Rilevamento dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale dei ratti usando il quantitativo PCR in tempo reale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di purificare e rilevare con successo i miRNA nella membrana peritoneale del ratto. Per iniziare questa procedura, dopo anestesia inalatoria con isoflurano al 4%. Spruzzare la pelle addominale del ratto con etanolo al 70% e montarlo sul foglio di sughero, sul dorso.

Quindi praticare un'incisione longitudinale nella pelle addominale, nei muscoli e nella membrana peritoneale dell'animale usando forbici e pinze. Prelevare la membrana peritoneale usando la pinza e praticare incisioni orizzontali sulla sua parte superiore lungo l'osso costale più basso sotto il diaframma. E sul lato inferiore sulla regione laterale usando le forbici chirurgiche.

Successivamente, praticare incisioni longitudinali laterali per rimuovere la membrana peritoneale dal corpo, utilizzando le forbici chirurgiche. Quindi lavarlo con PPS in una capsula di Petri. Ritagliare e tagliare 20 milligrammi di campione di membrana peritoneale.

In questa procedura, inserire un campione di membrana peritoneale da 20 milligrammi in un omogeneizzatore di vetro. E aggiungere 700 microlitri di reagente di lisi a base di fenolo guanidina. Successivamente, omogeneizzare il campione della membrana peritoneale su ghiaccio, premendo lentamente un pestello sul campione con la torsione.

Ripetere questo processo diverse dozzine di volte, fino a quando il campione della membrana peritoneale non si è completamente dissolto nel reagente di lisi a base di fenolo guanidina. Per un'ulteriore omogeneizzazione, trasferire il lisato omogeneizzato in un sistema di triturazione di biopolimeri nella colonna di centrifuga per microcentrifuga in una provetta di raccolta da due millilitri. Quindi centrifugare a 14.000 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi, trasferire il lisato omogeneizzato in una nuova provetta per microcentrifuga. Aggiungere 140 microlitri di cloroformio al lisato omogeneizzato e tappare bene la provetta. Successivamente, miscelare il tubo per inversione per 15 secondi.

Successivamente, incubare il campione per due o tre minuti a temperatura ambiente. Successivamente, centrifugare a 12.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 300 microlitri di surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga, senza disturbare il precipitante.

E aggiungi 450 micro litri di etanolo al 100%. Quindi mescolare il campione agitando per cinque secondi. Quindi pipettare fino a 700 microlitri di campione in una colonna rotante a base di membrana in silicone, posta in una provetta di raccolta da due millilitri, e chiudere il tappo.

Quindi centrifugare a 15.000 volte G per 15 secondi. Dopo la centrifugazione, scartare il flusso nella provetta di raccolta. Quindi aggiungere 700 microlitri di tampone di lavaggio 1 alla colonna di centrifuga a base di membrana di silicone per lavare rigorosamente il campione e chiudere il tappo.

Centrifugare a 15.000 volte G per 15 secondi. Dopo la centrifugazione, scartare il flusso nella provetta di raccolta. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio 2, alla colonna di centrifuga a base di membrana di silice, per rimuovere ogni traccia di sale, e chiudere il tappo.

Quindi centrifugare a 15.000 volte G per 15 secondi. Dopo la centrifugazione, eliminare il flusso e la provetta di raccolta e ripetere nuovamente questa procedura. Quindi, centrifugare nuovamente la colonna di centrifuga a base di membrana di silice a 15.000 volte G per un minuto.

Dopo la centrifugazione, eliminare la provetta di raccolta e l'eventuale flusso attraverso. Posizionare la colonna di centrifuga a base di membrana di silice in una nuova provetta di raccolta da uno virgola cinque millilitri. Quindi trasferire 25 microlitri di acqua priva di RNasi sulla colonna e chiudere il tappo.

Lasciare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare a 15.000 volte G per un minuto. Successivamente, trasferire l'alouette da 25 microlitri contenente l'RNA totale in una nuova provetta per microcentrifuga e conservarla a meno 80 gradi Celsius prima dell'uso.

In questa procedura, preparare una soluzione di miscela master che contenga due microlitri di miscela di acidi nucleici 10x, due microlitri di miscela di trascrittasi inversa e quattro microlitri di tampone Hispec 5x, per un totale di 8 microlitri per provetta. Quindi erogare 8 microlitri della soluzione master mix in ciascuna provetta. Misurare la quantità degli RNA totali utilizzando uno spettrofotometro.

Successivamente, aggiungere un microgrammo di RNA totali isolati, purificati dal campione di membrana peritoneale, a ciascuna provetta. Successivamente, aggiungere acqua priva di RNasi a ciascun tubo per portarlo a un totale di 20 microlitri. Quindi mescolarlo accuratamente pipettandolo e centrifugarlo per 15 secondi.

Successivamente, incubare il campione per 60 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi incubarlo per cinque minuti a 95 gradi Celsius. Trasferire il cDNA appena generato in una nuova provetta per microcentrifuga e diluirlo 10 volte con acqua priva di RNasi.

In questa procedura, preparare una miscela master contenente 12 virgola cinque microlitri di 2x PCR master mix, due virgola cinque microlitri di cinque micromolari di ciascun primer miRNA disciolto in acqua priva di nucleasi e un virgola due cinque microlitri di 10x primer universale, per ogni pozzetto. Erogare 22 virgola cinque microlitri di questa miscela master in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi aggiungere due virgola cinque microlitri di cDNA stampo a ciascun pozzetto.

Sigillare la piastra di reazione a 96 pozzetti con un pezzo di pellicola. Quindi centrifugare a 1.000 volte G per 30 secondi. Per eseguire il programma di ciclo PCR, impostare la piastra nello strumento PCR in tempo reale.

Nel software di PCR in tempo reale, definire le proprietà sperimentali. Successivamente, assegna i nomi ai campioni e ai miRNA target in ciascun pozzetto. Quindi, in tempo reale, il software PCR inserisce un volume di reazione di 20 microlitri e le seguenti condizioni di ciclo PCR in conformità con le istruzioni.

Pre incubazione a 95 gradi Celsius per 15 minuti. E poi 40 cicli di denaturazione a 94 gradi Celsius per 15 secondi, e in ginocchio a 55 gradi Celsius per 30 secondi, e in estensione a 70 gradi Celsius per 30 secondi. Sulla base del miRNA, dello screening con micro array, è stato riscontrato che i livelli di sei miRNA sono significativamente aumentati nella membrana peritoneale dei ratti con fibrosi peritoneale, rispetto a quelli dei ratti finti e dei ratti di controllo, utilizzando QRTCPR, seguendo il protocollo presentato in questo manoscritto.