Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi

L'obiettivo generale di questo esperimento di microscopia a forza atomica è quello di risolvere le interazioni delle proteine di riparazione del DNA con i siti di danno nel DNA e di distinguere tra diverse interazioni del DNA da parte di vari complessi proteici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione del DNA, come ad esempio il modo in cui un particolare sistema di riparazione del DNA raggiunge il riconoscimento delle sue lesioni bersaglio nel DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo vedere e analizzare direttamente i diversi tipi di complessi coinvolti nel processo di riconoscimento delle lesioni al DNA.

A dimostrare la procedura sarà Nicolas Wirth, che ha utilizzato questo approccio durante la sua ricerca di laurea. Per iniziare, preparare un substrato di DNA adatto generando un gap di DNA a filamento singolo in un plasmide. Riempi lo spazio vuoto con oligonucleotidi di DNA modificati a filamento singolo e, infine, linearizza il DNA plasmatico utilizzando enzimi di restrizione appropriati.

Per questi esperimenti, i substrati di DNA a doppio filamento sono lunghi circa 1.000 paia di basi e contengono una lesione del DNA e una regione spaiata chiamata bolla di DNA per il caricamento delle proteine sul DNA. Successivamente, preparare un campione di DNA proteico per l'analisi AFM pipettando prima 10x Reaction Buffer e acqua in una provetta di microreazione. Quindi, aggiungi il DNA e le proteine oggetto di indagine.

Ad esempio, qui, 100 nanomolari del campione di DNA e un micromolare o ciascuno dei nucleotidi eucariotici proteine di riparazione per escissione nucleotidica XPD e p44. Quindi, incubare la reazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un blocco di calore. Dopo l'incubazione, centrifugare brevemente il campione.

Quindi, preparare un substrato di mica su cui posizionare il campione. Usa un bisturi per tagliare un pezzo di mica di un centimetro per un centimetro da una striscia più grande. Quindi, utilizzare un pezzo di nastro adesivo per rimuovere gli strati superiori della mica per rivelare una superficie del substrato pulita, piatta e anatomicamente liscia.

Dilatare il campione di DNA proteico da cinquanta a cento volte nel tampone di deposizione AFM e depositare immediatamente 20 microlitri del campione diluito sulla superficie della mica. Il fattore di diluizione dipende dalla concentrazione del campione. Subito dopo aver depositato il campione sulla superficie di mica, sciacquare il campione tre o quattro volte con alcuni millilitri di acqua filtrata e deionizzata e asciugare il liquido in eccesso.

Utilizzare un getto delicato di azoto per asciugare il campione. Infine, utilizzare del nastro adesivo per fissare il campione ai bordi su un vetrino da microscopio. Posizionare il campione al centro del tavolino AFM e utilizzare cuscinetti magnetici per fissare il vetrino del microscopio sul tavolino.

Quindi, inserire la punta AFM nel supporto della punta. Fissare la punta nel supporto sotto un morsetto serrando la vite in modo che sia serrata a mano. Una volta fissato, inserire il supporto della punta nella testa di misurazione AFM.

Utilizzare le viti di posizionamento per spostare il campione in posizione centrale. Posizionare la testa di misurazione AFM sopra il campione, assicurandosi che la testa stia stabile con le gambe all'interno delle rientranze del tavolino. Quindi, allineare il laser AFM sul retro del cantilever per una potenza del segnale ottimale.

Guardate il segnale di riflessione nella finestra video AFM per posizionare grossolanamente il laser. Per questo modello AFM, girare le ruote del lato destro e posteriore della testa di misurazione AFM per regolare le posizioni X e Y del laser AFM in modo da dirigerlo centralmente sull'estremità del cantilever. Quindi, ottimizza il segnale di somma del rivelatore regolando con precisione la posizione del laser con le due ruote.

Dirigere la riflessione laser AFM sul centro del rivelatore azzerando il segnale diverso dai diodi superiore e inferiore dell'array di rivelatori. Per questo passaggio, ruotare la vite sul lato sinistro della testa di misurazione per questo modello AFM. Quindi, determinare la frequenza di residenza a sbalzo accedendo alla finestra di sintonizzazione del pannello master nel software.

Scegliere un'ampiezza corrispondente a un ingresso di una volt per il piezo che aziona l'oscillazione a sbalzo e quindi impostare la frequenza di oscillazione su un valore negativo del 5%, leggermente inferiore alla frequenza di residenza. Ora esegui una sintonizzazione automatica della frequenza e azzera la fase dell'oscillazione. Lasciare che il sistema raggiunga l'equilibrio termico per circa un'ora prima di iniziare l'imaging, al fine di evitare deriva.

Quando si è pronti per iniziare l'imaging, nel pannello principale del software, impostare un set point di protezione e prepararsi ad avvicinare la punta alla superficie del campione selezionando Attiva. Abbassare manualmente la ruota anteriore della testa AFM fino a raggiungere l'impostazione di protezione, o set point. Quindi, abbassare ulteriormente con cautela la ruota anteriore fino a quando il segnale del sensore Z non è completamente esteso a sinistra.

Attivare la tabella di oscillazione delle vibrazioni e chiudere l'involucro di isolamento acustico. Quindi, abbassare il set point nel software AFM utilizzando la ruota per criceti per impegnare con precisione la punta AFM con il campione. Per eseguire l'imaging in modalità tapping in regime repulsivo, abbassare il set point fino a quando il segnale di fase diventa leggermente inferiore alla fase di livello libero.

Quindi, iniziare la scansione del campione. Utilizzare la velocità di scansione di 2,5 micrometri al secondo in aree di superficie dell'immagine di quattro micrometri per quattro micrometri o otto micrometri per otto micrometri quadrati con risoluzioni di pixel rispettivamente di 2, 048 o 4.096; e premere il pulsante Esegui scansione. Preseleziona i complessi proteici di DNA rilevanti mediante ispezione visiva diretta delle immagini nel software AFM.

Per i campioni di XPD, i possibili complessi includono XPD p44 DNA, nonché XPD DNA e p44 DNA con dimensioni nettamente diverse a causa delle diverse masse molecolari di XPD e p44. Misura i volumi dei singoli picchi proteici sul DNA utilizzando lo strumento di sezione nella finestra di analisi per misurare l'altezza e il diametro delle sezioni dei picchi proteici con i cursori della finestra di sezione. Utilizzare questi valori per determinare il volume dei picchi utilizzando semplici modelli matematici per verificare il tipo complesso.

Infine, calibra il tuo sistema AFM con una gamma di proteine con pesi molecolari noti per tradurre questi volumi in pesi molecolari approssimativi di proteine e complessi proteici. Per determinare ulteriori caratteristiche, come la lunghezza dei frammenti di DNA, le posizioni dei complessi proteici sul DNA e le loro specificità del sito bersaglio o gli angoli di banda del DNA, vedere il protocollo di testo allegato. Qui è mostrata un'immagine AFM con tre diversi tipi di complessi legati al DNA che possono essere distinti in base alle loro diverse dimensioni.

I complessi di classe uno sono coerenti solo con il cofattore attivante l'elicasi p44, i complessi di classe due sono costituiti solo dalla proteina XPD e i complessi di classe tre sono costituiti sia da XPD che da p44 poiché il riconoscimento legione da parte di XPD richiede l'attivazione della sua attività elicasica da parte di p44 e solo i complessi di classe tre mostrano il riconoscimento della lesione. Al fine di identificare diverse strategie di riconoscimento delle lesioni, le posizioni delle proteine sui substrati del DNA sono state misurate per il carico di proteine in una bolla di DNA nelle cinque direzioni principali o nelle tre direzioni principali da una lesione del DNA mostrata in rosso per le elicasi NER procariotiche ed eucariotiche. Nelle distribuzioni di posizione delle proteine, il riconoscimento della lesione del DNA può essere visto come un picco dovuto al maggiore legame nella posizione della lesione del DNA.

L'elicasi procariotica NER UVRB e la sua controparte eucariotica, XPD, mostrano diverse strategie di riconoscimento delle lesioni CPD che indicano diverse preferenze per il filamento di DNA. In particolare, le lesioni CPD sono riconosciute sul filamento traslocato da UVRB, ma preferenzialmente sul filamento opposto, non traslocato da XPD. Una volta padroneggiato, questo metodo può essere eseguito in poche ore o giorni, compresa l'analisi.

È importante lavorare con campioni di proteine e DNA altamente puri per essere in grado di interpretare le caratteristiche nelle immagini AFM e progettare attentamente il substrato del DNA a seconda del sistema biologico e della domanda che si desidera affrontare. Inoltre, i metodi di ensemble, come l'elettroforesi su gel spaziale, lo spostamento dell'elettromobilità o i saggi di incisione del DNA sono, ovviamente, altamente complementari a questi esperimenti AFM; e questi metodi possono aiutare a rispondere a ulteriori domande, come le affinità di legame al DNA o le attività di escissione delle lesioni al DNA. Questa tecnica è un approccio relativamente veloce e semplice per visualizzare direttamente i complessi proteici del DNA, e questi complessi ci danno un buon quadro dei processi che avvengono in un sistema biologico.

Naturalmente, questo non è solo utile per comprendere i processi di riparazione del DNA, ma può anche essere applicato ad altri sistemi di DNA proteico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea abbastanza buona di come preparare un campione sul tuo sistema di DNA proteico preferito, di come visualizzarlo tramite AFM e di come estrarre parametri utili per un'interpretazione dei tuoi dati.