Spettrometria di Massa e approcci Luminogenic a base di caratterizzare la fase I metabolica competenza di In Vitro colture cellulari

L'obiettivo di questa procedura è determinare l'attività del citocromo P450, o CYPs, nelle cellule in coltura. I CYP sono enzimi chiave coinvolti nel metabolismo dei medicinali e delle sostanze tossiche e la loro espressione non è spesso mantenuta in vitro. La normale espressione degli enzimi CYP viene spesso persa quando le cellule vengono coltivate in vitro.

Pertanto, molti modelli in vitro sono potenzialmente di rilevanza limitante per la comprensione del metabolismo dei farmaci e delle sostanze tossiche. Il vantaggio principale di questo metodo è la sua semplicità nella valutazione dell'attività del CYP nelle cellule in coltura. Utilizzando substrati e inibitori della sonda, vengono presentate diverse piattaforme di quantificazione, inclusa la spettrometria di massa.

Per iniziare, procurati fiale criogeniche con cellule come descritto nel protocollo di testo. Il protocollo fornito utilizza come esempio una linea cellulare epatica. Mentre si lavora in condizioni sterili, aprire con cautela la fiala criogenica per rilasciare la pressione in eccesso, quindi pipettare il contenuto della fiala criogenica in una provetta da 10 millilitri riempita con nove millilitri di terreno Williams'E preriscaldato a 37 gradi Celsius.

Centrifugare la soluzione per 10 minuti a 400 volte g a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, sospendere nuovamente le cellule in cinque millilitri di terreno di scongelamento brevettato, preriscaldato a 37 gradi Celsius e integrato con glutammina. Dopo aver contato le cellule vitali come descritto nel protocollo di testo, seminare le cellule in una piastra rivestita di collagene a 24 pozzetti a una densità di 60.000 cellule vitali per pozzetto e un volume finale di 0,5 millilitri di terreno di scongelamento.

Dopo alcuni giorni in coltura, le cellule formano una struttura trabecolare subconfluente. L'attività metabolica ottimale si osserva in genere tra il settimo e il decimo giorno ed è più bassa al quarto giorno. Per preparare le colture di epitelio differenziato delle vie aeree, utilizzare epitelio primario delle vie aeree completamente differenziato disponibile in commercio che è stato coltivato all'interfaccia aria-liquido su un inserto.

Utilizzando una pinzetta sterile, rimuovere delicatamente l'inserto cellulare dalla matrice di agarosio e trasferirlo sulla nuova piastra precaricata con 700 microlitri di terreno di coltura brevettato. Valutare l'integrità del tessuto delle vie aeree utilizzando i metodi a cui si fa riferimento nel protocollo di testo, come la resistenza transepiteliale o la frequenza dei battiti delle ciglia. Prima dell'esperimento, preparare due serie di inserti cellulari per le cellule delle vie aeree e pozzetti per le cellule epatiche con un minimo di tre repliche.

Utilizzare una serie per l'esperimento di inibizione e l'altra solo per la sonda metabolica. Preparare una terza serie di celle come controllo del bianco del supporto. Il giorno dell'esperimento, sostituire il terreno di coltura cellulare con 450 microlitri di terreno fresco.

Aggiungere 50 microlitri di terreno contenente l'inibitore 10x del CYP alla serie di cellule preparate per l'esperimento di inibizione e pre-incubare per 30 minuti. Quindi, sostituire il terreno della serie di inibizione con 450 microlitri di terreno fresco e aggiungere 50 microlitri di terreno contenente sia l'inibitore del CYP 10x che il substrato della sonda 10x. Aggiungere 50 microlitri di terreno con il substrato della sonda 10x alle altre celle, quindi aggiungere una quantità equivalente di veicolo diluito in terreno ai controlli delle celle vuote.

Dopo aver incubato le cellule per zero-cinque minuti per il punto uno del tempo, controllo dello sfondo zero, raccogliere il terreno in provette etichettate separate e congelare il terreno per la futura elaborazione. Quindi incubare il punto temporale di due cellule per 16 ore nell'incubatore cellulare. Al termine del periodo di incubazione, raccogliere il terreno utilizzando lo stesso metodo di quantificazione del prodotto metabolico.

Trasferire 250 microlitri di terreno di incubazione in una microprovetta da 1,5 millilitri e aggiungere la soluzione madre standard interna di 4-metilumbelliferone per raggiungere una concentrazione finale di 100 nanomolari. Regolare il pH del terreno tra 4,5 e 5,0 aggiungendo un molare di HCl, un microlitro alla volta. Verificare il pH pipettando da due a 10 microlitri di terreno su una striscia di pH, quindi aggiungere 150 unità di betaglucuronidasi arilsulfatasi di Helix pamatia.

Dopo l'incubazione per un'ora a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione aggiungendo 250 microlitri di metanolo freddo. Far evaporare il solvente utilizzando una centrifuga sottovuoto a 45 gradi Celsius. Ricostituire i campioni con 500 microlitri di una soluzione acquosa di acetonitrile al 30%.

Per eseguire la quantificazione basata sulla spettrometria di massa, aggiungere 250 microlitri di ogni standard di diluizione seriale a una fiala di vetro per cromatografia liquida ambrata ad alte prestazioni per iniezione nell'autocampionatore UPLC-MS. Aggiungere anche i campioni di prova alle fiale UPLC ambrate e inserirli nel campionatore automatico UPLC. Dopo aver randomizzato tutte le fiale, eseguire l'UPLC-MS utilizzando le impostazioni dettagliate nel protocollo di testo a seconda della sonda specifica da quantificare.

Utilizzare lo strumento Quantitate, Build Quantitation Method negli strumenti di quantificazione dello spettrometro di massa per generare la curva di calibrazione dallo standard sintetico acquisito e dallo standard interno, quindi utilizzare la procedura guidata di quantificazione per selezionare il lotto di campioni e i campioni per quantificare ed eseguire il metodo di quantificazione. Per indurre il CYP1A1, CYP1B1, utilizzare la disposizione della piastra che si trova nel protocollo di testo. Incubare le cellule designate per l'induzione con una concentrazione finale di 10 nanomolari di TCDD in terreno per un periodo di 72 ore.

Trascorso questo periodo, rimuovere il terreno, sciacquare i pozzetti con PBS tre volte e aggiungere un po' di terreno fresco. Prima di incubare le cellule con la sonda reporter luminogenica, pre-incubare il sottogruppo designato di cellule indotte per 30 minuti con il CYP1A1, inibitore del CYP1B1 in terreno. Aggiungere la propbe luminogenica, luciferina 6'cloroetilete ad una concentrazione finale di 50 micromolari alle cellule inibitrici plus non indotte, indotte e indotte.

Incubare per quattro ore, quindi trasferire 25 microlitri di terreno di coltura in una piastra bianca opaca da 96 pozzetti e aggiungere 25 microlitri di reagente di rilevamento della luciferina fornito dal produttore. Dopo aver incubato per 20 minuti a temperatura ambiente, leggere immediatamente la piastra utilizzando un luminometro. La luminescenza relativa prodotta dalla dealchilazione della luciferina 6'cloroetiletere, che è catalizzata da CYP1A1, CYP1B1, è presentata qui.

L'esempio non mostra alcuna attività enzimatica in assenza di induzione della TCDD. Dopo l'induzione della TCDD, l'attività del CYP1A1 e del CYP1B1 è osservata sia nel tipo di cellule epatiche che in quelle respiratorie. Infine, l'aggiunta dell'alfa-naftoflavone inibitore del CYP1A1, CYP1B1 riduce o elimina l'attività del CYP.

Per valutare l'attività del CYP2A6, 2A13 nei tipi di cellule epatiche e delle vie aeree, la quantità di 7-idrossicumarina prodotta attraverso l'idrossilazione della cumarina da parte dell'enzima è stata misurata utilizzando UPLC LC-MS. A zero minuti di incubazione con cumarina, viene rilevato solo il fondo. Dopo 16 ore, si osserva l'idrossilazione della cumarina con la formazione di 7-idrossicumarina nei due tipi cellulari.

Infine, l'aggiunta del CYP2A, inibitore 2A13 impedisce la formazione di 7-idrossicumarina. Una volta padroneggiata, le parti di incubazione e quantificazione della sonda di questa tecnica possono essere eseguite in poche ore fino a un giorno nella maggior parte dei casi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire vari saggi metabolici di fase uno utilizzando diversi tipi di cellule, confermando la specificità dell'enzima utilizzando l'inibizione e/o l'induzione secondo necessità.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che diversi tipi di cellule potrebbero richiedere tempi di incubazione più lunghi ed è essenziale includere un tipo di cellula che possa essere utilizzato come controllo positivo. Non dimenticare che lavorare con la TCDD può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come dispositivi di protezione individuale completi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'utilizzo di modelli in vitro adeguati per la valutazione preclinica di nuovi medicinali e la valutazione del rischio di sostanze chimiche e ingredienti utilizzati nei prodotti di consumo.