Name: Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Impara la registrazione patch-clamp intere cellule per determinare la selettività ionica dei channelrhodopsin in cellule HEK293. Questo metodo elettrofisiologico fornisce misurazioni dirette delle proprietà biofisiche dei canali.

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Ringraziamo Maila Reh, Tharsana Tharmalingam e specialmente Altina Klein per un&#39;ottima assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione di Ricerca Tedesca (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) e il Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) e E4 (PH).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Determinazione dei potenziali di inversione a condizioni ioniche e elettriche definite fornisce informazioni sulle specie ioniche trasportate dopo l&#39;attivazione luminosa dei ChRs. Se solo una specie di ioni varia in un complesso complesso fisiologico e il potenziale di inversione ottenuto si sposta in base al potenziale teorico di Nernst, questa specie ione è l&#39;unico trasportato. Tuttavia, per i ChRs, i cambi potenziali di inversione sono generalmente meno pronunciati di quelli previ...

Channelrhodopsins (ChR) sono canali ionici leggeri che si verificano nel punto di occhio delle alghe verdi motile e servono come fotosensori primari per fototassi e risposte fobiche 1 . Dalla loro prima descrizione nel 2002 2 , i ChRs hanno aperto la strada per il campo emergente dell&#39;ottogenetica e possono essere applicati in una varietà di cellule eccitabili, ad es. Nei muscoli scheletrici, nel cuore o nel cervello 3 , 4 , 5 . L&#39;espressione di ChRs nelle cellule bersaglio produce una permeabilità ionica controllabile dalla luce della rispettiva cellula. In un contesto neuronale, questo consente l&#39;attivazione 6 , 7 , 8 o inibizione 9 , 10 di cottura del potenziale d&#39;azione (AP) - a seconda dello ione condotto - con lo spazio e temporaliPrecisione della luce sottolineando come la selettività ionica di una variante ChR determina l&#39;applicazione ottogenetica. I primi ChRs scoperti da Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri sono permeabili a protoni, ma anche a cationi monovalenti come il sodio, il potassio e, in misura minore, a cationi bivalenti come il calcio e il magnesio 11 , 12 , 13 . Oggi, più di 70 cantipolisini naturali (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 e varie varianti progettate 18 , 19 , 20 con proprietà diverse come La dimensione fotocirrente, la sensibilità spettrale, la cinetica e la selettività del cation sono disponibili. Mentre nella neuroscienza, CCRs aUtilizzati per attivare le cellule e attivare AP, le pompe microbiche a luce guidata sono stati gli unici antagonisti disponibili per annientare i neuroni. Nel 2014, due gruppi hanno dimostrato simultaneamente che i CCRs possono essere convertiti in channelrhodopsins (ACR) di anion-conducting mediante alterazione della polarità lungo il poro conducente ionico attraverso l&#39;engineering molecolare 9 , 21 . Successivamente, ACR naturali sono stati identificati in diverse alghe di crittophyte 22 , 23 , 24 . Più importante, l&#39;attivazione leggera di ACR mediata dalle correnti di cloruro nei neuroni adulti permette di inibire l&#39;attività neuronale a intensità luminosa molto minori rispetto alle pompe microbiche che trasportano solo singole cariche per fotone assorbito. L&#39;attività di ChR può essere direttamente affrontata mediante registrazioni elettrofisiologiche di patch-clamp di correnti indotte da luce nelle cellule HEK293. La pinzettaLa tecnica è stata originariamente sviluppata alla fine degli anni &#39;70 25 e ulteriormente migliorata da Hamill et al. , Consentendo la registrazione dell&#39;entità delle correnti da una piccola cella (modalità di intera cellula) con alta risoluzione di corrente e controllo diretto della tensione della membrana 26 . Applicata nella coltura cellulare, questa tecnica fornisce un preciso controllo delle condizioni di registrazione ioniche e elettriche e consente di studiare la selettività degli ioni insieme al relativo contributo degli ioni alla corrente totale. Qui esemplifica l&#39;esame della selettività ionica per il channelrhodopsin di Anion -conducting di Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 attraverso la registrazione di relazioni di tensione-corrente in varie concentrazioni di cloruro extracellulare per dimostrare un&#39;elevata conduttanza di cloruro.

<table><tbody><tr><td>Cellule HEK293</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>Cellule renali embrionali umane</td></tr><tr><td>Retinal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>all-trans retinal</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrome</td><td>FG 0445</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>Ponti Agar</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl2 2H2O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Biomol</td><td>2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrome</td><td>S0615</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D(+)-Glucosio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl2 6H2O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-metil-D-glucamina</td></tr><tr><td>Na-aspartato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6683</td><td>Acido L-aspartico sale di sodio monoidrato</td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>XL1Blue E. coli</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>Chemocompetent E. coli</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di lisogenia medio</td><td>Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Roth</td><td>6494</td><td>Piastre di agar</td></tr><tr><td>Kit di purificazione plasmidico</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomicina</td><td>Biocromo</td><td>A 2213</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-D-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>Rivestimento antiscivolo</td></tr><tr><td>di copertura Microforge</td><td>Pipette</td><td></td> sierologiche <td>per lucidatura antincendio</td></tr><tr><td></td><td>su misura TPP</td><td></td><td>Banco pulito</td></tr><tr><td>Banco pulito</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>IKA</td><td>RCT classico</td><td></td></tr><tr><td>Filo d'argento</td><td>Prodotti scientifici</td><td>AG-T25; AG-T10</td><td>Elettrodi, 0,64 mm (bagno); 0,25 mm (elettrodo)</td></tr><tr><td>pH-metro</td><td>Knick</td><td>765 Osmometro calimetrico</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>Lucidatura a fuoco</td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>Binder</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>34 mm interno diametro</td></tr><tr><td>Vetrini Roth</td><td></td><td>P232</td> Termometro <td>diametro 15 mm</td></tr><tr><td>R</td><td>&ouml; nave Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10</td></tr><tr><td>trasmissione Porta pipetta</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Molecular</td><td>Devices</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>DigiData1400</td><td>Convertitore analogico digitale</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa</td><td>TILL Photonics</td><td>Polychrome V</td><td>Set a 540 nm a piena intensità</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>Shutter driver</td><td>Vincent Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Capilarries in vetro</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>Capillari in boresilicato con estremità lucidate a fuoco OD 1,5 mm ID 0,86 mm</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Gestore del bagno</td><td>Lorenz Messger tebau</td><td>MPCU</td><td></td></tr><tr><td>Set di filtri a tripla banda</td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>Filtro a fluorescenza&nbsp; ECFP/EYFP/mCherry&nbsp;</td></tr><tr><td>Telecamera CCD</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>Optometro</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>Misura intensità luminosa</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X/1.0</td></tr><tr><td>DIC Micromanipolatore</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Camera di registrazione</td><td>Alimentazione su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>Evita il rumore elettrico proveniente dall'alimentatore incorporato nel microscopio</td></tr><tr><td>Tavolo isolato dalle vibrazioni</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Gabbia di Faraday</td><td>Su misura o qualsiasi tavolo</td><td></td><td></td>di corrispondenza commerciale</tr><tr><td>Tubi flessibili</td><td>Qualsiasi commerciale; ad esempio Roth</td><td></td><td>Diverse dimensioni e materiali per la manipolazione del bagno e l'applicazione della pressione della pipetta; ponti di agar</td></tr><tr><td>Lineare agitatore</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcolatore del potenziale di giunzione liquida</td><td>Molecular Devices o direttamente da Peter H. Barry</td><td></td><td>Il programma è incluso nel software di acquisizione Clampex o può essere ottenuto da p.barry@unsw.edu.au</td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>Software di valutazione dati</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>PsACR1</td><td>GenBank o Addgene</td><td>KF992074.1 o Addgene plasmide #85465</td><td>Gene encoding for PsACR1</td></tr><tr><td>Guida all'amplificatore</td><td>Molecular Devices</td><td>The Axon Guide</td><td></td></tr></tbody></table>

registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Negli ultimi dieci anni, i channelrhodopsins sono diventati indispensabili nella ricerca neuroscientificale, dove vengono utilizzati come strumenti per manipolare in modo non invasivo i processi elettrici nelle cellule bersaglio. In questo contesto, la selettività ionica di un channelrhodopsin è di particolare importanza. In questo articolo si descrive l&#39;analisi della selettività di cloruro per una scanografia di Proteomonas sulcata recentemente identificata da anion-conducting channel mediante protezioni elettrofisiologiche di patch-clamp sulle cellule HEK293. La procedura sperimentale per misurare le fotocorri luminose richiede una sorgente luminosa rapida - idealmente monocromatica - accoppiata nel microscopio di una configurazione di patch-clamps altrimenti convenzionale. Sono state descritte procedure preparative prima dell&#39;esperimento che prevedono la preparazione di soluzioni tamponate, considerazioni sui potenziali di giunzione liquidi, la semina e la trasfezione delle cellule e la trazione delle pipette patch. La registrazione effettiva della relazione di tensione-correnteS per determinare le potenzialità di inversione per diverse concentrazioni di cloruro si svolge 24 h a 48 h dopo la trasfezione. Infine, i dati elettrofisiologici vengono analizzati rispetto alle considerazioni teoriche della conduzione di cloruro.

<html> La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi ottenuti dalle misurazioni seguendo il protocollo descritto. Durante l&#39;illuminazione con luce verde, Ps ACR1 presenta una corrente transitoria veloce che decade rapidamente a un livello corrente fisso. Dopo la spegnimento della luce, le fotocorrienti decadono a zero entro millisecondi ( Figura 2A ). Scambiare la concentrazione di cloruro extracellulare provoca uno spostamento del potenzial...

Questo articolo descrive come la selettività ionica della canalrodopsina viene determinata con registrazioni elettrofisiologiche di patch-clamp su cellule intere utilizzando cellule HEK293. Qui, viene dimostrata la procedura sperimentale per studiare la selettività del cloruro di una canalrodopsina anionico-selettiva. Tuttavia, la procedura è trasferibile ad altre canalrodopsine di selettività distinta.

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la selettività del cloruro di nuovi canali ionici light-gated. Questo metodo può rispondere a domande chiave nella biofisica delle canalrodopsine come le ampiezze delle fotocorrenti, la cinetica e la selettività ionica. Il vantaggio principale di questa tecnica è la lettura diretta dell'attività del canale biofisico che è veloce e facile da replicare.Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ogni fase della procedura sperimentale, dalla preparazione delle cellule HEK alla registrazione delle fotocorrenti, deve essere ottimizzata. La semina e la transezione delle cellule HEK saranno dimostrate da Altina Klein. Per iniziare questa procedura, pesare i componenti solidi per 100 millilitri di soluzioni tamponate intracellulari e 500 millilitri di soluzioni tamponate extracellulari in becher separati.E poi aggiungere la rispettiva quantità delle soluzioni stock preparate. Successivamente, aggiungere acqua ultrapura e regolare attentamente il pH utilizzando acidi e basi. Quindi regolare l'osmolarità con il glucosio a 290 milliosmoli e 320 milliosmoli rispettivamente per le soluzioni intracellulari ed extracellulari.In questa procedura, posizionare fino a tre vetrini di vetro rivestiti di lisina uno accanto all'altro in una piastra di Petri da 35 millimetri. Quindi seminare da 1,5 volte 10 alla quinta cellula HEK in due millilitri di DMEM standard integrato con il 10% di FBS e un retinolo micromolare in ogni piatto. Per trasfettare le cellule per ogni piatto, preparare una soluzione di due microgrammi di DNA plasmidico in 250 microlitri di DMEM senza FBS e sei microlitri di reagente di trasfezione.Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere delicatamente la soluzione alle cellule. Prima di effettuare la misurazione, estrarre alcune pipette a cerotto a bassa resistenza utilizzando un estrattore per micropipette e lucidarle a fuoco. Conservare le pipette in un contenitore privo di polvere per il giorno della misurazione.30 minuti prima delle registrazioni, accendere tutti i componenti di configurazione per riscaldarli alla temperatura di lavoro. Assicurarsi che i tamponi siano a temperatura ambiente. Per iniziare, sigillare la camera di misura con silicone per evitare perdite dal tampone esterno.Quindi posizionare un vetrino coprioggetti nella camera e chiuderlo. Riempire accuratamente la camera con tampone extracellulare per evitare che le cellule si stacchino. Conserva la capsula di Petri con altri vetrini coprioggetti in un'incubatrice per la prossima serie di esperimenti.Quindi posizionare la camera di misura sotto il microscopio utilizzando l'obiettivo 40X per la visualizzazione cellulare. Posizionare quindi un ponte a coclea sull'elettrodo del bagno e posizionarlo nella camera insieme al sensore di livello del fluido e all'uscita di perfusione del gestore del bagno. Sostituire la soluzione extracellulare due volte con un millilitro di soluzione esterna fresca per rimuovere il terreno di coltura residuo e le cellule staccate.Metti a fuoco le cellule e cerca una cellula trasfettata che deve essere isolata dalle altre cellule. Quindi utilizzare un set di filtri a tripla banda e una luce arancione per eccitare e visualizzare mCherry. Quindi, riempire una delle pipette estratte con la soluzione intracellulare.E rimuovere le bolle d'aria capovolgendo più volte la pipetta. Successivamente, montare la pipetta sul supporto della pipetta e applicare una pressione positiva per evitare l'intasamento della punta. Individuare la punta della pipetta per cerotti sotto il microscopio e spostarla vicino alla cellula utilizzando il micromanipolatore.All'interno del software di acquisizione dati, avviare il test della membrana in modalità Bath e applicare un passo di tensione. Controllare se la resistenza della pipetta è compresa nell'intervallo desiderato da 1,3 a 3,0 megaohm. Quindi azzerare le correnti di offset e regolare il potenziale della pipetta ruotando la manopola di offset della pipetta sull'amplificatore.Per stabilire un cerotto nella configurazione a cellula intera, avvicinarsi lentamente alla cellula con la pipetta a cerotto dall'alto e rilasciare la pressione positiva subito prima di toccare la cellula. A volte la configurazione attaccata alla cella si forma da sola. Dopo esserti avvicinato alla cella, cambia il test della membrana dalla modalità Bath alla modalità Patch.Compensare la capacità della pipetta ruotando la manopola di compensazione della capacità della pipetta per ottenere una risposta piatta dell'impulso di prova. Impostare il test della membrana in modalità Cella. Quindi rompere il cerotto senza distruggere il sigillo applicando brevi impulsi di pressione negativa o pressione negativa con forza crescente per ottenere la conferma dell'intera cella.Avvia la compensazione della resistenza in serie impostando i due parametri dell'intera cella, la capacità della cella e la resistenza in serie. Nel pannello di compensazione della resistenza in serie, attivare la previsione e la correzione fino al 90%, quindi attivare l'interruttore di compensazione dell'intera cella e regolare i parametri dell'intera cella in modo iterativo per ottenere una risposta di tenuta di prova idealmente piatta. Dopo aver stabilito la configurazione dell'intera cellula, attendere almeno due minuti prima della registrazione per garantire una sostituzione sufficiente della soluzione intracellulare attraverso la pipetta del cerotto.Registra le correnti indotte dalla luce a diversi potenziali di mantenimento. Quindi scambiare il tampone extracellulare con un basso cloruro nella camera almeno cinque volte senza distruggere il cerotto e registrare un'altra relazione di tensione di corrente alla nuova concentrazione di cloruro. Questa figura mostra che durante l'illuminazione con luce verde, PsACR1 presenta una corrente transitoria veloce che decade rapidamente a un livello di corrente stazionaria.Dopo che la luce è stata spenta, le fotocorrenti decadono a zero in pochi millisecondi. La riduzione della concentrazione extracellulare di cloruro abolisce completamente le correnti fotografiche dirette verso l'esterno. Lo scambio della concentrazione extracellulare di cloruro provoca uno spostamento del potenziale di inversione che può essere dedotto da un grafico di tensione di corrente.La valutazione dei potenziali di inversione da più misurazioni quantifica il drammatico spostamento del potenziale di inversione causato dalla variazione della concentrazione esterna di cloruro. Sorprendentemente, i potenziali di inversione misurati corrispondono direttamente ai potenziali di Nernst calcolati per il cloruro, il che conferma l'elevata selettività del cloruro di PsACR1. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire registrazioni elettrofisiologiche di fotocorrenti indotte dalla luce su cellule HEK che esprimono canalrodopsina.Una volta padroneggiata, l'intera procedura può essere eseguita in quattro giorni, mentre la registrazione delle fotocorrenti richiede diverse ore. A complemento di questa procedura, la mutagenesi sito-specifica e i metodi spettroscopici possono essere eseguiti per chiarire ulteriormente le caratteristiche strutturali e i meccanismi cellulari delle canalrodopsine. La caratterizzazione e l'ingegneria molecolare della canalrodopsina hanno aperto la strada ai ricercatori in neuroscienze per manipolare l'eccitabilità di neuroni selezionati dalla luce.

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Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

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