Name: In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Scopri come valutare in vitro e in vivo la capacità soppressiva delle cellule regolatorie nel trapianto cardiaco di ratto. Questo protocollo permette di studiare l'induzione della tolleranza immunologica.

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Quest'opera è stata realizzata nell'ambito del progetto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) che è parte del programma di governo francese "Investissements d'Avenir" gestito da ANR (ANR-11-LABX-0016-01) e dal progetto IHU-Cesti finanziato anche dal " Programma di governo francese di investissements d'Avenir", gestito da Francese Nazionale Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e Région Pays de la Loire.

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Trasferimento adottivo di totale splenocytes in un destinatario appena innestato è un modo efficace per rilevare la presenza di cellule regolatorie indotta o rafforzato da un trattamento. Linfopenia transitoria indotta per irradiazione di host promuove la sopravvivenza delle cellule dopo il trasferimento e l'istituzione di tolleranza. Inoltre, irradiazione subletale lascia tempo per cellule con proprietà tollerogeniche per convertire in nuove cellule regolatorie durante la ricostituzione immunitaria, un fenomeno chiamato...

L'allotrapianto cardiaco nel ratto è un modello di trapianto di organo affidabile per valutare i trattamenti di induzione di tolleranza, a decifrare i meccanismi di induzione di tolleranza e di manutenzione e ha il potenziale di indurre cellule regolatorie funzionalmente competenti e dominante. I seguenti protocolli descrivono un completamente mancata corrispondenza heterotopic cardiaco innesto da un ratto di donatore 1W (LEW.1W, RT1u) di Lewis in un topo di Lewis 1A destinatario (LEW.1A, RT1un). In questa combinazione di innesto, rigetto acuto si verifica rapidamente (in circa 7 giorni) e può essere facilmente valutata tramite innesto battendo attraverso la palpazione dell'addome. Qui vi proponiamo tre protocolli per indurre la tolleranza per l'allotrapianto cardiaco nel ratto. In questi modelli, tolleranza è indotta e/o mantenuto da tipi differenti delle cellule normativo. Primo, il blocco di CD40-CD40L interazioni con un adenovirus codifica CD40Ig (AdCD40Ig) ha indotto la generazione di CD8+ Treg in grado di indurre tolleranza quando passivamente trasferiti a destinatari secondari innestate1. Inoltre, lo svuotamento di CD8+ di cellule (con gli anticorpi anti-CD8α) AdCD40Ig-trattati destinatari generati Bregs e RegMCs2. Analisi profonda dei CD8+ Treg proprietà ha evidenziato il ruolo chiave di parecchie molecole immunoregulatory definito come interleukin-34 (IL-34) e Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Considerando che la sovraespressione di IL-34 (con un vettore AAV) indotto Treg attraverso la generazione di RegMCs, la sovraespressione di FGL-2 indotta Bregs, sottostante la complessa rete di cellule regolatorie.
Perché rigetto cronico si sviluppa lentamente ed è a lungo termine, per distinguere la tolleranza contro il rigetto cronico è necessaria un'analisi approfondita. Innesto di solito viene valutata per l'infiltrazione delle cellule, fibrosi, ispessimento della deposizione di C4d vascolare parete e complemento di immunohistology7. Mentre l'istologia metodi richiedono sacrificio animale o biopsia del trapianto, qui descriviamo un metodo semplice per valutare diverse caratteristiche del documento non autografo tollerato: l'emersione e la funzione delle cellule regolatorie e le risposte di anticorpi specifici anti-donatore di sangue campione di citometria a flusso (qui, abbiamo usato la fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS)).
Manutenzione di tolleranza per il documento non autografo dopo l'arresto del trattamento è generalmente associato con l'induzione di cellule regolatorie8. Negli ultimi decenni, gli studi focalizzati su CD4+Treg caratterizzato all'unanimità li dagli indicatori chiavi Foxp3+, CD25altoe CD127–9,10,11. Allo stesso modo, parecchi indicatori sono stati attribuiti a CD8+ Treg, come CD122+, CD28-, CD45RCbasso, PD1+e Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. nel corso degli anni, l'espressione di GITR, CTLA4 e citochine (IL-10, TGFβ, IL-34, IL 35, FGL-2) sono state inoltre associate a un Treg profilo3,4,6,13, 18,19,20,21. Tuttavia, la mancanza di popolazioni di cellule normativi emergenti, quali Bregs, RegMCs o NKTregs, marcatori specifici pertinenti. Infatti, Bregs per lo più vengono segnalati come immaturi CD24+ cellule, con espressione ambigua CD27 e, talvolta, produzione di IL-10, TGFβ o granzyme B22,23,24. La complessità del lineage delle cellule mieloidi richiede una combinazione di parecchi indicatori per definire il loro profilo normativo o proinflammatory quali CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a o CD16325,26. Infine, sono stati segnalati alcuni marcatori per identificare NKTregs come CD11b+, CD27+, TGFβ+, ma ulteriori studi sono necessari per ulteriori fenotipico descriverli27,28,29 ,30,31,32. Così, evidenze di attività soppressiva sono tenute a legittimare ulteriormente Descrizione fenotipica per l'identificazione di nuovi biomarcatori, nuovi immunoregulatory mediatori e di estendere l'ambito di nuove terapie cellulari.
Vi proponiamo due metodi complementari per valutare l'attività soppressiva delle cellule. In primo luogo, il metodo in vitro costituito da coltura soppressiva delle cellule con le cellule T effettrici con etichetta stimolate dall'antigene donatore allogenico che presenta le cellule (APCs) a diversi rapporti in 6 giorni, e analizzando l'effettore proliferazione delle cellule di T che riflette il donatore-regia di soppressione immune. Le cellule dai ratti trattati possono essere paragonate direttamente alle cellule da ratti innestati non trattata per attività soppressiva (o per qualsiasi altra popolazione di cellula regolatrice) e ingenuo in una gamma di rapporti di soppressore: effettrici. Inoltre, questo metodo non richiede alcun trapianto, e si ottengono risultati entro 6 giorni. In secondo luogo, il metodo in vivo consiste nel trasferire le cellule regolatorie previste da un ratto trattato a un destinatario innestato appena irradiato. Mentre le cellule B, cellule mieloidi o T cellule da ratti non trattati ingenuo sono generalmente in grado di inibire il rigetto acuto e di prolungare la sopravvivenza dell'innesto su trasferimento adottivo, cellule con attività soppressiva ha rafforzato dal trattato-destinatari hanno questi attributi 1,2,3,4,33. Linfopenia indotta dall'irradiazione del destinatario è consigliata per consentire passivamente trasferite cellule di rimanere inalterato da omeostasi di sangue e di padroneggiare più facilmente le risposte immunitarie anti-donatore. Per entrambi i metodi, l'utilizzo in vitro di trapianto allogeneic APC o in vivo il trasferimento adottivo di soppressiva terzi celle in destinatari innestati con un cuore di terze parti consentono analisi della specificità anti-donatore. Considerando che il metodo in vivo richiede un sostanza numero di cellule, scarsamente rappresentato sottopopolazioni delle cellule possono essere valutate più facilmente per attività soppressiva in vitro33.
Le risposte umorali possono anche essere misurate per valutare lo stato di tolleranza e il controllo di risposte anticorpali diretti verso gli antigeni erogatori. Infatti, tolleranza possa essere caratterizzato da assenza di risposta umorale verso il donatore ma conservazione della capacità per i destinatari sviluppare nuovi antigeni risposta umorale e la preservazione delle risposte di memoria. In primo luogo, il principio di rilevamento alloanticorpo è basato sul riconoscimento delle cellule del donatore da destinatari anticorpi dopo incubazione del tipo di cellula del donatore con il siero da un destinatario innestato. In secondo luogo, umorale risposte dirette agli antigeni esogeni possono essere valutata dopo stimolazione dei destinatari tollerante a lungo termine con Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulsionato con adiuvante di Freund completo. La presenza di anticorpi IgM e IgG specifici contro gli antigeni possa essere rilevata 4 e 13 giorni, rispettivamente, a seguito di immunizzazione, con enzima Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. In terzo luogo, la conservazione delle risposte di memoria immunitaria può essere valutata tramite l'iniezione di xenogeniche globuli rossi (RBCs) ai giorni -7 e + 3 di trapianto e RBCs macchiatura con destinatario siero raccolto presso days + 8 e + 17 dopo trapianto. Tutti questi metodi consentono l'identificazione di sottotipi di immunoglobuline utilizzando specifici anticorpi secondari e rapida acquisizione di risultati in meno di 1,5 h di FACS macchiatura o un paio d'ore da ELISA.
Infine, questi protocolli sono progettati per la caratterizzazione di modelli di trapianto e possono essere, in qualche misura, applicata ai modelli di malattia autoimmune. I principi del metodo possono essere trasposta a tutte le specie.

<table><tbody><tr><td>animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEW.1W e LEW.1A ratti</td><td>Janvier Labs, Francia</td><td></td><td>8 settimane,&nbsp;</td></tr><tr><td>BN donatore di terze parti ratti</td><td>Janvier Labs, Francia</td><td></td><td>8 settimane,&nbsp;</td></tr><tr><td>name</td><td>company</td><td>numero di catalogo</td><td>comments</strong</td></tr><tr><td>>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AdCD40Ig</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francia</td><td></td><td>Plasmidi fatti in casa</td></tr><tr><td>IL34-AAV</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francia</td><td></td><td>plasmidi fatti in casa</td></tr><tr><td>FGL2-AAV</td><td>nucleo vettoriale virale, INSERM UMR 1089, Nantes, Francia</td><td></td><td>plasmidi fatti in casa</td></tr><tr>ibridi<td>anti-TCRab</td><td>da collezione europea di colture cellulari, Salisbury, Regno Unito</td><td>Clone R7/3</td><td>Coltura fatta in casa, purificazione e accoppiamento fluororoforo</td></tr><tr><td>anti-CD25</td><td>ibridoma da collezione europea di colture cellulari, Salisbury, Regno Unito</td><td>OX39 clone</td><td>Ibridoma anti-CD8 fatto in casa per coltura, purificazione e accoppiamento fluororoforo</td></tr><tr><td></td><td>da collezione europea di colture cellulari, Salisbury, Regno Unito</td><td>Clone OX8</td><td>Coltura fatta in casa, purificazione e accoppiamento fluororoforo</td></tr><tr><td>ibridoma anti-CD45RA</td><td>da collezione europea di colture cellulari, Salisbury, Regno Unito</td><td>Clone OX33</td><td>Coltura fatta in casa, purificazione e accoppiamento fluororoforo</td></tr><tr><td>anti-CD161</td><td>Ibridoma da European Collection of Cell Culture, Salisbury, Regno Unito</td><td>Clone 3.2.3 Coltura</td><td>fatta in casa, purificazione e accoppiamento fluororoforo</td></tr><tr><td>anti-CD11b/c</td><td>Ibridoma da Collezione europea di colture cellulari, Salisbury, Regno Unito</td><td>Clone OX42</td><td>Coltura fatta in casa, purificazione e accoppiamento fluororoforo</td></tr><tr>ibridoma<td>anti-TCRgd</td><td>da Collezione europea di colture cellulari, Salisbury, Regno Unito</td><td>Clone</td> <td>V65Ibridoma anti-CD45RC di coltura fatta in casa, purificazione e accoppiamento fluororoforo</td></tr><tr><td></td><td>da collezione europea di colture cellulari, Salisbury, Regno Unito</td><td>Clone OX22</td><td>Coltura fatta in casa, purificazione e accoppiamento fluororoforo</td></tr><tr>ibridoma<td>anti-CD4</td><td>da collezione europea di colture cellulari, Salisbury, Regno Unito</td><td>Clone OX35</td><td>Coltura fatta in casa, purificazione e accoppiamento fluororoforo</td></tr><tr><td>anti-CD45R</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554881, His24 clone</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratto IgG-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimora, USA</td><td>#112-096-071</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratto IgG1</td><td>Serotec</td><td>#MCA 194</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratto IgG2a</td><td>Serotec</td><td>#MCA 278</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratto IgG2b</td><td>Serotec</td><td>#MCA 195</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratto IgM-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimora, Stati Uniti d'America</td><td>#115-095-164</td><td></td></tr><tr><td>streptavidina HRP</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA#</td><td>554066</td><td></td></tr><tr><td>KLH</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, Stati Uniti d'America</td><td>#9013-72-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc, USA</td><td></td><td>Soluzione tampone fosfato senza calcio e magnesio,&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td>#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti per substrato TMB</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA#</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>CellTraceTM Kit di proliferazione cellulare CFSE</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td></td><td></td></tr>#C34554 <tr><td>RPMI 1640 medio 1X</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc, USA</td><td>#31870-025</td><td></td></tr><tr><td>penicillina streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc, USA</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc, USA</td><td>#15630-056</td><td></td></tr><tr><td>aminoacidi non essenziali</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc, USA</td><td>#11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc, USA</td><td>#11360-039</td><td></td></tr><tr><td>2 beta mercaptoetanolo</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr>#M3148 <tr><td>Colorante di proliferazione cellulare eFluor&reg; 450</td><td>Cell Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td>#65-0842-85</td><td></td></tr><tr><td>Glutammine</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr>#G3126 <tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc, USA</td><td></td><td></td></tr>#D1306 <tr><td>Collagenasi D</td><td>Roche Diagnostics, Germania</td><td>#11088882001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr>#E5134 <tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>#B230561</td><td></td></tr><tr><td>Dinabeadi magnetiche</td><td>Dynal, Invitrogen</td><td>#11033</td><td>Capra anti-topo IgG</td></tr><tr><td>One Comp eBeads</td><td>Ebiosciences, San Diego, USA</td><td>#01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Fare riferimento alle linee guida</td><td></td><td></td>istituzionali</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fare riferimento alle linee guida</td><td></td><td></td>istituzionali</tr><tr><td>Naplbufina</td><td>Fare riferimento alle linee guida</td><td></td><td></td>istituzionali</tr><tr><td>Terramycine</td><td>Fare riferimento alle linee guida istituzionali</td> Buprenorfina Fare riferimento alle linee guida <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>istituzionali linee guida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Fare riferimento alle linee guida</td><td></td><td></td>istituzionali</tr><tr><td>Complete Freund's adiuvante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Fare riferimento alle linee guida</td><td></td><td></td>istituzionali</tr><tr><td>Ringer lattato</td><td>Fare riferimento alle linee guida</td><td></td><td></td>istituzionali</tr><tr><td>Ketamina</td><td>Fare riferimento alle linee guida istituzionali</td><td></td><td></td></tr><tr>Soluzione <td></td><td></td> di <td>lisi dei globuli rossi</td><td>Diluire 8,29 g di NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1 g di KHCO3 (Prolabo 26 733.292) e 37,2 mg di EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800 ml di H2O. Regolare il pH a 7,2-7,4 e completare a 1L con H2O.</td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td></td><td></td><td>Diluire 1 g di collagenasi in 500 ml di RPMI-1640 + 5 ml di Hepes + 2% di FCS</td></tr><tr><td>PBS-FCS (2%)-EDTA (0,5%)</td><td></td><td></td><td>Aggiungere 5 ml di EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) e 20 ml di FCS a 1 ml di PBS 1X</td></tr><tr><td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td><td></td><td></td><td>Diluire 50&micro; g (=1 fiala) di CFDA SE (componente A) in 90&mu; l Soluzione DMSO (componente B) per ottenere una soluzione stock da 10 mM. Quindi, diluire la soluzione madre a 1/20 000 in PBS 1X per ottenere un 0,5&mu; 500</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ml di terreno completo RPMI-1640 ml con 5 ml di penicillina (80 unità/ml)-steptomicina (80 mg/ml), 5 ml di L-glutammina, 5 ml di aminoacidi non essenziali (100X), 5 ml di piruvato sodico (100 mM), 5 ml di tampone HEPES (1M), 2,5 ml di mer captometanolo (7 ml di brodo di 2-bmercaptoetanolo diluito in 10 ml di RPMI), 10% FCS</td></tr><tr><td>name</td><td>company</td><td>numero di catalogo</td><td>comments</td></tr><tr><td>equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon 50ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#227261</td><td></td></tr><tr><td>falcon 15ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#188271</td><td></td></tr><tr><td>setaccio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatti di coltura in plastica Corning</td><td>VWR, Pessac#</td><td>391-0439</td><td></td></tr><tr><td>100&micro; m e 60&micro; m filtri tissutali</td><td>Sefar NITEX, Heiden, Svizzera</td><td>#03-100/44 e #03-60/35</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti U piastre di fondo per cocoltura</td><td>&nbsp; Piastra per coltura tissutale Falcon U-bottom, sterile, Corning</td><td>#353077</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Piastre con fondo a V per colorazione FACS</td><td>ThermoScientifique, Danemark</td><td>#249570</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti piastre ELISA a fondo piatto</td><td>Nunc Maxisorb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seringa per la frantumazione della milza</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#309649</td><td></td></tr><tr><td>Lettore ELISA</td><td>SPARK 10M, Tecan, Svizzera</td><td>SPARK 10M, Tecan, Svizzera</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>a bagnomaria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irradiatore a raggi X</td><td>Lincolshire, Inghilterra</td><td>Agitatore</td> solare Faxitron CP160 <td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> magnete Thermo Fisher <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Scientific Inc, Stati Uniti</td><td>12302D</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo valutazione della attività soppressiva t, b e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

La principale preoccupazione nel trapianto è raggiungere tolleranza specifica attraverso l'induzione di cellule regolatorie. La comprensione dei meccanismi di tolleranza richiede modelli affidabili. Qui, descriviamo modelli di tolleranza per l'allotrapianto cardiaco nel ratto, indotto dal blocco dei segnali di costimolazione o dal upregulation di molecole immunoregulatory attraverso il trasferimento genico. Ciascuno di questi modelli ha permesso la generazione in vivo delle cellule regolatorie come cellule T regolatorie (Treg), cellule regolatorie B (Bregs) o cellule mieloidi regolatorie (RegMCs). In questo manoscritto, descriviamo due protocolli complementari che sono stati utilizzati per identificare e definire le attività di regolamentazione delle cellule in vitro e in vivo per determinare la loro responsabilità nell'induzione della tolleranza e manutenzione. In primo luogo, un'analisi in vitro soppressiva ha permesso l'identificazione rapida delle cellule con capacità soppressiva sulle risposte immunitarie effettrici in un modo dipendente dalla dose e può essere utilizzata per ulteriori analisi come citochina misura o citotossicità. In secondo luogo, il trasferimento adottivo delle cellule da un destinatario trattato tollerante a un destinatario innestato appena irradiato, evidenziate le proprietà tollerogeniche di queste cellule nel controllo delle risposte immunitarie di innesto diretto e/o conversione di nuovo cellule regolatorie ( definito tolleranza infettiva). Questi metodi non sono limitati alle cellule con noti marcatori fenotipici e possono essere esteso a qualsiasi popolazione cellulare. Inoltre, il donatore diretto allospecificity delle cellule regolatorie (un obiettivo importante nel campo) può essere valutata utilizzando le cellule erogarici di terze parti o dell'innesto sia in vitro che in vivo. Infine, per determinare la capacità di tollerogeniche specifici di queste cellule regolatorie, forniamo protocolli per valutare le risposte umorali dell'anticorpo anti-donatore e la capacità del destinatario di sviluppare risposte umorali contro gli antigeni noti nuove o ex. I modelli di tolleranza descritto possono essere utilizzati per più ulteriormente caratterizzare cellule regolatorie, per identificare nuovi biomarcatori e molecole immunoregulatory e sono adattabili ad altri modelli di trapianto o malattie autoimmuni in roditore o umano.

La valutazione dell'attività soppressiva seguendo l'ordinamento della APC (Figura 1), cellule di risposta e Treg simultaneamente (Figura 2), o singolarmente (Figura 4), e qualsiasi altre presunte cellule regolatorie (Figura 3), può essere fatto in vivo di iniezione diretta di cellule regolatorie e in vitro tramite la misura di luminosità CFSE (<strong c...

Qui, presentiamo un protocollo per indurre la tolleranza nel trapianto e valutare in vitro e in vivo la capacità soppressiva delle sottopopolazioni cellulari distinti dal destinatario e lo stato immunitario del destinatario verso il donatore o antigeni esogeni.

In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

L'induzione della tolleranza nel trapianto è spesso associata all'emergere di una popolazione di cellule regolatorie. Assenza di risposta immunitaria verso il donatore, ma mantenimento dell'immunità contro antigeni esogeni. Disponiamo di diversi protocolli per valutare in vitro e in vivo la capacità soppressiva di qualsiasi sottoinsieme di cellule regolatorie e lo stato delle risposte umorali dell'ospite.Anestetizzare un ratto donatore Lewis 1W mediante inalazione di isoflurano in O2, integrata con N2O al 1% dopo cinque minuti. Posizionare l'animale in decubito dorsale e disinfettare l'addome con betadina per eseguire una toracotomia. Clampare la vena cava inferiore e superiore, legarle e quindi sezionarle.Quindi tagliare l'arteria polmonare e l'aorta e conservare il graft in NaCl 0,9% freddo. Anestetizzare un ratto ricevente Lewis 1A di 150 grammi, di età compresa tra otto e dodici settimane, mediante inalazione di isoflurano in O2 integrata con N2O all'1%. Posizionare l'animale in decubito dorsale e disinfettare l'addome con betadina per eseguire una laparotomia cefalo-pubica. Esternare gli intestini, clampare i vasi sanguigni addominali ed eseguire un'anastomosi laterale termina

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La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in dettaglio in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria. Qui si descrive l'uso di array di destinazione fluorescenti (ALS) in un test in vivo di cellule T in che valuta&gt; 250 parametri contemporaneamente mediante citometria a flusso.

L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em

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Qui presentiamo un'applicazione per una tecnica immunologica standard (CFSE macchiato OT-ho proliferazione) destinato a monitorare rapidamente adiuvante-mediata di linfociti T citotossici (CTL) generazione in vivo. Questa veloce stima delle capacità CTL è utile per lo sviluppo di vaccini profilattici contro patogeni intracellulari, come pure i vaccini terapeutici del cancro.

Rapida In Vivo valutazione della funzionalità di generazione i linfociti T citotossici di adiuvante per lo sviluppo di vaccini

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Descriviamo qui un saggio di uccisione a base di citometria in vivo che consente di esaminare l'immunodominanza nelle risposte citotossiche dei linfociti T (CTL) a un antigene tumorale modello. Forniamo esempi di come questo saggio elegante può essere impiegato per gli studi meccanicistici e per i test di efficacia dei farmaci.

Sartoria in vivo saggi di citotossicità per studiare l'Immunodominanza nelle risposte delle cellule CD8+ T specifiche del tumore

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Scopri come valutare in vitro e in vivo la capacità soppressiva delle cellule regolatorie nel trapianto cardiaco di ratto. Questo protocollo permette di studiare l'induzione della tolleranza immunologica.

In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto (Video) | JoVE Journal

In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto

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