Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la selettività del cloruro di nuovi canali ionici light-gated. Questo metodo può rispondere a domande chiave nella biofisica delle canalrodopsine come le ampiezze delle fotocorrenti, la cinetica e la selettività ionica. Il vantaggio principale di questa tecnica è la lettura diretta dell'attività del canale biofisico che è veloce e facile da replicare.

Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ogni fase della procedura sperimentale, dalla preparazione delle cellule HEK alla registrazione delle fotocorrenti, deve essere ottimizzata. La semina e la transezione delle cellule HEK saranno dimostrate da Altina Klein. Per iniziare questa procedura, pesare i componenti solidi per 100 millilitri di soluzioni tamponate intracellulari e 500 millilitri di soluzioni tamponate extracellulari in becher separati.

E poi aggiungere la rispettiva quantità delle soluzioni stock preparate. Successivamente, aggiungere acqua ultrapura e regolare attentamente il pH utilizzando acidi e basi. Quindi regolare l'osmolarità con il glucosio a 290 milliosmoli e 320 milliosmoli rispettivamente per le soluzioni intracellulari ed extracellulari.

In questa procedura, posizionare fino a tre vetrini di vetro rivestiti di lisina uno accanto all'altro in una piastra di Petri da 35 millimetri. Quindi seminare da 1,5 volte 10 alla quinta cellula HEK in due millilitri di DMEM standard integrato con il 10% di FBS e un retinolo micromolare in ogni piatto. Per trasfettare le cellule per ogni piatto, preparare una soluzione di due microgrammi di DNA plasmidico in 250 microlitri di DMEM senza FBS e sei microlitri di reagente di trasfezione.

Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere delicatamente la soluzione alle cellule. Prima di effettuare la misurazione, estrarre alcune pipette a cerotto a bassa resistenza utilizzando un estrattore per micropipette e lucidarle a fuoco. Conservare le pipette in un contenitore privo di polvere per il giorno della misurazione.

30 minuti prima delle registrazioni, accendere tutti i componenti di configurazione per riscaldarli alla temperatura di lavoro. Assicurarsi che i tamponi siano a temperatura ambiente. Per iniziare, sigillare la camera di misura con silicone per evitare perdite dal tampone esterno.

Quindi posizionare un vetrino coprioggetti nella camera e chiuderlo. Riempire accuratamente la camera con tampone extracellulare per evitare che le cellule si stacchino. Conserva la capsula di Petri con altri vetrini coprioggetti in un'incubatrice per la prossima serie di esperimenti.

Quindi posizionare la camera di misura sotto il microscopio utilizzando l'obiettivo 40X per la visualizzazione cellulare. Posizionare quindi un ponte a coclea sull'elettrodo del bagno e posizionarlo nella camera insieme al sensore di livello del fluido e all'uscita di perfusione del gestore del bagno. Sostituire la soluzione extracellulare due volte con un millilitro di soluzione esterna fresca per rimuovere il terreno di coltura residuo e le cellule staccate.

Metti a fuoco le cellule e cerca una cellula trasfettata che deve essere isolata dalle altre cellule. Quindi utilizzare un set di filtri a tripla banda e una luce arancione per eccitare e visualizzare mCherry. Quindi, riempire una delle pipette estratte con la soluzione intracellulare.

E rimuovere le bolle d'aria capovolgendo più volte la pipetta. Successivamente, montare la pipetta sul supporto della pipetta e applicare una pressione positiva per evitare l'intasamento della punta. Individuare la punta della pipetta per cerotti sotto il microscopio e spostarla vicino alla cellula utilizzando il micromanipolatore.

All'interno del software di acquisizione dati, avviare il test della membrana in modalità Bath e applicare un passo di tensione. Controllare se la resistenza della pipetta è compresa nell'intervallo desiderato da 1,3 a 3,0 megaohm. Quindi azzerare le correnti di offset e regolare il potenziale della pipetta ruotando la manopola di offset della pipetta sull'amplificatore.

Per stabilire un cerotto nella configurazione a cellula intera, avvicinarsi lentamente alla cellula con la pipetta a cerotto dall'alto e rilasciare la pressione positiva subito prima di toccare la cellula. A volte la configurazione attaccata alla cella si forma da sola. Dopo esserti avvicinato alla cella, cambia il test della membrana dalla modalità Bath alla modalità Patch.

Compensare la capacità della pipetta ruotando la manopola di compensazione della capacità della pipetta per ottenere una risposta piatta dell'impulso di prova. Impostare il test della membrana in modalità Cella. Quindi rompere il cerotto senza distruggere il sigillo applicando brevi impulsi di pressione negativa o pressione negativa con forza crescente per ottenere la conferma dell'intera cella.

Avvia la compensazione della resistenza in serie impostando i due parametri dell'intera cella, la capacità della cella e la resistenza in serie. Nel pannello di compensazione della resistenza in serie, attivare la previsione e la correzione fino al 90%, quindi attivare l'interruttore di compensazione dell'intera cella e regolare i parametri dell'intera cella in modo iterativo per ottenere una risposta di tenuta di prova idealmente piatta. Dopo aver stabilito la configurazione dell'intera cellula, attendere almeno due minuti prima della registrazione per garantire una sostituzione sufficiente della soluzione intracellulare attraverso la pipetta del cerotto.

Registra le correnti indotte dalla luce a diversi potenziali di mantenimento. Quindi scambiare il tampone extracellulare con un basso cloruro nella camera almeno cinque volte senza distruggere il cerotto e registrare un'altra relazione di tensione di corrente alla nuova concentrazione di cloruro. Questa figura mostra che durante l'illuminazione con luce verde, PsACR1 presenta una corrente transitoria veloce che decade rapidamente a un livello di corrente stazionaria.

Dopo che la luce è stata spenta, le fotocorrenti decadono a zero in pochi millisecondi. La riduzione della concentrazione extracellulare di cloruro abolisce completamente le correnti fotografiche dirette verso l'esterno. Lo scambio della concentrazione extracellulare di cloruro provoca uno spostamento del potenziale di inversione che può essere dedotto da un grafico di tensione di corrente.

La valutazione dei potenziali di inversione da più misurazioni quantifica il drammatico spostamento del potenziale di inversione causato dalla variazione della concentrazione esterna di cloruro. Sorprendentemente, i potenziali di inversione misurati corrispondono direttamente ai potenziali di Nernst calcolati per il cloruro, il che conferma l'elevata selettività del cloruro di PsACR1. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire registrazioni elettrofisiologiche di fotocorrenti indotte dalla luce su cellule HEK che esprimono canalrodopsina.

Una volta padroneggiata, l'intera procedura può essere eseguita in quattro giorni, mentre la registrazione delle fotocorrenti richiede diverse ore. A complemento di questa procedura, la mutagenesi sito-specifica e i metodi spettroscopici possono essere eseguiti per chiarire ulteriormente le caratteristiche strutturali e i meccanismi cellulari delle canalrodopsine. La caratterizzazione e l'ingegneria molecolare della canalrodopsina hanno aperto la strada ai ricercatori in neuroscienze per manipolare l'eccitabilità di neuroni selezionati dalla luce.