Name: Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Scopri come la microscopia a forza atomica rivela le interazioni tra proteine di riparazione del DNA e siti di danno. Questo metodo permette di visualizzare direttamente i complessi proteici coinvolti nel riconoscimento delle lesioni nel sistema di riparazione per escissione dei nucleotidi.

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PUC19N, oligonucleotidi contenenti CPD e p44 sono stati gentilmente forniti da Samuel Wilson, Korbinian Heil e Thomas Carell, e rispettivamente da Gudrun Michels e Caroline Kisker. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 e TE-671/4 a IT.

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<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes%3A+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li>
<li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Analisi statistiche AFM di posizioni di legame di proteine ​​su lunghi frammenti di DNA che contengono siti target specifici possono rivelare dettagli interessanti sulle strategie particolari impiegate dalla proteina per riconoscere questi siti 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Per interpretare le distribuzioni di posizione risultanti, le posizioni degli obiettivi nel DNA ...

La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica potente per l&#39;analisi delle interazioni proteine-DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Richiede solo basse quantità di materiale di campionamento per visualizzare direttamente campioni eterogenei con una risoluzione a livello di singola molecola. L&#39;eterogeneità può derivare da diversi stati conformazionali o oligomerici di una proteina. In particolare, nel contesto di campioni di proteine-DNA, i complessi proteici possono mostrare diverse stoichiometrie e / o conformazioni indotte dal legame del DNA in generale o che si legano ad un sito target specifico all&#39;interno del DNA. I campioni eterogenei possono anche contenere due (o più) diversi tipi di proteine ​​e diversi complessi proteiciForme ( ad esempio , costituite da un solo tipo di proteine ​​contro complessi eteromerici) possono interagire in modo diverso con il DNA. Gli studi qui discussi sfruttano l&#39;imaging AFM in aria su campioni statici e secchi di proteine ​​di riparazione del DNA legate a lunghi frammenti di DNA (~ 900 base paia, bp) che contengono una lesione che rappresenta un obiettivo di queste proteine. L&#39;elevata risoluzione molecolare di AFM consente di distinguere tra diversi tipi di complessi proteici e di determinare le posizioni di legame delle proteine ​​sui frammenti del DNA. Importante, le lesioni vengono introdotte nei substrati del DNA a posizioni ben definite. Poiché la posizione del sito di lesione nel DNA è nota, le distribuzioni di proteine ​​legate al DNA forniscono una visione delle proprietà di riconoscimento delle diverse lesioni (differenti) dei complessi proteici (diversi), ad esempio , quanto bene riconoscono un particolare tipo di lesione A DNA non danneggiato) 2 , 3 , <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 4 , 5 , 6 . Le loro posizioni sul DNA permettono anche la distinzione tra i complessi proteici legati specificamente alle lesioni e ai complessi legati in modo non specifico altrove sul DNA. La caratterizzazione separata di questi diversi tipi complessi (complessi legati specificamente al complesso lesionario o non specifico) possono rivelare potenziali variazioni conformazionali nei complessi indotti dall&#39;identificazione del sito di destinazione. Le proteine ​​di riparazione del DNA concentrate qui sono le elicasi che sono responsabili del riconoscimento delle lesioni nel percorso di riparazione delle escisioni del nucleotide (NER). Nei batteri, il NER è ottenuto dalle proteine ​​UvrA, UvrB e UvrC. UvrA è responsabile della rilevazione iniziale delle lesioni in un complesso di scansione DNA di UvaA 2 / UvrB 2 . Alla verifica della lesione da UvrB questo complesso si converte in UvrB monomerico legato al sito della lesione e questo complesso specifico può quindi reclutare la pRocaryotic NER endonucleasi UvrC. UvrC eccisce un breve tratto (12-13 nt) di DNA a singolo filamento (ssDNA) contenente la lesione. Il tratto mancante viene poi riempito dalla DNA polimerasi. Infine, la ligasi DNA sigilla il tratto appena sintetizzato con il DNA originale 9 , 10 . Negli eucarioti, la maggior parte delle proteine ​​della cascata NER fa parte del complesso multimerico di trascrizione II H (TFIIH). Dopo la rilevazione iniziale della lesione attraverso il complesso trimerico CEN2-XPC-HR23B, TFIIH viene reclutato nel sito di destinazione del DNA. Quando XPD all&#39;interno del complesso verifica la presenza di una lesione target NER, le endonucleasi eerichee NER XPG e XPF vengono reclutate per accusare un breve tratto (24-32 nt) di ssDNA contenente la lesione 9 , 10 . Qui, in particolare, sono state studiate le elicasi UvrB e XPD da NER prokaryotico e eucariotico. Queste elicasi richiedono una regione non distinta nellaDNA (una bolla del DNA) per filettare su uno dei due singoli filamenti del DNA e successivamente traslocare lungo questa fili alimentata da idrolisi ATP. Oltre alle lesioni del DNA, una bolla del DNA è stata quindi introdotta nei substrati che funge da luogo di caricamento per le proteine. La procedura per la preparazione di substrati specifici del DNA della lesione è stata descritta in precedenza 11 . Richiede un costrutto circolare del DNA (plasmide) con due siti di restrizione strettamente distanziati per un nickase. Nel contesto di questo studio è stato utilizzato il plasmide pUC19N (2729 bp) (creato dal laboratorio di S. Wilson, NIEHS). Questo plasmide contiene tre siti di restrizione strettamente distanziati per la nickel Nt.BstNBI che costituiscono un tratto di 48 nucleotidi (nt). Dopo l&#39;incubazione con il nickase, il tratto di ssDNA tra questi siti può essere rimosso e sostituito da un oligonucleotide contenente qualsiasi caratteristica di destinazione. Dopo ogni passaggio, la digestione enzimatica completa viene testata mediante gel agarosioelettroforesi. Il DNA circolare nichelato può essere distinto a causa della sua minore mobilità elettroforetica rispetto al plasmide originale supercoiled. Lo scorrimento del DNA e la sostituzione del tratto rimosso con l&#39;oligonucleotide specifico del substrato possono essere valutati tramite la digestione con un enzima di restrizione che incide il substrato esclusivamente all&#39;interno della regione tra i nicchie. La linearizzazione del plasmide circolare da parte dell&#39;enzima verrà quindi soppressa per il DNA scompattato e ripristinato dopo l&#39;inserimento del oligonucleotide specifico. Infine, due siti di restrizione endonucleasi (idealmente taglienti singoli) consentono la generazione di un substrato lineare del DNA, con lunghezza come desiderato e con il sito target specifico in una posizione definita, nonché una bolla del DNA a distanza dalla lesione in 5 &#39;O 3&#39; direzione. Il riconoscimento delle lesioni da parte delle elicasi NER può essere studiato tramite l&#39; imaging AFM. La traslocazione del DNA degli alligati a tIl sito della lesione è visibile come un picco nella distribuzione della posizione proteica sul DNA e indica il riconoscimento della lesione. Poiché la traslocazione del DNA di queste elicasi è inoltre direzionale, con polarità 5&#39;-3 &#39;, la dipendenza del riconoscimento della lesione sulla posizione del sito di carico (bolla del DNA a monte oa valle della lesione) indica anche se la lesione è preferenzialmente riconosciuta Sullo strato ssDNA traslocato o al contrario, non traslocato , 5 , 9 . Nelle sezioni seguenti vengono introdotti i metodi utilizzati e saranno discussi brevemente i principali risultati di questi esperimenti. Importante, analogo al lavoro esemplare sulla riparazione del DNA mostrato qui, l&#39;imaging AFM può essere applicato allo studio di diversi sistemi interattivi del DNA, come la replicazione del DNA o la trascrizione 8 , 12 , 13 , 14 </sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>Sonda a forza molecolare (MFP) 3D</td><td>Asylum Research</td><td>N/A microscopio</td> a <td>forza atomica (AFM)</td></tr><tr><td>Precision 390</td><td>DELL</td><td>N/A</td><td>computer</td></tr><tr><td>ThermoMixer e blocco da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>blocco termico per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>Rotilabo Block-Heater H 250 e blocchi per provette da 0,5 mL</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Y264.1 & Y267.1</td><td>blocco termico per incubazioni di proteine-DNA</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1704467</td><td>camera per elettroforesi con colata di gel e alimentatore</td></tr><tr><td>Power Pac Basic</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1645050</td><td>alimentatore per elettroforesi</td></tr><tr><td>Centifuge 5415 D con rotore</td><td>Eppendorf</td><td>2262120-3</td><td>centrifuga da tavolo</td></tr><tr><td>Ultra-Lum elettronico UV transillumonator MEB-15</td><td>Ultralum</td><td>900-1322-02</td><td>Tavolo di irradiazione UV</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>N/A</td><td>Spettrofotometro UV</td></tr><tr><td>TKAX-CAD con 0,2 &; m capsula filtrante</td><td>Unity Lab Services</td><td>N/A unità</td> di <td>deionizzazione e filtraggio dell'acqua</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP su Igor Pro</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>AFM software</td></tr><tr><td>ImageJ (open source Java elaborazione di immagini)</td><td>NIH Image</td><td>N/A</td><td>Software di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Excel (Microsoft Office)</td><td>Microsoft Corporation</td><td>N/A</td><td>software di analisi dei dati</td></tr><tr><td>Origin9 / Origin2016</td><td>OriginLab Corporation</td><td>N/A Software</td><td>di analisi statistica dei dati e grafici</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</ forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMCL-AC240TS</td><td>Olympus</td><td>OMCL-AC240TS</td><td>AFM a sbalzo</td></tr><tr><td>grado V-5 muscovite</td><td>SPI Forniture</td><td>1805</td><td>fogli di mica</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL 50k</td><td>Ultracell Millipore Ireland Ltd.</td><td>UFC505096</td><td>filtri per centrifughe</td></tr><tr><td>NucleoSpin Extract II&nbsp;</td><td>&nbsp; Macherey-Nagel GmbH</td><td>740 609.250</td><td>Kit di estrazione su gel di agarosio</td></tr><tr><td>Carta di cellulosa Rotilabo tipo 111A</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AP59.1</td><td>Carta assorbente per deposizione AFM</td></tr><tr><td>Anatop 25 (0,02 &mu; m)</td><td>Whatman GmbH</td><td>6809-2102</td><td>filtro per siringa</td></tr><tr><td>SSpI, BspQI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0132, R0712</td><td>enzimi di restrizione per la preparazione del substrato del DNA</td></tr><tr><td>XhoI, BglII</td><td></td><td>R0146, R0144</td><td>enzimi di restrizione per la preparazione del DNA controlli</td></tr><tr><td>intaccamento enzima di restrizione Nt.BstNBI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0607</td><td>nickase</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0202S</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>Tris, HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855, 9105</td><td>sostanze chimiche tampone</td></tr><tr><td>NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957, HN03, HN02, P026</td><td>sostanze chimiche saline</td></tr><tr><td>NaAc</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>32318</td><td>sostanze chimiche saline</td></tr><tr><td>DTT, TCEP, EDTA</td><td></td><td>6908, HN95, 8040</td><td>sostanze chimiche/ reagenti</td></tr><tr><td>agarosio, acido acetico, HCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2267, 3738, K025</td><td>reagenti</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K054</td><td>nucleotidi</td></tr><tr><td>oligonucleotide #1 nella Tabella 1</td><td>Biomeri</td> DNA complementari <td>personalizzati</td><td>oligonucleotidi oligonucleotidi</td></tr><tr><td>#2, #3 e #6 nella Tabella 1</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>fluoresceina personalizzata contenente oligonucleotidi</td></tr><tr><td>oligonucleotidi #4&nbsp; e #5 nella Tabella 1</td><td>privato (disponibile ad esempio da TriLink o GlenResearch)</td><td></td><td>CPD contenente oligonucleotidi</td></tr><tr><td>Provetta di reazione SafeSeal 0,5 mL e 1,5 mL</td><td>Provette di incubazione</td><td>Sarstedt</td><td>72.704 e 72.706</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>Scala del DNA</td></tr><tr><td>6x colorante concentrato di caricamento del gel viola</td><td>Nuovo Inghilterra Biolabs (NEB)</td><td>51406</td><td>colorante di caricamento del DNA</td></tr><tr><td>Midori Green&nbsp;</td><td>Nippon Genetics Europe GmbH</td><td>999MG28055</td><td>Colorazione del DNA</td></tr></tbody></table>

microscopia a forza atomica ricerche del riconoscimento delle lesioni del dna nella riparazione di excisione dei nucleotidi

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

L'imaging AFM è una tecnica potente per lo studio delle interazioni proteina-DNA. Questo metodo a singola molecola consente la risoluzione simultanea di diverse molecole e assemblaggi molecolari in un campione eterogeneo. Nel particolare contesto dei sistemi proteici che interagiscono con il DNA, si possono quindi distinguere diverse forme di complessi proteici e le loro corrispondenti posizioni di legame su siti bersaglio contenenti frammenti di DNA. Qui viene presentata un'applicazione dell'AFM allo studio del riconoscimento delle lesioni del DNA nei sistemi di riparazione del DNA (NER) di escissione nucleotidica procariotica ed eucariotica. Vengono descritte le procedure di preparazione dei campioni di DNA e proteine e vengono forniti dettagli sperimentali e analitici degli esperimenti. I dati consentono di trarre importanti conclusioni sulle strategie con cui la verifica del sito bersaglio può essere raggiunta dalle proteine NER. È interessante notare che indicano diversi approcci di riconoscimento e identificazione delle lesioni per il sistema NER eucariotico, a seconda del tipo di lesione. Inoltre, le distinte proprietà strutturali delle due diverse elicasi coinvolte nel NER procariotico ed eucariotico determinano e spiegano le diverse strategie osservate per questi due sistemi. È importante sottolineare che questi approcci sperimentali e analitici possono essere applicati non solo allo studio della riparazione del DNA, ma anche in modo molto simile ad altri sistemi proteici che interagiscono con il DNA, come quelli coinvolti nei processi di replicazione o trascrizione.

Distinguere tra diversi tipi complessi basati su volumi complessi di proteine L&#39;attività elicolare dell&#39;elicasica NER prokaryotica UvrB è stimolata dal legame del DNA 22 , 23 . UvrB richiede una regione non distinta nel DNA (una bolla del DNA) per caricare correttamente su uno dei due singoli fili di ssDNA. In vivo , questa struttura del DNA è fornita dal...

Qui, lo studio di diversi approcci di riconoscimento delle lesioni del DNA tramite l'imaging AFM a singola molecola è dimostrato con il sistema di riparazione per escissione nucleotidica come esempio. Vengono descritte le procedure di preparazione dei campioni di DNA e proteine e i dettagli sperimentali e analitici per gli esperimenti AFM.

Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

L'obiettivo generale di questo esperimento di microscopia a forza atomica è quello di risolvere le interazioni delle proteine di riparazione del DNA con i siti di danno nel DNA e di distinguere tra diverse interazioni del DNA da parte di vari complessi proteici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione del DNA, come ad esempio il modo in cui un particolare sistema di riparazione del DNA raggiunge il riconoscimento delle sue lesioni bersaglio nel DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo vedere e analizzare direttamente i diversi tipi di complessi coinvolti nel processo di riconoscimento delle lesioni al DNA.A dimostrare la procedura sarà Nicolas Wirth, che ha utilizzato questo approccio durante la sua ricerca di laurea. Per iniziare, preparare un substrato di DNA adatto generando un gap di DNA a filamento singolo in un plasmide. Riempi lo spazio vuoto con oligonucleotidi di DNA modificati a filamento singolo e, infine, linearizza il DNA plasmatico utilizzando enzimi di restrizione appropriati.Per questi esperimenti, i substrati di DNA a doppio filamento sono lunghi circa 1.000 paia di basi e contengono una lesione del DNA e una regione spaiata chiamata bolla di DNA per il caricamento delle proteine sul DNA. Successivamente, preparare un campione di DNA proteico per l'analisi AFM pipettando prima 10x Reaction Buffer e acqua in una provetta di microreazione. Quindi, aggiungi il DNA e le proteine oggetto di indagine.Ad esempio, qui, 100 nanomolari del campione di DNA e un micromolare o ciascuno dei nucleotidi eucariotici proteine di riparazione per escissione nucleotidica XPD e p44. Quindi, incubare la reazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un blocco di calore. Dopo l'incubazione, centrifugare brevemente il campione.Quindi, preparare un substrato di mica su cui posizionare il campione. Usa un bisturi per tagliare un pezzo di mica di un centimetro per un centimetro da una striscia più grande. Quindi, utilizzare un pezzo di nastro adesivo per rimuovere gli strati superiori della mica per rivelare una superficie del substrato pulita, piatta e anatomicamente liscia.Dilatare il campione di DNA proteico da cinquanta a cento volte nel tampone di deposizione AFM e depositare immediatamente 20 microlitri del campione diluito sulla superficie della mica. Il fattore di diluizione dipende dalla concentrazione del campione. Subito dopo aver depositato il campione sulla superficie di mica, sciacquare il campione tre o quattro volte con alcuni millilitri di acqua filtrata e deionizzata e asciugare il liquido in eccesso.Utilizzare un getto delicato di azoto per asciugare il campione. Infine, utilizzare del nastro adesivo per fissare il campione ai bordi su un vetrino da microscopio. Posizionare il campione al centro del tavolino AFM e utilizzare cuscinetti magnetici per fissare il vetrino del microscopio sul tavolino.Quindi, inserire la punta AFM nel supporto della punta. Fissare la punta nel supporto sotto un morsetto serrando la vite in modo che sia serrata a mano. Una volta fissato, inserire il supporto della punta nella testa di misurazione AFM.Utilizzare le viti di posizionamento per spostare il campione in posizione centrale. Posizionare la testa di misurazione AFM sopra il campione, assicurandosi che la testa stia stabile con le gambe all'interno delle rientranze del tavolino. Quindi, allineare il laser AFM sul retro del cantilever per una potenza del segnale ottimale.Guardate il segnale di riflessione nella finestra video AFM per posizionare grossolanamente il laser. Per questo modello AFM, girare le ruote del lato destro e posteriore della testa di misurazione AFM per regolare le posizioni X e Y del laser AFM in modo da dirigerlo centralmente sull'estremità del cantilever. Quindi, ottimizza il segnale di somma del rivelatore regolando con precisione la posizione del laser con le due ruote.Dirigere la riflessione laser AFM sul centro del rivelatore azzerando il segnale diverso dai diodi superiore e inferiore dell'array di rivelatori. Per questo passaggio, ruotare la vite sul lato sinistro della testa di misurazione per questo modello AFM. Quindi, determinare la frequenza di residenza a sbalzo accedendo alla finestra di sintonizzazione del pannello master nel software.Scegliere un'ampiezza corrispondente a un ingresso di una volt per il piezo che aziona l'oscillazione a sbalzo e quindi impostare la frequenza di oscillazione su un valore negativo del 5%, leggermente inferiore alla frequenza di residenza. Ora esegui una sintonizzazione automatica della frequenza e azzera la fase dell'oscillazione. Lasciare che il sistema raggiunga l'equilibrio termico per circa un'ora prima di iniziare l'imaging, al fine di evitare deriva.Quando si è pronti per iniziare l'imaging, nel pannello principale del software, impostare un set point di protezione e prepararsi ad avvicinare la punta alla superficie del campione selezionando Attiva. Abbassare manualmente la ruota anteriore della testa AFM fino a raggiungere l'impostazione di protezione, o set point. Quindi, abbassare ulteriormente con cautela la ruota anteriore fino a quando il segnale del sensore Z non è completamente esteso a sinistra.Attivare la tabella di oscillazione delle vibrazioni e chiudere l'involucro di isolamento acustico. Quindi, abbassare il set point nel software AFM utilizzando la ruota per criceti per impegnare con precisione la punta AFM con il campione. Per eseguire l'imaging in modalità tapping in regime repulsivo, abbassare il set point fino a quando il segnale di fase diventa leggermente inferiore alla fase di livello libero.Quindi, iniziare la scansione del campione. Utilizzare la velocità di scansione di 2,5 micrometri al secondo in aree di superficie dell'immagine di quattro micrometri per quattro micrometri o otto micrometri per otto micrometri quadrati con risoluzioni di pixel rispettivamente di 2, 048 o 4.096; e premere il pulsante Esegui scansione. Preseleziona i complessi proteici di DNA rilevanti mediante ispezione visiva diretta delle immagini nel software AFM.Per i campioni di XPD, i possibili complessi includono XPD p44 DNA, nonché XPD DNA e p44 DNA con dimensioni nettamente diverse a causa delle diverse masse molecolari di XPD e p44. Misura i volumi dei singoli picchi proteici sul DNA utilizzando lo strumento di sezione nella finestra di analisi per misurare l'altezza e il diametro delle sezioni dei picchi proteici con i cursori della finestra di sezione. Utilizzare questi valori per determinare il volume dei picchi utilizzando semplici modelli matematici per verificare il tipo complesso.Infine, calibra il tuo sistema AFM con una gamma di proteine con pesi molecolari noti per tradurre questi volumi in pesi molecolari approssimativi di proteine e complessi proteici. Per determinare ulteriori caratteristiche, come la lunghezza dei frammenti di DNA, le posizioni dei complessi proteici sul DNA e le loro specificità del sito bersaglio o gli angoli di banda del DNA, vedere il protocollo di testo allegato. Qui è mostrata un'immagine AFM con tre diversi tipi di complessi legati al DNA che possono essere distinti in base alle loro diverse dimensioni.I complessi di classe uno sono coerenti solo con il cofattore attivante l'elicasi p44, i complessi di classe due sono costituiti solo dalla proteina XPD e i complessi di classe tre sono costituiti sia da XPD che da p44 poiché il riconoscimento legione da parte di XPD richiede l'attivazione della sua attività elicasica da parte di p44 e solo i complessi di classe tre mostrano il riconoscimento della lesione. Al fine di identificare diverse strategie di riconoscimento delle lesioni, le posizioni delle proteine sui substrati del DNA sono state misurate per il carico di proteine in una bolla di DNA nelle cinque direzioni principali o nelle tre direzioni principali da una lesione del DNA mostrata in rosso per le elicasi NER procariotiche ed eucariotiche. Nelle distribuzioni di posizione delle proteine, il riconoscimento della lesione del DNA può essere visto come un picco dovuto al maggiore legame nella posizione della lesione del DNA.L'elicasi procariotica NER UVRB e la sua controparte eucariotica, XPD, mostrano diverse strategie di riconoscimento delle lesioni CPD che indicano diverse preferenze per il filamento di DNA. In particolare, le lesioni CPD sono riconosciute sul filamento traslocato da UVRB, ma preferenzialmente sul filamento opposto, non traslocato da XPD. Una volta padroneggiato, questo metodo può essere eseguito in poche ore o giorni, compresa l'analisi.È importante lavorare con campioni di proteine e DNA altamente puri per essere in grado di interpretare le caratteristiche nelle immagini AFM e progettare attentamente il substrato del DNA a seconda del sistema biologico e della domanda che si desidera affrontare. Inoltre, i metodi di ensemble, come l'elettroforesi su gel spaziale, lo spostamento dell'elettromobilità o i saggi di incisione del DNA sono, ovviamente, altamente complementari a questi esperimenti AFM; e questi metodi possono aiutare a rispondere a ulteriori domande, come le affinità di legame al DNA o le attività di escissione delle lesioni al DNA. Questa tecnica è un approccio relativamente veloce e semplice per visualizzare direttamente i complessi proteici del DNA, e questi complessi ci danno un buon quadro dei processi che avvengono in un sistema biologico.Naturalmente, questo non è solo utile per comprendere i processi di riparazione del DNA, ma può anche essere applicato ad altri sistemi di DNA proteico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea abbastanza buona di come preparare un campione sul tuo sistema di DNA proteico preferito, di come visualizzarlo tramite AFM e di come estrarre parametri utili per un'interpretazione dei tuoi dati.

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In questo video, descriviamo il metodo di immunofluorescenza per visualizzare la localizzazione delle proteine di riparazione del DNA γH2AX e 53BP1 nei siti di rotture del DNA a doppio filamento nei nuclei cellulari irradiati.

Visualizzazione basata sull'immunofluorescenza delle interazioni proteiche di riparazione del DNA

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Questo protocollo descrive un metodo non invasivo per identificare in modo efficiente le cellule in fase S per studi di microscopia a valle, come la misurazione del reclutamento di proteine di riparazione del DNA mediante microirraggiamento laser.

Microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del DNA durante la fase S

Questo lavoro presenta un metodo semplice e visivo per rilevare polimorfismi multi-nucleotide su una piattaforma di manipolazione gocciolina pneumatica. Con il metodo proposto, l'intero esperimento, compresi manipolazione gocciolina e la rilevazione dei polimorfismi multi-nucleotidi, può essere eseguita vicino a 23 ° C senza l'ausilio di strumenti avanzati.

Il colorimetrico rilevamento visivo del Multi-nucleotide polimorfismi su una piattaforma di manipolazione pneumatica Droplet

Scopri come la microscopia a forza atomica rivela le interazioni tra proteine di riparazione del DNA e siti di danno. Questo metodo permette di visualizzare direttamente i complessi proteici coinvolti nel riconoscimento delle lesioni nel sistema di riparazione per escissione dei nucleotidi.

Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi

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