Fuji Multiguage, o</td></tr><tr><td>equivalente Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>o equivalente&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un approccio g-quadruplex del dna-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva g4 resolvase1

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

strutture di acidi nucleici di ordine superiore chiamato G-quadruplex (G4S, strutture G4) si possono formare in regioni ricche di guanina sia di DNA e RNA e sono altamente stabili termicamente. Ci sono&gt; 375.000 putativi sequenze G4 di formazione nel genoma umano, e si sono arricchiti in regioni promotrici, le regioni non tradotte (UTR), e all&#39;interno della ripetizione telomerica. A causa del potenziale di queste strutture di influenzare processi cellulari, come la replicazione e la trascrizione, la cellula si è evoluta gli enzimi per la loro gestione. Un tale enzima è G4 Resolvase 1 (G4R1), che è stato co-biochimicamente caratterizzata dal nostro laboratorio e Nagamine et al. ed è risultata estremamente legano strettamente sia G4-DNA e G4-RNA (K d nella gamma bassa-PM). G4R1 è la fonte della maggior parte delle attività G4-risolvendo in lisati cellulari HeLa e da allora è stato implicato per svolgere un ruolo nel metabolismo dei telomeri, lo sviluppo della linfa, la trascrizione del gene, emopoiesi, e la sorveglianza immunitaria. La capacità di efficientemente esprimere e purificare cataliticamente attivo G4R1 è di importanza per i laboratori interessati ad approfondire la comprensione dell&#39;interazione cinetica delle strutture G4 ed enzimi G4-risolvere. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per la purificazione di ricombinante G4R1 (rG4R1). La procedura descritta incorpora tradizionale purificazione per affinità basata su un enzima istidina-tag C-terminale espressa in batteri codone ottimizzato umani con l&#39;utilizzo della capacità di rG4R1 di legare e distendersi G4-DNA per purificare enzima altamente attivo in una ATP- passo eluizione dipendente. Il protocollo comprende inoltre una fase di controllo di qualità in cui l&#39;attività enzimatica di rG4R1 è misurata esaminando la capacità dell&#39;enzima purificato per rilassarsi G4-DNA. Un metodo è anche descritto che consente la quantificazione purificato rG4R1. adattamenti alternativi di questo protocollo sono discussi.

Questo protocollo (Figura 1) produce ordinariamente quasi puro, rG4R1 cataliticamente attivo. Come misura dell&#39;attività enzimatica, si osserva tipicamente che il 50% di 0,2 pmol di TAMRA marcato G4-DNA tetramolecular viene convertito in monomeri all&#39;interno del 0.2 - gamma ml 0,013 di rG4R1 come dosati con il saggio di attività G4 sopra descritto (Figura 2). Coomassie colorazione dei purificato rG4R1 indica una singola banda al 120 dimensioni kDa previsto, con una banda di conta...

G4 Resolvase1 lega a strutture G-quadruplex (G4) con ristretti affinità segnalato per una proteina G4 vincolanti e rappresenta la maggioranza dell&#39;attività svolgimento G4-DNA in cellule HeLa. Descriviamo un nuovo protocollo che sfrutta l&#39;affinità e l&#39;attività svolgimento ATP-dipendente di G4-Resolvase1 per purificare specificamente G4R1 ricombinante cataliticamente attivo.

Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare la proteina elicasi G-quadruplex G4 Resolvase1 da un sistema di espressione batterica, utilizzando un passaggio di purificazione unico dipendente dall'ATP per ottenere un enzima quasi puro e cataliticamente attivo. Questo metodo può aiutare i ricercatori a ottenere una proteina ricombinante G4 Resolvase1 quasi pura e cataliticamente attiva, da utilizzare in una vasta gamma di saggi biochimici in vitro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che esclude enzimi mal ripiegati o comunque cataliticamente inattivi dalla preparazione proteica.L'idea di utilizzare l'ATP per eluire l'elicasi del G-quadruplex è nata dopo aver riscontrato l'impossibilità di eluire l'enzima cataliticamente attivo dai G4-beads, anche a concentrazioni di sale eccezionalmente elevate. Preparare e coltivare ampie colture batteriche che esprimono la G-quadruplex Resolvase1 o G4R1 come descritto nel protocollo testuale. Scongelare il pellet batterico in tre millilitri di buffer TN a temperatura ambiente.Tenere le provette in mano e agitare delicatamente per scongelare e risospendere il pellet batterico. Una volta scongelato e risospeso in modo relativamente unifor

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Struttura cristallina di proteine-DNA può fornire indicazioni in funzione della proteina, meccanismo, così come la natura dell'interazione specifica. Qui, segnaliamo come ottimizzare la lunghezza, la sequenza e le estremità del DNA duplex per la co-cristallizzazione...

Ottimizzazione iterativa di duplex di DNA per cristallizzazione di Seqa-DNA Complessi

Descriviamo saggi discontinui sensibili basati su gel per esaminare la cinetica dell'inizio del filamento ritardato utilizzando le proteine di replicazione del batteriofago T7.

Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em&gt; In Vitro</em&gt; Dai replica proteine ​​batteriofago T7

Metodi per la generazione di librerie di gRNA su larga scala dovrebbero essere semplice, efficiente e conveniente. Descriviamo un protocollo per la produzione di gRNA librerie basate su digestione enzimatica del DNA bersaglio. Questo metodo, CORALINA (generazione della libreria completa gRNA attraverso attività controllata nucleasi) presenta un'alternativa alla sintesi del oligonucleotide personalizzato costosi.

Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

Una piattaforma di singola molecola magnetico pinzette per manipolare G-quadruplex è segnalata, che permette per lo studio della stabilità di G4 e regolamento di varie proteine.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Il presente protocollo dimostra l'uso di un saggio di amplificazione esponenziale veloce, a 3 stadi, basato su aptamero per rilevare bersagli. La preparazione del campione, l'amplificazione del segnale e lo sviluppo del colore sono coperti per implementare questo sistema per riconoscere la presenza di teofillina rispetto a quella della caffeina.

Rilevamento del bersaglio basato su aptamero facilitato da una reazione di amplificazione esponenziale isoterma G-quadruplex a 3 stadi

Le bis-3-cloropepidine (B-CePs) sono sonde chimiche utili per identificare e caratterizzare le strutture G-quadruplex in modelli di DNA in vitro. Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per eseguire reazioni di sondaggio con B-CeP e per risolvere i prodotti di reazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide ad alta risoluzione.

In vitro Mappatura chimica delle strutture del DNA G-quadruplex mediante bis-3-cloroperidine

Un ostacolo significativo a tecnologie come CRISPR sono gli eventi fuori bersaglio che possono interrompere i geni vitali. CIRCLE-seq ("Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing") è una tecnica progettata per identificare i siti di scissione non intenzionali. Questo metodo mappa l'attività dell'intero genoma di CRISPR-Cas9 con alta sensibilità e senza bias.

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

Questo protocollo dimostra l'esecuzione di un saggio a singola molecola per la visualizzazione dal vivo dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG. Descrive (1) la preparazione di un substrato di DNA, (2) la purificazione dell'elicasi CMG di Drosophila melanogaster marcata in fluorescenza, (3) la preparazione di una cella a flusso microfluidico per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e (4) il saggio di svolgimento del DNA a singola molecola.

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Questo protocollo delinea un saggio di replicazione del DNA a singola molecola basato su microscopia a fluorescenza, che consente la visualizzazione in tempo reale delle interazioni tra le DNA polimerasi e gli ostacoli come le strutture G-quadruplex.

Visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della DNA polimerasi ai G-quadruplex

Viene presentato un protocollo per la produzione, la purificazione e l'uso di vescicole di membrana esterna confezionate con enzimi (OMV) che forniscono una maggiore stabilità enzimatica per l'implementazione in diverse applicazioni.

Packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Progettazione, produzione e purificazione

Scopri un metodo di purificazione ATP-dipendente per isolare l'enzima G4 Resolvase1 attivo da sistemi batterici. Questa tecnica fornisce proteina quasi pura per saggi biochimici in vitro.

Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1

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