Name: Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Impara la registrazione patch-clamp intere cellule per determinare la selettività ionica dei channelrhodopsin in cellule HEK293. Questo metodo elettrofisiologico fornisce misurazioni dirette delle proprietà biofisiche dei canali.

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Ringraziamo Maila Reh, Tharsana Tharmalingam e specialmente Altina Klein per un&#39;ottima assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione di Ricerca Tedesca (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) e il Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) e E4 (PH).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Determinazione dei potenziali di inversione a condizioni ioniche e elettriche definite fornisce informazioni sulle specie ioniche trasportate dopo l&#39;attivazione luminosa dei ChRs. Se solo una specie di ioni varia in un complesso complesso fisiologico e il potenziale di inversione ottenuto si sposta in base al potenziale teorico di Nernst, questa specie ione è l&#39;unico trasportato. Tuttavia, per i ChRs, i cambi potenziali di inversione sono generalmente meno pronunciati di quelli previ...

Channelrhodopsins (ChR) sono canali ionici leggeri che si verificano nel punto di occhio delle alghe verdi motile e servono come fotosensori primari per fototassi e risposte fobiche 1 . Dalla loro prima descrizione nel 2002 2 , i ChRs hanno aperto la strada per il campo emergente dell&#39;ottogenetica e possono essere applicati in una varietà di cellule eccitabili, ad es. Nei muscoli scheletrici, nel cuore o nel cervello 3 , 4 , 5 . L&#39;espressione di ChRs nelle cellule bersaglio produce una permeabilità ionica controllabile dalla luce della rispettiva cellula. In un contesto neuronale, questo consente l&#39;attivazione 6 , 7 , 8 o inibizione 9 , 10 di cottura del potenziale d&#39;azione (AP) - a seconda dello ione condotto - con lo spazio e temporaliPrecisione della luce sottolineando come la selettività ionica di una variante ChR determina l&#39;applicazione ottogenetica. I primi ChRs scoperti da Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri sono permeabili a protoni, ma anche a cationi monovalenti come il sodio, il potassio e, in misura minore, a cationi bivalenti come il calcio e il magnesio 11 , 12 , 13 . Oggi, più di 70 cantipolisini naturali (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 e varie varianti progettate 18 , 19 , 20 con proprietà diverse come La dimensione fotocirrente, la sensibilità spettrale, la cinetica e la selettività del cation sono disponibili. Mentre nella neuroscienza, CCRs aUtilizzati per attivare le cellule e attivare AP, le pompe microbiche a luce guidata sono stati gli unici antagonisti disponibili per annientare i neuroni. Nel 2014, due gruppi hanno dimostrato simultaneamente che i CCRs possono essere convertiti in channelrhodopsins (ACR) di anion-conducting mediante alterazione della polarità lungo il poro conducente ionico attraverso l&#39;engineering molecolare 9 , 21 . Successivamente, ACR naturali sono stati identificati in diverse alghe di crittophyte 22 , 23 , 24 . Più importante, l&#39;attivazione leggera di ACR mediata dalle correnti di cloruro nei neuroni adulti permette di inibire l&#39;attività neuronale a intensità luminosa molto minori rispetto alle pompe microbiche che trasportano solo singole cariche per fotone assorbito. L&#39;attività di ChR può essere direttamente affrontata mediante registrazioni elettrofisiologiche di patch-clamp di correnti indotte da luce nelle cellule HEK293. La pinzettaLa tecnica è stata originariamente sviluppata alla fine degli anni &#39;70 25 e ulteriormente migliorata da Hamill et al. , Consentendo la registrazione dell&#39;entità delle correnti da una piccola cella (modalità di intera cellula) con alta risoluzione di corrente e controllo diretto della tensione della membrana 26 . Applicata nella coltura cellulare, questa tecnica fornisce un preciso controllo delle condizioni di registrazione ioniche e elettriche e consente di studiare la selettività degli ioni insieme al relativo contributo degli ioni alla corrente totale. Qui esemplifica l&#39;esame della selettività ionica per il channelrhodopsin di Anion -conducting di Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 attraverso la registrazione di relazioni di tensione-corrente in varie concentrazioni di cloruro extracellulare per dimostrare un&#39;elevata conduttanza di cloruro.

<table><tbody><tr><td>Cellule HEK293</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>Cellule renali embrionali umane</td></tr><tr><td>Retinal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>all-trans retinal</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrome</td><td>FG 0445</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>Ponti Agar</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl2 2H2O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Biomol</td><td>2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrome</td><td>S0615</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D(+)-Glucosio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl2 6H2O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-metil-D-glucamina</td></tr><tr><td>Na-aspartato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6683</td><td>Acido L-aspartico sale di sodio monoidrato</td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>XL1Blue E. coli</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>Chemocompetent E. coli</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di lisogenia medio</td><td>Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Roth</td><td>6494</td><td>Piastre di agar</td></tr><tr><td>Kit di purificazione plasmidico</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomicina</td><td>Biocromo</td><td>A 2213</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-D-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>Rivestimento antiscivolo</td></tr><tr><td>di copertura Microforge</td><td>Pipette</td><td></td> sierologiche <td>per lucidatura antincendio</td></tr><tr><td></td><td>su misura TPP</td><td></td><td>Banco pulito</td></tr><tr><td>Banco pulito</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>IKA</td><td>RCT classico</td><td></td></tr><tr><td>Filo d'argento</td><td>Prodotti scientifici</td><td>AG-T25; AG-T10</td><td>Elettrodi, 0,64 mm (bagno); 0,25 mm (elettrodo)</td></tr><tr><td>pH-metro</td><td>Knick</td><td>765 Osmometro calimetrico</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>Lucidatura a fuoco</td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>Binder</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>34 mm interno diametro</td></tr><tr><td>Vetrini Roth</td><td></td><td>P232</td> Termometro <td>diametro 15 mm</td></tr><tr><td>R</td><td>&ouml; nave Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10</td></tr><tr><td>trasmissione Porta pipetta</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Molecular</td><td>Devices</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>DigiData1400</td><td>Convertitore analogico digitale</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa</td><td>TILL Photonics</td><td>Polychrome V</td><td>Set a 540 nm a piena intensità</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>Shutter driver</td><td>Vincent Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Capilarries in vetro</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>Capillari in boresilicato con estremità lucidate a fuoco OD 1,5 mm ID 0,86 mm</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Gestore del bagno</td><td>Lorenz Messger tebau</td><td>MPCU</td><td></td></tr><tr><td>Set di filtri a tripla banda</td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>Filtro a fluorescenza&nbsp; ECFP/EYFP/mCherry&nbsp;</td></tr><tr><td>Telecamera CCD</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>Optometro</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>Misura intensità luminosa</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X/1.0</td></tr><tr><td>DIC Micromanipolatore</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Camera di registrazione</td><td>Alimentazione su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>Evita il rumore elettrico proveniente dall'alimentatore incorporato nel microscopio</td></tr><tr><td>Tavolo isolato dalle vibrazioni</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Gabbia di Faraday</td><td>Su misura o qualsiasi tavolo</td><td></td><td></td>di corrispondenza commerciale</tr><tr><td>Tubi flessibili</td><td>Qualsiasi commerciale; ad esempio Roth</td><td></td><td>Diverse dimensioni e materiali per la manipolazione del bagno e l'applicazione della pressione della pipetta; ponti di agar</td></tr><tr><td>Lineare agitatore</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcolatore del potenziale di giunzione liquida</td><td>Molecular Devices o direttamente da Peter H. Barry</td><td></td><td>Il programma è incluso nel software di acquisizione Clampex o può essere ottenuto da p.barry@unsw.edu.au</td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>Software di valutazione dati</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>PsACR1</td><td>GenBank o Addgene</td><td>KF992074.1 o Addgene plasmide #85465</td><td>Gene encoding for PsACR1</td></tr><tr><td>Guida all'amplificatore</td><td>Molecular Devices</td><td>The Axon Guide</td><td></td></tr></tbody></table>

registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Negli ultimi dieci anni, i channelrhodopsins sono diventati indispensabili nella ricerca neuroscientificale, dove vengono utilizzati come strumenti per manipolare in modo non invasivo i processi elettrici nelle cellule bersaglio. In questo contesto, la selettività ionica di un channelrhodopsin è di particolare importanza. In questo articolo si descrive l&#39;analisi della selettività di cloruro per una scanografia di Proteomonas sulcata recentemente identificata da anion-conducting channel mediante protezioni elettrofisiologiche di patch-clamp sulle cellule HEK293. La procedura sperimentale per misurare le fotocorri luminose richiede una sorgente luminosa rapida - idealmente monocromatica - accoppiata nel microscopio di una configurazione di patch-clamps altrimenti convenzionale. Sono state descritte procedure preparative prima dell&#39;esperimento che prevedono la preparazione di soluzioni tamponate, considerazioni sui potenziali di giunzione liquidi, la semina e la trasfezione delle cellule e la trazione delle pipette patch. La registrazione effettiva della relazione di tensione-correnteS per determinare le potenzialità di inversione per diverse concentrazioni di cloruro si svolge 24 h a 48 h dopo la trasfezione. Infine, i dati elettrofisiologici vengono analizzati rispetto alle considerazioni teoriche della conduzione di cloruro.

<html> La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi ottenuti dalle misurazioni seguendo il protocollo descritto. Durante l&#39;illuminazione con luce verde, Ps ACR1 presenta una corrente transitoria veloce che decade rapidamente a un livello corrente fisso. Dopo la spegnimento della luce, le fotocorrienti decadono a zero entro millisecondi ( Figura 2A ). Scambiare la concentrazione di cloruro extracellulare provoca uno spostamento del potenzial...

Questo articolo descrive come la selettività ionica della canalrodopsina viene determinata con registrazioni elettrofisiologiche di patch-clamp su cellule intere utilizzando cellule HEK293. Qui, viene dimostrata la procedura sperimentale per studiare la selettività del cloruro di una canalrodopsina anionico-selettiva. Tuttavia, la procedura è trasferibile ad altre canalrodopsine di selettività distinta.

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la selettività del cloruro di nuovi canali ionici light-gated. Questo metodo può rispondere a domande chiave nella biofisica delle canalrodopsine come le ampiezze delle fotocorrenti, la cinetica e la selettività ionica. Il vantaggio principale di questa tecnica è la lettura diretta dell'attività del canale biofisico che è veloce e facile da replicare.Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ogni fase della procedura sperimentale, dalla preparazione delle cellule HEK alla registrazione delle fotocorrenti, deve essere ottimizzata. La semina e la transezione delle cellule HEK saranno dimostrate da Altina Klein. Per iniziare questa procedura, pesare i componenti solidi per 100 millilitri di soluzioni tamponate intracellulari e 500 millilitri di soluzioni tamponate extracellulari in becher separati.E poi aggiungere la rispettiva quantità delle soluzioni stock preparate. Successivamente, aggiungere acqua ultrapura e regolare attentamente il pH utilizzando acidi e basi. Quindi regolare l'osmolarità con il glucosio a 290 milliosmoli e 320 milliosmoli rispettivamente per le soluzioni intrace

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Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Qui si descrive una procedura per la generazione di dark-adattato fette della retina del mouse per le registrazioni elettrofisiologiche.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi...

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

Questo protocollo descrive una tecnica chiamata elettrofisiologia del patch clamp a cellula intera, che è un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni di Mauthner e di altre cellule reticolospinali negli embrioni di zebrafish.

Elettrofisiologia del Patch Clamp a cellula intera: un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni

Il video dimostra la registrazione dell'attività elettrica nei neuroni fotorecettori dell'ommatidio di Drosophila stabilendo una configurazione dell'intera cellula. Evidenzia l'attivazione dei canali del potenziale recettoriale transitorio da parte di impulsi luminosi, con conseguenti urti quantici misurabili.

Registrazioni con morsetto di tensione a cellula intera dai fotorecettori di Drosophila

In questo video, colture di cellule renali embrionali che esprimono proteine dei canali ionici dipendenti dalla luce fuse con un reporter fluorescente dimostrano l'effetto della luce sul movimento degli ioni. Il patch clamp a cellula intera viene utilizzato per monitorare il movimento degli ioni.

Elettrofisiologia optogenetica Registrazione di cellule con canali ionici dipendenti dalla luce

Descriviamo la preparazione di sottili fettine di retina da acquatico salamandre tigre...

Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Lo scopo di questo video è dimostrare procedure per ottenere cellule sane capelli intatte dagli organi dell'orecchio interno di zebrafish adulti e poi li utilizzano per studi di patch clamp per caratterizzare le proprietà biofisiche di loro canali voltaggio-dipendenti.

Registrazioni patch clamp in cellule interne dell&#39;orecchio Capelli Isolato da Zebrafish

Impara la registrazione patch-clamp intere cellule per determinare la selettività ionica dei channelrhodopsin in cellule HEK293. Questo metodo elettrofisiologico fornisce misurazioni dirette delle proprietà biofisiche dei canali.

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

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