Name: zebrafish In Situ Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Impara la preparazione in situ del midollo spinale di zebrafish per registrazioni elettrofisiologiche da neuroni sensoriali e motori. Questo metodo consente di studiare l'eccitabilità elettrica durante le fasi embrionali e larvali.

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Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH (NS059120 F32 per RLM e R01NS25217 e P30NS048154 a ABR).

Gli autori dichiarano alcun interesse finanziario in competizione.

I metodi qui descritti consentono la caratterizzazione elettrica e morfologica dei neuroni sensoriali e motori di embrioni zebrafish dopo minima dissezione del midollo spinale. Neuroni restano sani per almeno 1 h, il limite di tempo imposto su queste registrazioni. I neuroni sono stati registrati utilizzando la configurazione a cellula intera serie, così come da patch nucleate; quest&#39;ultimo metodo minimizza problemi di spazio-clamp che può precludere uno studio biofisico dettagliato delle correnti ioniche <sup class...

<html> George Streisinger aperto la strada all&#39;uso di Danio rerio, comunemente noto come pesce zebra, come sistema modello per l&#39;analisi genetica di sviluppo dei vertebrati 10. Il modello offre diversi vantaggi tra cui: (1) relativamente semplice e poco costoso zootecnia; (2) fecondazione esterna, consente un facile accesso alle embrioni dalle prime fasi di sviluppo; e (3) un embrione trasparente, permettendo osservazioni dirette e ripetute di cellule, tessuti e organi in quanto costituiscono. Nel corso dei decenni successivi, numerosi miglioramenti aumentato ulteriormente la potenza del modello di zebrafish. In particolare, gli schermi genetici avanti e sforzi sequenziamento dell&#39;intero genoma giocato un ruolo chiave nella identificazione di mutazioni e geni critici per molti processi di sviluppo 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, 16 metodi di clonazione. Gateway hanno permesso l&#39;applicazione di routine di transgenico si avvicina a 17, 18. I recenti progressi nella modifica del genoma, esemplificato dalla trascrizione attivatore-simile (Talens) e cluster regolarmente intervallati ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) -Cas9 nucleasi, consentire l&#39;introduzione mirata di mutazioni, così come knock-out e knock-in si avvicina 19, 20, 21, 22. combinata, questi metodi fanno zebrafish un potente modello per lo studio dei meccanismi genetici sottostanti specifici comportamenti e diverse malattie umane 23, 24, 25, 26, 27. Questo lavoro si concentra su svilupporegolazione mentale e il ruolo dell&#39;attività elettrica nello sviluppo neuronale. L&#39;attenzione è sul midollo spinale, per cui il modello zebrafish fornisce diversi vantaggi. In primo luogo, è relativamente facile accedere zebrafish nelle fasi embrionali e larvali; Pertanto, si può studiare la funzione del midollo spinale durante fasi di sviluppo che hanno meno neuroni e semplice circuiteria 28, 29. Inoltre, il midollo spinale zebrafish ha un diverso insieme di neuroni, simile ad altri vertebrati, come dimostrato dai modelli caratteristici e distintivi di fattori di trascrizione 30, 31, 32, 33, 34, 35. La maggior parte degli studi in zebrafish che mirano a scoprire i meccanismi che stanno alla base del funzionamento dei circuiti del midollo spinale, specialmentequelli che supportano locomozione, sono comprensibilmente focalizzati su stadi larvali 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Tuttavia, molti dei neuroni che formano le reti locomotiva spinali iniziato la loro differenziazione nelle fasi embrionali, ~ 9-10 ore dopo la fecondazione (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. In considerazione di ciò, comprendere come le proprietà morfologiche ed elettriche dei neuroni spinali sorgono e cambiamento tra gli stadi embrionali e larvali è importante per un overall comprensione della formazione circuito motorio e funzione. I metodi di dissezione qui descritti permettono registrazioni di patch clamp da neuroni spinali e sono stati applicati con successo nelle fasi embrionali (~ 17-48 HPF) e stadi larvali (~ 3-7 giorni dopo la fecondazione [dpf]). Questo approccio limita la quantità di dissezione necessaria per fornire l&#39;accesso ai neuroni di interesse. Il protocollo differisce dalla maggior parte degli altri metodi pubblicati per la registrazione da neuroni spinali zebrafish a che la colla veterinario sutura viene utilizzata, anziché un perno di tungsteno fine, per fissare l&#39;embrione o larva alla camera di registrazione. La disponibilità di due approcci differenti (cioè, colla sutura rispetto al perno tungsteno) per il montaggio delle zebrafish embrioni o larve per l&#39;analisi elettrofisiologica fornisce ai ricercatori opzioni alternative per raggiungere i loro obiettivi sperimentali specifiche. In primo luogo, le procedure per l&#39;accesso e la registrazione da un pop<html> ulation di neuroni sensoriali primarie, cellule ROHON-barba, sono descritti. I corpi cellulari di questi neuroni si trovano all&#39;interno del midollo spinale dorsale. Cellule ROHON-barba esistono in numerose specie di vertebrati, differenziano prime fasi di sviluppo, e alla base la risposta al tocco embrionale 6, 44, 47, 48. In secondo luogo, le procedure per l&#39;accesso e la registrazione da motoneuroni spinali sono dettagliate. Zebrafish motoneuroni spinali sorgono durante due onde di neurogenesi. Motoneuroni primari precedenza nati sorgono a fine gastrulazione (~ 9-16 HPF), con solo 3-4 motoneuroni primari presenti per hemisegment 45, 46, 49. Al contrario, la popolazione più tardi-nato motoneuroni secondari è più numerose e si verifica durante un periodo prolungato, da ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. secondario motoneurone genesi segmenti metà tronco principalmente è completata da 51 HPF 50. motoneuroni secondari sono considerati la controparte dei motoneuroni del amnioti 46. È interessante notare che i neuroni sovraspinali, tramite dopamina, regolano locomozione la larva e motore secondario neurone genesi nell&#39;embrione e giovane larva 50, 51. motoneuroni primari e secondari comprendono ciascuno diversi sottotipi differenti. ogni motore primario progetti neurone sottotipo un assoni periferici che innerva un gruppo muscolare caratteristico, con un conseguente stereotipo, identificando traiettoria assonale. Generalmente, i motoneuroni secondari seguono percorsi assonale prestabiliti dalla motoneuroni primari. Pertanto, rispetto a traiettorie assoni, motoneuroni primari e secondari sono simili, con l&#39;eccezione che lo spessore assonale e somata dimensione are maggiore per motoneuroni primari 45. In terzo luogo, i metodi per la registrazione da alcuni tipi di interneuroni sono discussi. Tuttavia, in questi casi, è richiesta una quantità limitata di rimozione di altre cellule del midollo spinale, e quindi il midollo spinale è meno intatta che per registrazioni da cellule ROHON-barba o neuroni motori.

<table><tbody><tr><td>Filtro sottovuoto/Flacone di stoccaggio, pori da 0,22 mm</td><td>Corning</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa 0,2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>Etile 3-amminobenzoato metansolfonato sale&nbsp;</td></tr><tr><td>&alfa;-bugarotossina</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotossina</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 sale di idrazina</td><td>Sonde molecolari</td><td>A-10438</td><td>colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Filtro per provette da centrifuga Spin-X</td><td>Corning</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silicone kit di elastomeri</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>elastomero siliconico</td></tr><tr><td>piastre di Petri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>capillari in vetro borosilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>diametri interni ed esterni di 0,78 e 1,0 mm (capillari in vetro a parete sottile)</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>diametri interni ed esterni di 1,13 e 1,55 mm (capillari in vetro a pareti spesse)</td></tr><tr><td>Raccordo miniaturizzato in polipropilene spinato&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo per tessuti Vetbond&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per microelettrodi</td><td>Sutter Instruments</td><td>&nbsp; Modello P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivi</td><td>molecolari</td> amplificatori <td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivi molecolari</td><td>per stadio di testa</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore motorizzato&nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubo</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN e WALL 1/32 IN (tubo flessibile da laboratorio)</td></tr><tr><td>Portaelettrodo</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal Rubinetti a tre vie&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Digitalizzatore</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0.80W Obiettivo Achroplan</td><td>Software di</td> acquisizione e analisi dati Zeiss<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex e Clampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modello P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Soluzioni di dissezione e registrazione (in mM)</td></tr><tr><td>Tutte le soluzioni, ad eccezione di quella intracellulare, sono stabili per ~2-3 mesi se filtrate (coppe filtranti da 0,22 mm) e conservate a temperatura ambiente (RT).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>La soluzione intracellulare viene filtrata (filtri per siringhe da 0,2 mm) e conservata congelata (-20 &deg; C) in piccole aliquote che vengono scongelate singolarmente il giorno dell'uso.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dissezione/suoneria' </td><td></td><td></td> soluzione <td>145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2,2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (con NaOH)</td></tr><tr><td>Pipetta (intracellulare) soluzione</td><td></td><td></td> di registrazione <td>135 KCl, 10 EGTA-acido, 10 HEPES; pH 7,4 (con KOH).</td></tr><tr><td>Soluzione di registrazione a bagno (extracellulare)/pinza amperometrica</td><td></td><td></td><td>125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (con NaOH).</td></tr><tr><td>Soluzione madre di sale di idrazina Alexa-594.&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Preparare un stock da 13,2 mM in ddH2O, aliquota (~100 &micro; l) e conservare a -20 &deg;C. Per l'uso, diluire la soluzione madre 132 volte con la soluzione pipettata fino a una concentrazione finale di 100 mM. Dopo la diluizione, filtrare la soluzione per pipette contenente Alexa-594. con un filtro a provetta da centrifuga.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Agenti immobilizzanti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4% sale di etil 3-amminobenzoato metansulfonato (Tricaina)</td><td></td><td></td><td>Preparare una soluzione madre allo 0,4% in 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Tricaina/100 mL 0,2 M Tris</td></tr><tr><td colspan="4">Regola il pH a 7 con NaOH e conserva a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Per l'uso, diluire la soluzione madre ~25 volte in terreno embrionale</td></tr><tr><td>250 mM &alfa;-bungarotossina</td><td></td><td></td><td>Preparare un stock da 250 mM in ddH2O (1 mg/500 mL), preparare 100 &micro; L aliquote, e sotre a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Per l'uso, diluire 2.500 volte con soluzione extracellulare fino a una concentrazione finale di 100 nM.</td></tr><tr><td>1 mM di tetrodotossina</td><td></td><td></td><td>Preparare un stock da 1 mM in ddH2O (1 mg/3 mL), preparare 100 &micro; L aliquote, e sotre a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Per l'uso, diluire 2.000 volte con una soluzione extracellulare fino a una concentrazione finale di 500 nM.</td></tr></tbody></table>

zebrafish<em&gt; in situ</em&gt; spinal cord preparazione per elettrofisiologiche le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, introdotto come modello di sviluppo, hanno guadagnato popolarità in molti altri campi. La facilità di allevamento gran numero di organismi rapido sviluppo, combinata con la chiarezza ottica embrionale, servito come attributi convincenti iniziali di questo modello. Nel corso degli ultimi due decenni, il successo di questo modello è stato ulteriormente spinto dalla sua riconducibilità agli schermi di mutagenesi su larga scala e dalla facilità di transgenesi. Più di recente, gene-editing approcci hanno esteso la potenza del modello. Per gli studi neurologico, zebrafish e larva forniscono un modello a cui possono essere applicati diversi metodi. Qui, ci concentriamo sui metodi che consentono lo studio di una proprietà essenziale dei neuroni, eccitabilità elettrica. La nostra preparazione per lo studio elettrofisiologico dei neuroni spinali zebrafish implica l&#39;uso di colla veterinario sutura per fissare la preparazione ad una camera di registrazione. Metodi alternativi per la registrazioneda embrioni zebrafish e larve comportare l&#39;attacco della preparazione per la camera con un perno multa tungsteno 1, 2, 3, 4, 5. Un perno di tungsteno è più spesso utilizzato per montare il preparato in un orientamento laterale, anche se è stato utilizzato per montare larve dorsale rivolta verso l&#39;alto 4. La colla sutura è stato utilizzato per montare embrioni e larve in entrambi gli orientamenti. Utilizzando la colla, una dissezione minima può essere eseguita, consentendo l&#39;accesso ai neuroni spinali senza l&#39;uso di un trattamento enzimatico, evitando così ogni danno risultante. Tuttavia, per le larve, è necessario applicare un trattamento enzimatico breve per rimuovere il tessuto muscolare che circonda il midollo spinale. I metodi descritti qui sono stati utilizzati per studiare le proprietà elettriche intrinseche dei neuroni motori, interneuroni e neuroni sensoriali in diversi Sviluppo deil stadi 6, 7, 8, 9.

Noi abbiamo registrato con successo da neuroni ROHON-barba in 17 HPF embrioni a 7 dpf larve (Figura 5A e 5B). Quando sono stati registrati cellule ROHON-barba, la preparazione è stata montata dorsale rivolta verso l&#39;alto. Tale montaggio consente l&#39;identificazione univoca delle cellule ROHON-barba basati sulle loro posizioni dorsali superficiali e grandi dimensioni soma. L&#39;identificazione è ulteriormente confermata dal potenziale di membrana a...

Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

L'obiettivo generale di questa preparazione è consentire lo studio elettrofisiologico dei neuroni spinali del pesce zebra in situ nelle fasi embrionali e larvali. Le analisi elettrofisiologiche si affiancano agli approcci genetici e di imaging particolarmente efficaci offerti dal modello di pesce zebra. Sebbene il metodo sia stato inizialmente sviluppato per lo studio dei neuroni di Rohon-Beard, abbiamo facilmente adattato l'approccio nel tempo e ora possiamo studiare diversi tipi di neuroni spinali.La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Rosa Moreno, un'assistente di ricerca, con la quale ho avuto il piacere di collaborare per molti anni. Per iniziare questa procedura, rimuovere la lampadina nera da un foro in vetro e sostituirla con un adattatore di gomma bianco proveniente da un altro foro in vetro. Successivamente, tagliare un pezzo di tubo flessibile a una lunghezza di circa 38 centimetri.Quindi, collegare il tubo flessibile tramite un piccolo raccordo retto in polipropilene. Per preparare l'elastomero di silicone, aggiungere la base e l'agente indurente in un tubo conico di plastica in un rapporto di quattro a uno. Successivamente, mescolare accuratamente la base dell'elastomero e l'agente indurente.Versare la miscela in due piastre di Petri da 100 millimetri, fino a una profondità di circa un millimetro in una piastra e di circa 2,5 millimetri nell'altra. Lasciare indurire l'elastomero di silicone esponendolo all'aria per quattro o cinque giorni. Se è necessario ottenere l'elastomero indurito più rapidamente, incubarlo a 60 gradi Celsius.In seguito, ritagliare un rettangolo di 3,8 centimetri per 6,3 centimetri dall'elastomero indurito dello spessore di un millimetro, da utilizzare come fondo della camera. Dal silicone indurito dello spessore di 2,5 millimetri, ritagliare un rettangolo di 3,8 centimetri per 6,3 centimetri. Da questo, quindi, ritagliare un rettangolo interno di 2,5 centimetri per cinque centimetri per ottenere una cornice per la parte superiore della camera.Per preparare la camera di dissezione, posizionare il rettangolo di silicone sottile direttamente sopra il vetrino, assicurandosi di rimuovere tutte le bolle d'aria tra il silicone e il vetro. Successivamente, posizionare il telaio rettangolare di silicone sopra lo strato inferiore sottile di silicone. In questo procedimento, inserire un embrione in una camera di dissezione contenente due o tre millilitri di soluzione di Ringer.Immobilitare l'embrione aggiungendo 100 microlitri di soluzione di tricaina allo 0,4% nella camera. Successivamente, tirare alcune micropipette per iniezione con punte lunghe e sottili dal vetro a parete sottile utilizzando un estrattore di micropipette. Fissare una micropipetta di vetro estratta al fondo di vetro del dispenser di colla.Sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare delle pinzette per rompere la punta della micropipetta di vetro, ottenendo una punta di circa 75 micrometri di diametro. Successivamente, caricare la micropipetta di vetro con tre-cinque microlitri di colla applicando aspirazione attraverso il bocchino. Portare la punta riempita di colla nella camera di dissezione.Avvicinare quindi la punta della micropipetta caricata con colla vicino alla testa dell'embrione, mantenendo una leggera pressione positiva sulla micropipetta tramite il tubo orale. Una volta che la punta è vicina alla testa dell'embrione, applicare una pressione positiva sufficiente per espellere una piccola goccia di colla sul fondo della camera. Utilizzare un ago da dissezione per spostare l'embrione verso la goccia di colla in modo che la testa entri in contatto con la colla.Orientare l'embrione con il lato dorsale rivolto verso l'alto e premere sulla testa per assicurare un buon contatto con la colla. Mentre la colla si indurisce lentamente, utilizzare il perno da dissezione per riposizionare l'embrione in modo che giaccia con il lato ventrale verso il basso e il lato dorsale verso l'alto. Immergere il perno da dissezione nella goccia di colla e trascinare alcuni filamenti di colla sopra e attraverso la testa dell'embrione per fissarne ulteriormente la posizione.Una volta che la testa è saldamente attaccata alla silicone e la colla si è solidificata, sacrificare l'embrione eseguendo una transezione a livello del romboencefalo mediante un altro microcapillare di vetro. Utilizzare un microcapillare di vetro nuovo per effettuare diversi tagli superficiali della cute in posizione caudale rispetto al romboencefalo. Perforare superficialmente la cute muovendo il capillare perpendicolarmente all'asse rostro-caudale su ciascun lato del tronco per i campioni montati dorsalmente, oppure sul lato esposto del tronco per i campioni montati lateralmente.Per creare un lembo di pelle che le pinzette possano afferrare, raschiare ripetutamente la pelle con la micropipetta, a livello e perpendicolarmente al taglio iniziale. Utilizzando le pinzette, sollevare gradualmente il lembo di pelle e tirare la pelle in direzione caudale. Successivamente, applicare una piccola goccia di colla vicino alla coda dell'embrione.Utilizzare questa colla per attaccare la coda alla base della camera di dissezione. Mentre la colla si indurisce, regolare la posizione del tronco con il perno di dissezione per assicurarsi che il tronco rimanga orientato dorsalmente e che sia saldamente fissato alla camera. Dopo questa dissezione iniziale, risciacquare abbondantemente il preparato con soluzione di Ringer per rimuovere la tricaina e i detriti, e lasciare riposare il preparato per cinque minuti.Successivamente, sostituire la soluzione di dissezione con la soluzione extracellulare per la registrazione. Se necessario, aggiungere un agente immobilizzante alla preparazione. Successivamente, trasferire la camera di dissezione con l'embrione montato sul piano di un microscopio composto eretto, dotato di un obiettivo a immersione in acqua con lunga distanza lavorativa 40 X.Quindi montare un capillare vuoto in vetro borosilicato con parete spessa sull’elettrodo del supporto della testata. Collegare un tubo a un’estremità all’uscita d’aria del supporto dell’elettrodo e all’altra estremità a un rubinetto a tre vie. Successivamente, posizionare un boccaglio a un’estremità di un altro tratto di tubo e collegarlo al rubinetto a tre vie all’altra estremità.Successivamente, portare la punta della pipetta micrometrica alla porzione più dorsale del midollo spinale e penetrare delicatamente le meningi. Proseguire con movimenti laterali rapidi e brevi per allentare le meningi. Una volta che la punta della pipetta micrometrica ha attraversato le meningi, avanzare e sollevare la pipetta per staccare le meningi dal midollo spinale.Spostare successivamente la pipetta micrometrica in avanti di uno o due emisegmenti per esporre le cellule dei barbigli di Rohon. Nella nostra esperienza, i neuroni dei barbigli di Rohon sono più fragili rispetto ad altri neuroni spinali. Per mantenerli in buono stato, ne esponiamo uno o due alla volta.I registrazioni in modalità voltage clamp delle correnti uscenti ed entrate sono state ottenute dai neuroni di Rohon-Beard in embrioni e larve a uno, due e sette giorni dalla fecondazione. Il potenziale di mantenimento era di 80 millivolt e le correnti sono state evocate da un passo depolarizzante a +20 millivolt. In modalità current clamp, un'iniezione di corrente di 0,35 nanoampere per un millisecondo induce un singolo potenziale d'azione nei neuroni di Rohon-Beard sia negli embrioni che nelle larve.In assenza di stimolazione elettrica, i neuroni di Rohon-Beard non mostrano attività di spiking spontanea. Il potenziale di riposo dei neuroni di Rohon-Beard diventa progressivamente più negativo durante lo sviluppo. Una volta acquisita questa tecnica, gli embrioni possono essere montati e dissezionati per esporre i neuroni di Rohon-Beard entro 10 minuti.Come menzionato nel protocollo, è importante comprendere i fattori che determinano la velocità con cui la colla si indurisce. Questo video evidenzia i passaggi fondamentali per la registrazione dai neuroni spinali nel pesce zebra.

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