Name: Spettrometria di Massa e approcci Luminogenic a base di caratterizzare la fase I metabolica competenza di In Vitro colture cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri come valutare l'attività degli enzimi CYP nelle colture cellulari in vitro utilizzando sonde metaboliche e spettrometria di massa. Questo metodo semplice migliora la rilevanza dei modelli in vitro per studi di metabolismo dei farmaci.

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Gli autori ringraziano Epithelix Sarl e Biopredic International per aver fornito le micrografie delle cellule delle vie aeree e delle cellule epatiche e Neil Smith per la figura che illustra la procedura sperimentale.

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AB e EM erano dipendenti di British American Tobacco, al momento questo manoscritto è stato scritto. Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato finanziato dalla British American Tobacco, e le spese di pubblicazione di questo video-articolo sono stati pagati dalla British American Tobacco.

Attualmente, molti sistemi di test tossicologici standardizzati utilizzano batteri ingegneristiche, linee cellulari o cellule embrionali che non sono rappresentativi della normale metabolismo umano 1. Questo può portare a previsioni inesatte del potenziale attività tossica di una sostanza chimica o medicina. Innovativo in vitro, quali colture cellulari 3D e organo su un chip, vengono sviluppati in un tentativo di replicare meglio la morfologia normale attività metabolica dei tessuti umani 21, 22, 23. competenza metabolica è un criterio che può essere utilizzato per decifrare quali modelli sono più adatti per gli studi di valutazione e di biotrasformazione di droga tossicologici. Il protocollo che abbiamo descritto in questo documento è progettato per misurare l&#39;attività degli enzimi CYP utilizzando cellule vive. È flessibile e può essere utilizzato per diversi sistemi cellulari in 2D o 3D culturES e offre la possibilità di utilizzare un probe- luminogenic o di un approccio basato su spettrometria di massa. Entrambi i metodi sono sufficientemente sensibili per rilevare quantità nanogrammi di materiali e richiedono solo un piccolo numero di cellule cresciute in un formato multipozzetto. Essi possono anche essere applicati a sferoide o cellule coltivate in matrici complesse. La scelta del substrato sonda è ovviamente un elemento critico del protocollo. La specificità del test si basa sulla sonda essere selettivi dell&#39;enzima CYP e un altro strato di affidabilità può essere ottenuta mediante l&#39;impiego di un inibitore selettivo CYP. I substrati e inibitori elencati nel presente documento sono solo alcuni esempi, ma altri possono essere trovati nella letteratura. È importante considerare diversi tempi di incubazione quando si lavora con un nuovo tipo di cella come CYP risultato negativo attività potrebbe essere dovuto al enzima è espressa ad un livello basso. L&#39;aggiunta di un tipo di cellula che può essere utilizzato come controllo positivo è opportuno garantire che unrisultato negativo non è legata a un problema tecnico e per aiutare con la risoluzione dei problemi. cellule epatiche primarie sono metabolicamente competenti e possono essere utilizzati come controllo, per esempio epatociti primari in sospensione sono molto facile da usare, ma la loro vitalità è limitato nel tempo. Linee di cellule epatiche sono possibili alternative che sono relativamente facili da usare come descritto in questo protocollo, ma alcuni sono migliori di altri in termini di attività metabolica 6, 21. Poiché il saggio è non distruttiva, meno proteine totali è quantificato, è possibile seguire l&#39;attività CYP nel tempo in studi longitudinali 20. Questo è un punto importante perché alcune cellule avranno attività di CYP variabile nel tempo in coltura. Un risultato negativo potrebbe essere associato con la mancanza di confluenza, progresso con la differenziazione o dedifferentiation in vitro. In tal caso, l&#39;approccio è semi-QUANTITATIVAve poiché i dati non è normalizzata dalla quantità totale di proteina in ciascuna coltura cellulare. Non è sempre possibile o consigliabile riutilizzare il tessuto dopo la misurazione dell&#39;attività CYP l&#39;esposizione a sonde, inibitori o induttori possono avere un effetto tossico sul tessuto come avviene per TCDD. frazioni cellulari come microsomi potrebbero anche essere utilizzati per caratterizzare l&#39;attività CYP di un dato tipo di cellula. Microsome preparati, tuttavia, richiedono un sacco di materiale cellulare, l&#39;aggiunta di cofattori adeguate e tampone per assicurare che gli enzimi rimangono attivi. Utilizzando cellule vive elimina la fase di preparazione microsome ingannevole e di lavoro fuori che buffer e cofattori funzionano meglio. Come raccomandazione generale, è una pratica migliore per caratterizzare ulteriormente il profilo di espressione di CYP in colture cellulari per verificare che corrisponda l&#39;attività enzimatica. Questo ulteriore livello di verifica è raccomandato dato che le sonde metaboliche non sono Enticontare specifico per un singolo CYP e dà maggiore fiducia che l&#39;attività metabolica misurata corrisponde l&#39;espressione dell&#39;enzima corrispondente. Poiché CYP sono proteine di membrana sono relativamente difficili da preparare per western blot, quindi RT-PCR è stato l&#39;approccio preferito al profilo questi enzimi 20. È importante notare che questo protocollo descrive un metodo per attività enzimatica assay CYP che rappresenta solo una famiglia di enzimi metabolici, anche se importante. La flessibilità di un approccio spettrometria di massa permette lo sviluppo di metodi di acquisizione di altre trasformazioni metaboliche dei substrati sonda. Tuttavia, coloro che devono essere sviluppati, uno alla volta e ci sono attualmente meno noti sonde specifiche e inibitori selettivi per altre famiglie di enzimi metabolici. Questa distanza deve essere indirizzata a consentire una valutazione completa della competenza metabolica di cellule in vitro sisteSignorina.

Metabolismo xenobiotico è il processo attraverso il quale le sostanze chimiche estranee all&#39;organismo vengono modificati mediante l&#39;aggiunta di gruppi idrofili e coniugati per facilitare il loro escrezione 1. Tipicamente il metabolismo di xenobiotici è un processo in due fasi con la fase I che consiste principalmente di un&#39;ossidazione con l&#39;aggiunta di uno o più gruppi idrossilici 1, 2. Nella fase II, i gruppi ossidrilici sono utilizzati come accettori per un coniugato idrofilo come glucuronide o un solfato porzione 1, 2. Se un gruppo accettore è già presente sulle molecole, la fase di coniugazione può accadere indipendentemente metabolismo Fase I. Ogni reazione è eseguita da un gruppo specifico di enzimi, per esempio, CYP (citocromo P450), che catalizzano l&#39;idrossilazione (figura 1) e dealchilazione di substrati chimici 3. Conjugation è catalizzata da sulfotransferasi, UDP-glicuronosiltransferasi (Figura 1), glutatione-S-transferasi e N-acetiltransferasi 4. Ogni tessuto e organo avranno uno specifico profilo di espressione dell&#39;enzima metabolico, con il fegato esprimere più di queste proteine. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Figura 1: Esempio di fase I e II metabolismo fase per cumarina. CYP2A6 / CYP2A13 catalizzare l&#39;7-idrossilazione di cumarina. 7-idrossicumarina è coniugato ad una porzione glucuronide dalla fase II enzimi UGT, con UGT1A6 e UGT1A9 mostra la più alta attività. Comprensione del metabolismo degli xenobiotici è critico nella valutazione della sicurezza dei farmaci e per la valutazione del rischio chimico per due motivi: la cinetica di reazione determineranno quanto tempo un farmaco o chimiche rimarrà nel corpo in forma attiva o inattiva brima di escrezione; e il composto genitore può essere modificato per una specie più reattivo, instabile e tossico da enzimi metabolici. Tali reazioni note anche come &quot;bioactivation&quot; sono per lo più guidati da fase I CYP enzimi ma anche in occasioni rare per fase II coniugazione 5. Sulla base di questo, la capacità di un modello in vitro per prevedere con precisione i rischi associati a un farmaco o una sostanza chimica è fortemente dipendente dalla competenza metabolica del sistema di celle. Linee cellulari derivate da tessuti malati o dalla trasformazione di cellule normali spesso perdono parte se non tutto il profilo metabolico enzima rappresentative del loro tessuto di origine 6. Il mantenimento del normale profilo metabolico enzima appare meglio in colture di cellule primarie (almeno nelle culture breve) ed è ulteriormente migliorata se il tessuto viene coltivato in una matrice permettendo così di mantenere la sua struttura 3D 1. Pertanto, il characterization della competenza metabolica di un sistema cellulare in vitro è un passo preliminare importante nel guidare la decisione su quale modello cellulare è opportuno effettuare valutazioni di sicurezza chimici. In questo articolo presentiamo un protocollo al profilo l&#39;attività e l&#39;espressione degli enzimi CYP Fase I in vitro con esempi della loro applicazione con una linea di cellule epatiche 7 e colture cellulari primarie polmone 3D 8. substrati specifici CYP, loro prodotti metabolici e inibitore controlli sono descritti insieme spectrometry- massa e di quantificazione luminogenic-based. Poiché alcuni CYP sono inducibili e altri sono costitutive, esempi anche essere dati per questi due scenari.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente & Cellule</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; m filtro per siringa</td><td>Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>Aldrich M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-fenil pentyne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-idrossibupropione</td><td>Sigma</td><td>Aldrich H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-idrossiclorzoxazone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-etossicumarina Sigma</td><td>Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-idrossicumarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-metossipsoralene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>acido acetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-naftoflavone</td><td>Sigma Kit</td> BCA <td>Aldrich N5757</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-glucuronidasi / arilsulfatasi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0876</td><td></td></tr><tr><td>Bupropione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>clorzoxasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>collagene</td><td>Cell Systems</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>cumarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>disulfiram</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>fluvoxamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (integratore di glutammina)</td><td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>integratore per il metabolismo HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>scongelamento HepaRG integratore di terreni</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Fisher</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>Cellule delle vie aeree MucilAir</td><td>Epithelix</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di manutenzione delle cellule delle vie aeree MucilAir</td><td>Epithelix</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 &mu; m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &micro; m 2,1 x 50 mm</td><td>Waters</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E media</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td> Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS software</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>Analista 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>luminometro</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>spettrofotometro</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>contatore di celle</td><td>Beckman Coulter</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td>evaporatore rotante</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

spettrometria di massa e approcci luminogenic a base di caratterizzare la fase i metabolica competenza di<em&gt; in vitro</em&gt; colture cellulari

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

enzimi che metabolizzano xenobiotici svolgono una funzione chiave nella biotrasformazione di farmaci e sostanze tossiche con l&#39;aggiunta di gruppi funzionali che aumentano la solubilità e facilitano l&#39;escrezione. In alcune occasioni quelle modifiche strutturali portano alla formazione di nuovi prodotti tossici. Al fine di ridurre la sperimentazione sugli animali, rischio chimico può essere valutata utilizzando cellule metabolicamente competenti. L&#39;espressione degli enzimi metabolici, tuttavia, non è stabile nel tempo in molti sistemi di coltura primaria in vitro ed è spesso parziale o assente in linee cellulari. Pertanto, lo studio dei farmaci, additivi, e il metabolismo inquinanti ambientali in vitro dovrebbe idealmente essere condotta in sistemi cellulari in cui l&#39;attività metabolica è stata caratterizzata. Spieghiamo qui un approccio per misurare l&#39;attività di una classe di enzimi metabolici (Fase umana I) in linee cellulari 2D e 3D colture primarie utilizzando sonde chimici ed i loro prodotti metabolici quantificabili mediante spettrometria di massa e UPLCluminometria. Il metodo può essere implementato per testare l&#39;attività metabolica in linee cellulari e cellule primarie derivate da una varietà di tessuti.

Esempi di attività metabolica misurati per due coppie di CYP (CYP1A1 / 1B1 e CYP2A6 / 2A13) nelle colture cellulari vie da tre diversi donatori (vie aeree M360, M370, M417) e la linea cellulare epatica (line Hep) sono mostrati in figura 6 20. Attività CYP misurata da luminometria La Figura 6A mostra la luminescenza relativa prodotte dall&#39;attività CYP1A1 / 1B1 O-dealchilazione di Luc-CEE (Luciferin 6&#39;-cloroetil etere) in cellule delle vie aeree (3 donatori) e cellule epatiche con e senza TCDD induzione. CYP1A1 / 1B1 sono enzimi altamente inducibile e sono tipicamente non espresso ad un livello costitutivo nella maggior parte dei tessuti. Come visibile in figura 6A, nessun segnale luminogenic viene rilevata quando le cellule non sono indotte. Quando entrambi i tipi di cellule vengono pre-incubate con TCDD, un forte CYP1A1 / 1B1 induttore, un marchiosegnale ed luminogenic viene rilevato rispetto al controllo (Figura 6A). Ciò indica che la sonda Luc-CEE è stato metabolizzato che porta al rilascio della frazione luciferina che viene quantificata in seguito. Nel complesso l&#39;attività dalla linea cellulare epatico TCDD trattata è inferiore di quella delle cellule delle vie aeree, anche dopo la normalizzazione delle proteine ​​totali. Questo non è insolito in quanto linee cellulari tendono ad essere meno metabolicamente attivo di cellule primarie. Aggiunta di α-naftoflavone ha un chiaro effetto inibitorio sull&#39;attività CYP1A1 / 1B1 in tutti i tipi di cellule che conferma ulteriormente la CYP dipendenza del metabolismo Luc-CEE. La quantificazione di metaboliti CYP450 usando UPLC-MS La Figura 6B illustra la quantificazione di CYP2A6 / 2A13 attività in cellule delle vie aeree da 3 donatori (Airway M343, M345, M347) e le cellule epatiche (linea Hep) dopo incubazione con cumarina in presenza e assenza della INHIBITOR 8-metossipsoralene. I dati sono normalizzati per proteine ​​totali. Nel controllo cumarina incubazione 0 min, senza 7-idrossicumarina viene rilevata (Figura 6B). CYP2A6 / 2A13 sono espressi costitutivamente in alcuni tessuti e quindi dopo 16 h di incubazione con formazione di cumarina 7-idrossicumarina viene rilevata nei diversi tipi cellulari testate, anche senza induzione. Quando 8-psoralene, viene aggiunto un inibitore di CYP2A (figura 6B), la formazione di 7-idrossicumarina è notevolmente ridotta. Va notato che in presenza dell&#39;inibitore CYP, è normale rilevare ancora qualche attività residua come inibizione è raramente completa e poiché altri CYP potrebbe anche essere in grado di riconoscere il substrato ma elaborarlo molto meno efficiente. Si può anche osservare che l&#39;attività metabolica registrato può essere differente tra i donatori utilizzando cellule primarie come è visibile per CYP2A6 in cellule delle vie aeree(Figura 6B). Questo è previsto come l&#39;attività CYP è suscettibile di genotipo e polimorfismi di ciascun donatore. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Figura 6: Saggio di attività Risultato per CYP1A1 / 1B1 attività (A) e CYP2A6 / 2A13 attività (B) nella epatica Cell Line e in tre Airway cellulare donatori (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE attività dealchilazione è mostrato con e senza induzione di CYP1A1 / 1B1 da TCDD. α-naftoflavone stato utilizzato come inibitore del CYP1A1 / 1B1. All&#39;attività sono espressi come unità relative luminescenza (RLU) normalizzati dal tempo di incubazione in minuti (min) e proteina totale (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 non richiedono l&#39;induzione come sono espresse costitutivamente. Cumarina attività 7-idrossilazione in proteine ​​pmol / min / mg è indicata a tempi diversi con e senza l&#39;inibitore 8-methoxypsorAlen. Tutti i risultati sono presentati come un valore medio di tre misurazioni indipendenti con deviazioni standard dalla media. Questa figura è stata modificata da Baxter 20. Supplemental Tabella 1: UPLC e impostazioni spettrometro di massa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questo file.</a>

Competenza metabolica dei sistemi in vitro è un requisito fondamentale per la biotrasformazione e la disposizione di farmaci e sostanze tossiche. In questo protocollo, si descrive l&#39;applicazione di sonde metabolici riferimento per valutare fase del metabolismo in colture cellulari.

Spettrometria di Massa e approcci Luminogenic a base di caratterizzare la fase I metabolica competenza di<em&gt; In Vitro</em&gt; colture cellulari

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

L'obiettivo di questa procedura è determinare l'attività delle citocromi P450, o CYP, in cellule in coltura. Le CYP sono enzimi chiave coinvolti nel metabolismo di farmaci e sostanze tossiche e la loro espressione non viene spesso mantenuta in vitro. L'espressione normale degli enzimi CYP viene frequentemente persa quando le cellule sono coltivate in vitro.Pertanto, molti modelli in vitro potrebbero avere una rilevanza limitata per comprendere il metabolismo di farmaci e sostanze tossiche. Il principale vantaggio di questo metodo è la sua semplicità nella valutazione dell'attività della CYP in cellule in coltura. Utilizzando substrati specifici e inibitori, vengono presentate diverse piattaforme di quantificazione, inclusa la spettrometria di massa.Per iniziare, procurarsi le provette criogeniche con cellule come descritto nel protocollo testuale. Il protocollo fornito utilizza una linea cellulare epatica come esempio. Mentre si lavora in condizioni sterili, aprire con attenzione la provetta criogenica per rilasciare qualsiasi pressione in eccesso, quindi pipettare il contenuto della provetta criogenica in una provetta da 10 millilitri contenente nove millilitri di mezzo Williams'E preriscaldato a 37 gradi Celsius.Centrifugare la soluzione per 10 minuti a 400 × g a temperatura ambiente. Dopo aver eliminato il soprannatante, risospendere le cellule in cinque millilitri di mezzo di scongelamento proprietario, preriscaldato a 37 gradi Celsius e integrato con glutammina. Dopo aver contato le cellule vitali come descritto nel protocollo del testo, seminare le cellule in una piastra da 24 pozzetti rivestita con collagene a una densità di 60.000 cellule vitali per pozzetto e un volume finale di 0,5 millilitri di mezzo di scongelamento.Dopo alcuni giorni di coltura, le cellule formano una struttura trabecolare subconfluente. L'attività metabolica ottimale viene generalmente osservata tra il settimo e il decimo giorno ed è minima al quarto giorno. Per preparare le colture di epitelio delle vie aeree differenziato, utilizzare epitelio primario delle vie aeree completamente differenziato disponibile in commercio, coltivato all'interfaccia aria-liquido su un inserto.Utilizzando pinzette sterili, staccare delicatamente l'inserto cellulare dalla matrice di agarosio e trasferirlo nella nuova piastra pre-riempita con 700 microlitri di mezzo di coltura proprietario. Valutare l'integrità del tessuto delle vie aeree mediante metodi citati nel protocollo descrittivo, come la resistenza transepiteliale o la frequenza di battito delle ciglia. Prima dell'esperimento, preparare due serie di inserti cellulari per le cellule delle vie aeree e di pozzetti per le cellule epatiche, con un minimo di tre ripetizioni.Utilizzare una serie per l'esperimento di inibizione e l'altra per il solo sonda metabolica. Preparare una terza serie di cellule come controllo del mezzo. Nel giorno dell'esperimento, sostituire il mezzo di coltura cellulare con 450 microlitri di mezzo fresco.Aggiungere 50 microlitri di mezzo contenente l'inibitore 10x della CYP alla serie di cellule preparata per l'esperimento di inibizione e pre-incubare per 30 minuti. Successivamente, sostituire il mezzo nella serie di inibizione con 450 microlitri di mezzo fresco e aggiungere 50 microlitri di mezzo contenente sia l'inibitore 10x della CYP che il substrato sonda 10x. Aggiungere 50 microlitri di mezzo con il substrato sonda 10x alle altre cellule, quindi aggiungere un volume equivalente di veicolo diluito nel mezzo ai controlli cellulari in bianco.Dopo aver incubato le cellule da zero a cinque minuti per il primo punto temporale, controllo zero di fondo, raccogliere il mezzo in provette separate etichettate e congelare il mezzo per un successivo processamento. Successivamente, incubare le cellule del secondo punto temporale per 16 ore nell'incubatore cellulare. Al termine del periodo di incubazione, raccogliere il mezzo utilizzando lo stesso metodo per la quantificazione del prodotto metabolico.Trasferire 250 microlitri di mezzo di incubazione in un microtubo da 1,5 millilitri e aggiungere la soluzione stock dello standard interno 4-metilumbelliferone per raggiungere una concentrazione finale di 100 nanomolare. Regolare il pH del mezzo tra 4,5 e 5,0 aggiungendo acido cloridrico uno molare, un microlitro alla volta. Verificare il pH prelevando con una pipetta da due a 10 microlitri di mezzo e applicandoli su una striscia per la misurazione del pH, quindi aggiungere 150 unità di beta-glucuronidasi arilsolfatasi da Helix pomatia.Dopo un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius, arrestare la reazione aggiungendo 250 microlitri di metanolo freddo. Evaporare il solvente utilizzando un centrifugo sotto vuoto a 45 gradi Celsius. Ricostruire i campioni con 500 microlitri di una soluzione di acetonitrile al 30% in acqua.Per eseguire la quantificazione basata sulla spettrometria di massa, aggiungere 250 microlitri di ciascuno standard in diluzione seriale in un vial di vetro per cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) di colore ambrato, da utilizzare nell'auto-campionatore UPLC-MS. Aggiungere anche i campioni da analizzare in vials UPLC ambrati e posizionarli nell'auto-campionatore UPLC. Dopo aver randomizzato tutti i vials, eseguire l'analisi UPLC-MS utilizzando le impostazioni descritte nel protocollo a testo, in base alla sonda specifica da quantificare.Utilizzare lo strumento Quantitate, Build Quantitation Method negli strumenti di quantificazione dello spettrometro di massa per generare la curva di calibrazione a partire dallo standard sintetico e dallo standard interno acquisiti, quindi utilizzare la procedura guidata di quantificazione (Quantitation Wizard) per selezionare il lotto di campioni e i campioni da quantificare ed eseguire il metodo di quantificazione. Per indurre CYP1A1, CYP1B1, utilizzare il layout della piastra riportato nel protocollo testuale. Incubare le cellule designate per l'induzione con una concentrazione finale di 10 nanomolar TCDD in mezzo per un periodo di 72 ore.Dopo questo periodo, rimuovere il mezzo, lavare le pozzette con PBS per tre volte e aggiungere del mezzo fresco. Prima di incubare le cellule con la sonda luminogenica, pre-incubare il sottoinsieme designato di cellule indotte per 30 minuti con l'inibitore CYP1A1, CYP1B1 nel mezzo. Aggiungere la sonda luminogenica, luciferina 6'cloroetile etere, a una concentrazione finale di 50 micromolare alle cellule non indotte, indotte e indotte in presenza dell'inibitore.Incubare per quattro ore, quindi trasferire 25 microlitri di mezzo di coltura in una piastra 96 pozzetti bianca e opaca e aggiungere 25 microlitri di reagente di rilevamento della luciferina fornito dal produttore. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente, leggere immediatamente la piastra utilizzando un luminometro. Qui vengono riportate la luminiscenza relativa prodotta dalla dealchilazione dell'etere 6'-cloroetilico della luciferina, catalizzata da CYP1A1 e CYP1B1.L'esempio mostra l'assenza di attività enzimatica in assenza di induzione da TCDD. Dopo l'induzione con TCDD, l'attività di CYP1A1, CYP1B1 è osservata sia nei tipi cellulari epatici che respiratori. Infine, l'aggiunta dell'inibitore di CYP1A1, CYP1B1, l'alfa-naftoflavone, riduce o elimina l'attività CYP.Per valutare l'attività di CYP2A6 e 2A13 nei tipi cellulari epatici e delle vie aeree, la quantità di 7-idrossicumarina prodotta tramite idrossilazione della cumarina da parte dell'enzima è stata misurata mediante UPLC LC-MS. A zero minuti di incubazione con cumarina, viene rilevato solo un segnale di fondo. Dopo 16 ore, si osserva l'idrossilazione della cumarina con la formazione di 7-idrossicumarina nei due tipi cellulari.Infine, l'aggiunta di un inibitore della CYP2A, 2A13 impedisce la formazione di 7-idrossicumarina. Una volta acquisita padronanza, le fasi di incubazione con il probe e di quantificazione di questa tecnica possono richiedere da poche ore fino a un giorno nella maggior parte dei casi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire vari saggi di metabolismo di fase uno utilizzando diversi tipi cellulari, confermando la specificità dell'enzima mediante inibizione e/o induzione, quando necessario.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che diversi tipi cellulari potrebbero richiedere tempi di incubazione più lunghi, ed è essenziale includere un tipo cellulare utilizzabile come controllo positivo. Non bisogna dimenticare che lavorare con il TCDD può essere estremamente pericoloso, e che è sempre necessario adottare precauzioni, come l'uso completo di dispositivi di protezione individuale, durante l'esecuzione di questa procedura. Le implicazioni di questa tecnica riguardano l'utilizzo di modelli in vitro adeguati per la valutazione preclinica di nuovi farmaci e la valutazione del rischio associato a sostanze chimiche e ingredienti impiegati in prodotti per il consumo umano.

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