Name: Analizzare lattività della proteina con lATP radioattivato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Impara a misurare l'attività enzimatica delle chinasi proteiche utilizzando ATP radioattivo. Questo metodo versatile e quantitativo aiuta a studiare i meccanismi di segnalazione cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano tutti gli attuali e ex membri del laboratorio di Cobb per lavori e discussioni preziose e Dionne Ware per l&#39;assistenza amministrativa. Questi studi sono stati sostenuti dal National Institutes of Health Grant R37 DK34128 e dalla Fondazione Welch Grant I1243 a MHC

1. Risorse di depurazione delle chinasi e pipeline di immunoprecipitazione generale NOTA: Le cinasi usate con questo dosaggio possono essere provenienti da immunoprecipitati di cellule colte o mediante mezzi ricombinanti come la purificazione affinità 6 . Di seguito è riportato un protocollo generale per l&#39;immunoprecipitazione contrassegnata dalla bandiera che può essere necessario modificare a seconda della chinasi di interesse. Tutto dovrebbe essere mantenuto sul ghiaccio quando possibile. <ol><li> Aggiungere 2 μL di 1 mg / mL di anticorpi a 200 μL di lisati cellulari (di solito ~ 1 mg / ml di concentrazione totale di proteine) e incubare a 4 ° C per 1 ora durante il dondolo. </li><li> La proteina di lavaggio Una seperarosa si perda 2-3 volte con il tampone di lisi (vedi sotto) brevettando brevemente a 4 ° C per 30 s a 1 min a 5.000 xg (&quot;spin di tocco&quot;), rimuovendo il surnatante con una pipetta e riutilizzando le perle in tampone . <ol><li> Preparare il tampone di lisi: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glicerolo, 0,2 mM orthovanadato di sodio, 100 mM fluoruro di sodio, 50 mM β-glicerofosfato, 0,1% Triton X 100 o 0,1% NP-40. </li></ol></li><li> Aggiungere 30 μL di sospensione del 50% di branoli di seperarina di proteina A nel lysis buffer a lisati; Incubare a 4 ° C per 1 ora durante il dondolo. </li><li> Toccare lo spin a 4 ° C per far pelliccare le perle e rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare 3 volte con 1 mL di tampone di lavaggio a goccia (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4). </li><li> Lavare una volta con tampone di reazione di chinasi 1x (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Rimuove il maggior numero di tamponi possibile senza rimuovere le perle. </li></ol> 2. Inizializzare le reazioni della chinasi NOTA: Per i dosaggi di IP chinasi, ~ 15 μL di branelli non sospesi è un tipico campione di partenza. Per i dosaggi ricombinanti della proteina chinasi, gli importi tipici di partenza sono compresi tra 0,1 e 1,0 μg in 1-10 per 25-50 μL di volumi di reazione finale. Regolare i volumi del campione proteico ricombinanteS per essere uguale al buffer che sono memorizzati prima di inizializzare il saggio. Quando si utilizzano alte quantità di chinasi, includere una proteina portante come BSA per aiutare a mantenere la stabilità proteica per la durata del saggio. <ol><li> Preparare il 5x reazione di reazione di chinasi sotto riportato: 50 mM HEPES pH 8,0 50 mM di MgCl2 50 mM Benzamidina (inibitore della proteasi) 50 mM DTT (agente di riduzione) 250 μM ATP (non etichettati o &quot;freddi&quot;) </li><li> Tenere i campioni di chinasi su ghiaccio in tubi da 1,5 ml. Preparare la seguente miscela di reazione in tubi separati, refrigerati di 1,5 mL: 21 μl H 2 O 6 μL di tampone di reazione di chinasi 5x 1 μl ATP radiomarcato (&quot;caldo&quot;) 2 μL di substrato (~ 5 mg / ml) NOTA: per i dosaggi ricombinanti di chinasi, il volume può essere regolato per contenere proteine ​​purificate. Calcolare tale che il volume di reazione finale è di 30 μL. Utilizza questa ricetta per preparare un maestromescolare. Al ricevimento di ATP etichettato, diluire la riserva in H 2 O ad un&#39;attività specifica di 0,01 mCi / μl prima di aggiungere alla miscela di reazione. </li><li> Per inizializzare il saggio, aggiungere tutta la miscela di reazione al campione di chinasi e incubare la reazione a 30 ° C per 5 minuti a 1 h a seconda dell&#39;attività di chinasi in fase di analisi. NOTA: quando si lavora con una chinasi la cui attività non è stata precedentemente misurata, eseguire un tempo di attività di chinasi con intervalli di 5 minuti tra i punti di tempo. </li></ol> 3. Terminazione di reazione e SDS-PAGE <ol><li> Arrestare la reazione mettendo in ghiaccio e aggiungendo 7,5 μL di tampone di campione 5x Laemmli 6 . </li><li> Scaldare a 100 ° C per 30 secondi fino a 2 minuti nel blocco termico. </li><li> Toccare lo spin e caricare 20 μL per pozzetto sul 10-15% SDS-PAGE gel. Far eseguire gel sufficientemente a lungo per separare la chinasi e il substrato (tipicamente 1 h a potenza costante di 5 W). Assicurarsi di mantenere schermato l&#39;apparecchiatura gel per limitare l&#39;esposizione a 32 </sup&gt; P. <ol><li> Qui usi gli apparecchi di gelatina fatti in casa, ma i minigelchi standard commercialmente disponibili sono perfettamente adatti. Utilizzare le dimensioni come segue: Gel: 8 cm di larghezza, 5,5 cm di lunghezza (risolvendo), spessore 1,5 mm. Pettini: 15 pozzetti, spessore 1,5 mm, larghezza 2,9 mm, profondità 16 mm </li></ol></li></ol> 4. Colorazione e asciugatura del gel Attenzione: Per tutti i passaggi, assicurarsi di ridurre l&#39;esposizione personale a 32 P utilizzando schermatura radioattiva e indossare dispositivi di protezione individuale. Per ulteriori informazioni su passaggi specifici sono inclusi alcuni riferimenti utili. <ol><li> Togliere il gel da lastre di vetro / allumina e mettere in 50 ml di colorante Coomassie (10% acido acetico glaciale, 50% metanolo, 0,25% R-250) per 1 ora su un agitatore orbitale impostato a 50 giri / min. Per questo passo utilizzare un contenitore leggermente più grande del gel stesso. 8 </li><li> Spostare il gel dalla macchia alla soluzione di fissaggio (10% acetato glaciale acciD, 20% metanolo) al fine di de-macchia. Far scivolare il gel in 600-700 ml di soluzione di fissaggio durante la notte su agitatore orbitale a 50 giri / min. Posizionare pezzi di spugna o salviette di laboratorio annodate nel contenitore con il gel per assorbire il colorante Coomassie 8 , 9 . </li><li> Togliere il gel dalla soluzione di fissaggio e immergere in 200 mL di metanolo per 1-2 minuti con agitazione gentile fino a quando il gel si trasforma in bianco latteo. Ciò contribuirà a prevenire fessurazioni durante la fase di asciugatura. </li><li> Bagnare un pezzo di carta filtrante qualitativa da 14 cm x 14 cm con metanolo e mettere su asciugatrice a vuoto a gel di lastre. Posare il gel sul lato frontale della carta filtrante rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Coprire con cura il gel con un involucro di plastica per evitare le rughe e le bolle d&#39;aria. Azionare l&#39;asciugatrice per 1,5 ore a 80 ° C. Dopo aver raggiunto il vuoto, aprire il coperchio ed estrarre eventuali bolle d&#39;aria, se necessario, con un soffietto in gomma morbida. </li></ol> 5. Autoradiogrammi e contatti di scintillazione <ol><li> Rimuovi driEd attaccare un indicatore di autoradio, righello fosforescente o punti sulla carta filtrante sul lato del gel. Se si usano i puntini verificare che siano in un modello asimmetrico. Questo allineerà il gel con il film dopo l&#39;esposizione e lo sviluppo. </li><li> Utilizzare un contatore Geiger per controllare l&#39;intensità del segnale. Per un segnale più debole di esposizione a -70 ° C a -80 ° C con uno schermo di intensificazione aumenterà la densità della banda del film. </li><li> In una stanza buia mettere il gel asciugato in una cassetta con film e uno schermo intensificante nel seguente ordine dall&#39;alto verso il basso: gel, film, schermo intensificante. </li><li> Fissare lo schermo di intensificazione al coperchio della cassetta e applicare il gel sul posto per facilitare questo passaggio. Lo schermo intensificante emette luce quando irradiato dalle particelle beta dal 32 P. Le emissioni di luce penetrano in modo più efficace del film rispetto alle particelle beta. <ol><li> Assicurarsi che la lunghezza d&#39;onda emessa dallo schermo di intensificazione correscaStagni ad una lunghezza d&#39;onda il film è più sensibile a. </li><li> Utilizzare un contatore Geiger per determinare quanto tempo lasciare l&#39;esposizione per: se il numero di cpm è di ~ 100 o inferiore, prova a notte a -70 ° C. Se il conteggio è di ~ 10.000, iniziare con un&#39;esposizione di 1h e ottimizzare da lì. </li></ol></li><li> Alla conclusione dell&#39;esposizione rimuovere il film e svilupparsi in un processore medico / a raggi X. Se l&#39;esposizione è stata eseguita a -70 - -80 ° C, lasciare che la cassetta si riscaldi a temperatura ambiente per minimizzare la condensa sulla pellicola o rimuovere la pellicola immediatamente prima delle forme di condensazione 10 . </li><li> Posare la pellicola sopra il gel essiccato / carta filtrante e allineare l&#39;immagine del marker / punti con i marcatori / punti sul gel essiccato. Segna sul film le bande corrispondenti agli standard proteici. Etichettare le norme proteiche e quali corsie le reazioni sono per riferimento futuro. </li><li> Incise le bande del gel che corrispondono a bande di interesse sul film e li piazzanoIn fiale di scintillazione da 7 ml. Aggiungere 4 ml di liquido di scintillazione e contare con contatore di scintillazione liquida. Confermare che il contatore sia impostato per monitorare la corretta finestra dello spettro di energia per 32 P. NOTA: Assicurarsi inoltre di accisciare la banda corrispondente al substrato dalla corsia di controllo non-chinasi. Questo verrà utilizzato per calcolare la radiazione di sfondo che verrà sottratta da tutti i conteggi di scintillazione del campione. </li></ol> 6. Analisi dei risultati NOTA: L&#39;autoradiogramma fornisce una visualizzazione qualitativa dei risultati. Per una quantificazione accurata, l&#39;incorporazione di 32 P può essere misurata con un contatore di scintillazione. I dati sono di solito espressi in termini di attività relativa, come mostrato nella Figura 1B . Fintanto che vengono mantenute condizioni uniformi per tutti i campioni, le misure relative di attività specifiche sono sufficienti per confrontare i trattamenti. <ol><li> Nel calcolo di valori assoluti specifici di attività, eseguire un rigoreOttimizzazione di tutte le condizioni di reazione, inclusa la chinasi, il substrato e le concentrazioni di ATP fredde, al fine di garantire una gamma lineare di attività in un corso temporale ( es. 2 x [chinasi] = 2 x attività specifica). Per le chinasi con elevata attività specifica, eseguire test con concentrazione di substrato aumentato in caso di attività cinasi china è limitata dalla quantità di substrato. </li><li> Calcolare l&#39;attività specifica della chinasi di interesse in unità di nanomoli fosfato trasferito per min per mg chinasi. <ol><li> Sottrarre gli spazi dal cpm nelle bande contate. </li><li> Calcola il decadimento di ATP caldo: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 dove t è il numero di giorni dalla data di riferimento (dovrebbe essere fornito dal venditore), t 1/2 L&#39;emivita di 32 P, che è di 14,3 giorni e 0,95 riflette l&#39;efficienza del contatore di scintillazione. Esempio: se si utilizza ATP caldo che è di 28 giorni, il valore di decadimento dovrebbe essere 0.245. </li><li> CalcInserire il pikomole (pmol) del totale ATP nel saggio (di solito è uguale alla quantità di ATP freddo nella reazione): volume di analisi (μL) x [ATP freddo] (μM) = totale ATP (pmols). Esempio: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol </li><li> Calcolare cpm / pmol ATP: [μL di caldo ATP x (2,2 x 10 7 ) x fattore di decadimento] / pmol di ATP freddo. NOTA: Il valore di 2,2 x 10 7 converte 0,01 mCi / μL di ATP a cpm. </li><li> Calcola la quantità di chinasi nel dosaggio in mg. Per entrambe le chinasi ricombinanti e le chinasi immunoprecipitate, metodi standard come i test BCA sono idonei a determinare le concentrazioni di partenza. Esempio: wtERK2 0,0002 μg / μL in una reazione di chinasi di 50 μL è 0,01 μg, o 1 x 10 -5 mg. </li><li> Calcolare il cpm totale nel saggio. Assemblare 30 μL di reazioni e eseguire 20 μL da ogni reazione su un gel. Moltiplicare il cpm contato (dopo la sottrazione di vuoto) per un fattore di volume / volume di dosaggio totale caricato. Proseguendo quanto sopraEsempio, moltiplicare tutti i conteggi di 1,5 o 30/20. </li><li> Calcolare l&#39;attività specifica della chinasi assayed: Totale cpm nel saggio) / (cpm / pmol ATP) / (tempo di analisi in minuti) / (quantità di chinasi in mg) NOTA: La suddivisione del valore sopra riportato per 1.000 rende l&#39;attività specifica in nanomoli / minuto / mg </li></ol></li><li> Calcolare quanti moli di fosfato sono incorporati in un substrato (fino a quando il suo peso molecolare è noto). Questo viene utilizzato per determinare il numero di fosfosi su una particolare proteina una volta che la reazione è stata completata. Total cpm nel saggio) / (cpm / pmol ATP)] / (quantità di substrato in pmols) </li></ol>

<ol><li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complexity+of+the+ERK%2FMAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33(2016).</li>
<li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li>
<li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine%2Fthreonine-specific+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li>
<li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+fluorescence+assay+for+serine%2Fthreonine+kinases+using+specific+chemical+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/">http://cshprotocols.cshlp.org/</a> (2016).</li>
<li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja9856856">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215(1999).</li>
<li>Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html">http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html</a> (2007).</li>
<li>Autoradiography. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. , 3 edn, Humana Press. (2009).</li>
<li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNK1%2C+a+novel+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li>
<li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.biochem.6b00096">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li>
<li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11(2011).</li>
<li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1%2F2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669(2013).</li>
<li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+%28ERK5%29+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Le cinasi sono una famiglia diversificata di proteine ​​che hanno evoluto un&#39;ampia funzionalità in numerosi contesti e i dosaggi di chinasi sono stati incredibilmente utili nello studio di diverse proteine ​​di segnalazione e hanno contribuito notevolmente alla nostra attuale comprensione della comunicazione cellulare. In particolare, lo stesso test di base è stato utilizzato per caratterizzare due chinasi disparati nonostante le principali differenze nella struttura e nell&#39;attività. La chinasi WNK1 contiene una...

Le proteine ​​chinasi sono enzimi sofisticati critici per la trasmissione di segnali cellulari in risposte appropriate 1 . Considerati i loro ruoli nel mantenimento dell&#39;omeostasi e nella prevenzione o promozione degli stati di malattia 2 , i metodi biochimici per la valutazione dell&#39;attività di chinasi continuano ad essere strumenti potenti per delineare i particolari della segnalazione eucariotica 3 . Sebbene le strategie che utilizzino anticorpi specifici fosfo-specifici siano stati altamente informativi in ​​termini di misura degli effetti delle diverse condizioni di trattamento sullo stato di segnalazione cellulare 4 , un test di chinasi consente di misurare gli effetti di diverse condizioni di trattamento direttamente in termini di attività enzimatica di una chinasi di interesse. Mentre ci sono diverse opzioni per analisi simili che non utilizzano materiali radioattivi 5 , continuiamo a contare su questo metodo per una robusta quantità di risultati. LàSono due applicazioni tipiche di questo saggio, sia preziose per ragioni diverse: il dosaggio immunoprecipitato (IP) di chinasi ( Figura 1 ) e il test della chinasi della proteina ricombinante ( Figura 2 ). Il dosaggio di IP chinasi è estremamente utile per identificare fattori capaci di attivare specifiche chinasi proteiche, nonché condizioni di trattamento inibitorie di misura. In breve, una chinasi di interesse etichettata con epitopo viene trasfettata in cellule eucariotiche colte, sottoposte a una varietà di trattamenti, immunoprecipitati e analizzati per la capacità di incorporare fosfato radiomarcato in un substrato di modello ( ad es. Proteina di base di mielina (MBP)). Il test di kinasi IP può anche essere eseguito senza ricorrere all&#39;eccessiva espressione, sia mediante immunoprecipitazione della proteina endogena, o qualsiasi altro numero di tecniche di editing genomico. Poiché i trattamenti vengono somministrati in coltura, questo metodo può rilevare stimoli trasmessi attraverso più fattori a monteO percorsi paralleli mediante lettura in vitro . Un importante vantaggio di questo metodo è che non richiede una conoscenza preliminare di fattori diretti a monte oa valle o siti di fosforilazione in esso. Inoltre, una volta individuati substrati specifici per una chinasi di interesse, è possibile utilizzare lo stesso protocollo di analisi chinasi con componenti ricombinanti per misurare l&#39;attività specifica nei confronti dei substrati naturali e identificare siti specifici di fosforilazione in combinazione con l&#39;analisi di spettrometria di massa. I siti identificati in questo modo possono essere ulteriormente convalidati con i test di chinasi utilizzando mutanti del substrato. Infine, questo metodo può essere usato anche per rilevare e misurare l&#39;autofosforilazione. Il protocollo fornito qui presuppone uno schema di purificazione della proteina ottimizzata o metodo di trasfezione per esprimere una chinasi di affinità interessata nelle cellule colte. Per esposizioni più dettagliate di trasfezione, lisi, immunoprecipitazione e proteina purificazione protOcols, suggeriamo di riferirsi ai protocolli Cold Spring Harbour 6 . Per ulteriori informazioni riguardanti lo sviluppo e la modifica del test, consultare Proteine ​​Phosphorylation: Metodi selezionati in Enzimologia 7 .

<table><tbody><tr><td>Proteina A Sefarosio CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiomarcato [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive shielding</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 dye (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grado 3 carta da filtro qualitativa</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore sottovuoto per gel per lastre</td><td>Bio-Rad</td><td>Modello 583 Essiccatore per gel #1651745&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore Autorad</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Righello fosforescente</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Punti fosforescenti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Contatore Geiger</td><td>Ludlum</td><td>Modello 3 con rivelatore</td><td></td>44-9</tr><tr><td>Cassetta BioMax 8 x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Film 8" x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Schermo di intensificazione 8" x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Processore di pellicole mediche/radiografiche</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Fiale a scintillazione</td> Research <td>Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Fluido a scintillazione</td><td>MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Contatore a scintillazione</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;atp radioattivato

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Le proteine ​​chinasi sono in grado di governare cambiamenti cellulari su vasta scala in risposta a complessi array di stimoli, e molto sforzo è stato indirizzato a scoprire dettagli allosterici della loro regolazione. Le cinasi comprendono reti di segnalazione i cui difetti sono spesso segni distintivi di molteplici forme di cancro e malattie correlate, rendendo una piattaforma di analisi suscettibile di manipolare i fattori regolatori a monte e di convalida dei requisiti di reazione critici nella ricerca di terapie migliorate. Qui descriviamo un esame di base di chinasi che può essere facilmente adattato a specifiche questioni sperimentali, tra cui ma non limitandosi a verificare gli effetti degli agenti biochimici e farmacologici, manipolazioni genetiche come la mutazione e la delezione, nonché le condizioni di coltura cellulare e trattamenti a sonda Meccanismi di segnalazione cellulare. Questo saggio utilizza l&#39;ATP [γ- 32 P] radiomarcato, che consente confronti quantitativi e una chiara visualizzazione dei risultati e può essere modSe utilizzati con chinasi immunoprecipitati o ricombinanti, substrati specifici o tipizzati, in una vasta gamma di condizioni di reazione.

WNK1 IP kinasi Myc-tagged WNK1 è stato trasfettato in cellule HEK293 e immunoprecipitato con un anticorpo anti-Myc 11 . L&#39;immunoprecipitato ha mostrato l&#39;attività di chinasi verso il substrato del modello MBP e verso di sé ( Figura 1A ). I mutanti WNK1 sono stati quindi testati per l&#39;attività di chinasi verso MBP con lo stesso metodo, questa volta impiegando costrutti con GST-t...

Le chinasi di proteine ​​sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell&#39;attività di chinasi mediante l&#39;uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

L'obiettivo generale di questo saggio è misurare l'attività enzimatica delle proteine chinasi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione mediata da chinasi, come ad esempio quanto è attiva una chinasi o una sua variante mutante, la sua specificità e se la sua attività è sensibile a diversi trattamenti cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è al contempo versatile e quantitativa.Il procedimento sarà dimostrato da Steve Stippec, scienziato ricercatore presso il Cobb Laboratory, che ha una notevole esperienza con questo saggio. Per iniziare, aggiungere due microlitri di anticorpo a un milligrammo per millilitro a 200 microlitri di lisati cellulari e incubare a quattro gradi Celsius per un'ora sotto agitazione. Lavare le perle di proteina A-Sepharose da due a tre volte aggiungendo il buffer di lisi, quindi eseguire una breve centrifugazione a quattro gradi Celsius per 30 secondi fino a un minuto a 5000 ×g, rimuovere il soprannatante con una pipetta e risospendere le perle nel buffer.Successivamente, aggiungere 30 microlitri di sospensione al 50% di perle di proteina A-Sepharose in buffer di lisi ai lisati. Incubare i lisati a quattro gradi Celsius per un'ora sotto agitazione. Eseguire una breve centrifugazione a quattro gradi Celsius per formare il pellet delle perle e rimuovere il sopranatante.Lavare le perle tre volte con un millilitro di tampone di lavaggio per perle, seguito da una breve centrifugazione, quindi lavare le perle una volta con un volume di tampone di reazione per chinasi. Dopo la breve centrifugazione, rimuovere la maggior quantità possibile di tampone senza rimuovere le perle. Per avviare il saggio, aggiungere l'intera miscela di reazione al campione di chinasi.Incubare la reazione a 30 gradi Celsius per un periodo compreso tra cinque minuti e un'ora, a seconda dell'attività della chinasi in esame. Arrestare la reazione ponendola sul ghiaccio e aggiungendo 7,5 microlitri di buffer campione Laemmli 5X, quindi riscaldare la reazione a 100 gradi Celsius per tre-cinque minuti nel blocco termico. Dopo aver effettuato una breve centrifugazione, caricare 20 microlitri per pozzetto su un gel di SDS-PAGE 10-15%.Assicurarsi di mantenere l'apparato elettroforetico schermato per limitare l'esposizione al fosforo-32, poiché si tratta di un emettitore beta ad alta energia. Eseguire l'elettroforesi per un tempo sufficiente a separare la chinasi dal substrato. Al termine della corsa, rimuovere il gel dalle lastre di vetro e alluminio, quindi immergere il gel in 50 millilitri di colorante Coomassie per un'ora su un agitatore orbitale impostato a 50 giri al minuto.Per questo passaggio, utilizzare un contenitore leggermente più grande del gel stesso. Per decolorare il gel, spostarlo dalla soluzione di colorazione alla soluzione di fissaggio. Posizionare pezzi di schiuma o salviette da laboratorio annodate nel contenitore con il gel per assorbire il colorante Coomassie.Agitare il gel in 600-700 millilitri di soluzione fissativa durante la notte su un agitatore orbitale a 50 giri al minuto. Il giorno successivo, rimuovere il gel dalla soluzione fissativa e immergerlo in 200 millilitri di metanolo per uno o due minuti con agitazione delicata finché il gel non diventa bianco latteo. Questo aiuterà a prevenire crepe durante il passaggio di essiccazione.Successivamente, inumidire un pezzo di carta da filtro qualitativa di circa 14 centimetri per 14 centimetri con metanolo e posizionarlo su un essiccatore per gel a vuoto. Adagiare il gel sulla carta da filtro, con il lato frontale rivolto verso l'alto. Coprire con cura il gel con della pellicola trasparente, quindi accendere l'essiccatore, farlo funzionare e applicare il vuoto.Una volta raggiunto il vuoto dopo soli pochi secondi, eliminare le bolle d'aria utilizzando un rullo in gomma morbida. Proseguire l'esecuzione per 90 minuti. Rimuovere il gel essiccato e applicare un marcatore per autoradiografia, come un righello o un punto fosforescente, sulla carta da filtro dal lato del gel, quindi posizionarlo in una cassetta contenente uno schermo intensificatore.Utilizzare un contatore Geiger per verificare l'intensità del segnale. Per segnali più deboli, l'esposizione a temperature comprese tra -70 gradi Celsius e -80 gradi Celsius con una schermatura intensificatrice aumenterà la densità della banda sul film. In una camera oscura, posizionare un pezzo di film sopra il gel essiccato all'interno della cassetta per film contenente una schermatura intensificatrice.Se il valore CPM è pari a 100 o inferiore, provare un'esposizione notturna a meno 70-80 gradi Celsius. In alternativa, se il valore si avvicina a 10.000, iniziare con un'esposizione di un'ora e ottimizzare da quel punto. Al termine dell'esposizione, rimuovere la pellicola prima di svilupparla in un processore per pellicole mediche o radiografiche.Contrassegnare sul film le bande corrispondenti ai marcatori proteici. Inoltre, etichettare i marcatori proteici e le corsie delle reazioni per riferimenti futuri. Ritagliare dal gel le bande corrispondenti alle bande di interesse sul film.Posizionare le bande in vial da sette millilitri e aggiungere quattro millilitri di liquido scintillante. Contare le bande utilizzando un contatore a scintillazione liquida. Verificare che il contatore sia impostato per monitorare la finestra dello spettro energetico corretta per il fosforo-32.Procedere all'analisi dei risultati come descritto nel protocollo testuale. Le frazioni di ERK2 purificate sono state utilizzate in un saggio di chinasi con MBP in presenza o assenza di MEK1R4F, un attivatore costitutivo dell'attività chinasi di ERK2. In un esperimento simile, un saggio di chinasi MBP è stato utilizzato per misurare l'attività di mutanti ricombinanti di ERK2 purificati da colture batteriche rispetto alla proteina di tipo selvaggio.Sebbene ERK2 fosse in grado di fosforilare MBP quando stimolato da MEK1R4F, l'attività chinasica di ERK2 è drasticamente abolita dalla mutazione della lisina catalitica o di una treonina vicina ai siti canonici di fosforilazione doppia. ERK2 T188D ed ERK2 T188E mostrano un'attività chinasica marginale nei confronti di un piccolo peptide flessibile. Tuttavia, non sono in grado di fosforilare in modo robusto i substrati noti di ERK2, Nup153 e PDX1, come osservato con ERK2 di tipo selvaggio.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno o due giorni se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare l'ATP radioattivo per saggire l'attività delle proteine chinasi, al fine di comprendere meglio le reti di segnalazione in cui queste sono coinvolte. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare il protocollo di precipitazione degli amminoacidi per l'arricchimento delle chinasi di interesse, al fine di bilanciare le quantità di proteina, e di misurare le concentrazioni della proteina ricombinante per garantire confronti accurati dell'attività chinasi.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della segnalazione cellulare per esplorare percorsi specifici di trasduzione e il loro ruolo nella regolazione omeostatica, nonché il loro contributo alla progressione delle malattie. Non dimenticare che lavorare con materiali radioattivi può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale, durante l'esecuzione di questa procedura.

assaying-protein-kinase-activity-with-radiolabeled-atp

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Chinasi Ripetere leucina Rich 2 è una chinasi multidominio grande, le cui mutazioni sono la causa genetica più comune della malattia di Parkinson. Analisi delle attività di questa proteina chinasi ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per comprendere la biologia e la disfunzione di questa proteina. In questo...

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L'approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

Questo video mostra un test enzimatico basato sulla cromatografia su strato sottile per determinare l'attività della pirofosfochinasi utilizzando nucleotidi radiomarcati. Il metodo fornisce informazioni sulla sintesi nucleotidica e sulle reazioni di fosfotrasferimento.

Saggio dell'attività enzimatica basato sulla cromatografia su strato sottile: una tecnica per determinare l'attività della pirofosfochinasi in vitro utilizzando la cromatografia su strato sottile

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine ​​multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Descriviamo un protocollo di base per quantificare l'attività dell'ATPasi in vitro. Questo protocollo può essere ottimizzato in base al livello di attività e ai requisiti di una data ATPasi purificata.

misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Attività ATPasi per enzimatica Caratterizzazione

Segnaliamo e dimostriamo un saggio ottimizzato di legame della nitrocellulosa che può essere utilizzato per quantificare l'autofosforilazione delle istidina chinasi batteriche purificate. Il nostro metodo presenta diversi vantaggi rispetto alle tradizionali tecniche basate su SDS-PAGE, fornendo una valida alternativa per la caratterizzazione di queste importanti proteine.

Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

I test di concorrenza del peptide sono ampiamente usati in una varietà di esperimenti molecolari ed immunologici. Questo documento descrive un metodo dettagliato per un test in vitro di oligopeptide-concorrenza e le relative procedure di convalida, che possono essere utili per trovare siti specifici di fosforilazione.

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Qui, descriviamo un metodo per purificare enzimi pyrophosphokinase istidina-etichettate e utilizzando la cromatografia su strato sottile di radiomarcato substrati e prodotti di test per l' attività enzimatica in vitro. L'analisi di attività dell'enzima è ampiamente applicabile a qualsiasi chinasi, ciclasi del nucleotide o reazione di fosforo-trasferimento cui meccanismo include idrolisi di trifosfato del nucleotide.

Una purificazione e l'analisi di attività In Vitro per un ppGpp (p) sintetasi da Clostridium difficile

Abbiamo caratterizzato una nuova proteina della chinasi utilizzando robusti approcci biochimici: analisi Western Blot con un anticorpo specifico dedicato su diverse linee cellulari e tessuti, interazioni con esperimenti di coimmunoprecipitazioni, attività della chinasi rilevata da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico per ilfosforo e con l'etichettatura ATP di z[32 P].

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Questo protocollo descrive un saggio nonradioattivo per misurare l'attività della chinasi delle chinasi polinucleotide (PNKs) su piccoli substrati di DNA e RNA.

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Impara a misurare l'attività enzimatica delle chinasi proteiche utilizzando ATP radioattivo. Questo metodo versatile e quantitativo aiuta a studiare i meccanismi di segnalazione cellulare.

Analizzare l'attività della proteina con l'ATP radioattivato

Esplora altri video