Name: Lesposizione del Maiale CNS per lanalisi istologica: Un manuale per la decapitazione, Teschio di apertura, e Cervello di rimozione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Impara a esporre e rimuovere il cervello e l'ipofisi intatti del maiale per analisi istologica. Questa tecnica post-mortem preserva l'integrità dei tessuti neurali per studi neuroscientifici avanzati.

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Gli autori riconoscono con gratitudine l&#39;aiuto sapiente della signora Trine W. Mikkelsen, la signora M. Lise montaggio, e il personale a Påskehøjgaard. The Danish Medical Research Council, la Fondazione Lundbeck, e la Novo Nordisk Foundation sostenuti finanziariamente lo studio.

anestesia degli animali e euthanesia è stata eseguita in conformità con i &quot;Principi di laboratorio cura degli animali&quot; (NIH pubblicazione n ° 86-23, rivisto 1985) e approvato dal Consiglio danese per la ricerca etica animale. 1. Strumenti <ol><li> Raccogliere gli strumenti presentati nel video ed elencati nella tabella dei materiali. </li></ol> 2. Decapitazione NOTA: L&#39;anestesia è stata indotta mediante iniezione intramuscolare di 5 mL di midazolam (5 mg / ml) e 5 ml di ketamina (25 mg / mL). 5-10 minuti più tardi, quando l&#39;animale era profondamente sedato, una vena dell&#39;orecchio è stata incannulata e overdose letale (100 mg / kg di peso corporeo) di pentobarbital sodio (200 mg / ml) è stato somministrato per via endovenosa. Per garantire che l&#39;animale è stato completamente eutanasia, il dolore riflesso interdigitale è stato testato come mostrato da Ettrup et al. (2011) 20. euthanization completo è stato assicurato come descritto inl&#39;istruzione etica sopra e seguita da una perfusione transcardial con 5 L di soluzione salina isotonica, come dimostrato da Ettrup et al. (2011) 20. Tutte le procedure vengono eseguite dimostrate postmortem, precludendo la necessità per le precauzioni necessarie per l&#39;anestesia benessere a lungo termine e la sopravvivenza postprocedurale. <ol><li> Decapitare il maiale da un alto un&#39;incisione circolare cervicale, utilizzando un bisturi chirurgico, appena sotto l&#39;angolo mandibolare (Figura 1A). </li><li> Ancora con il bisturi chirurgico, continuare l&#39;incisione anteriormente attraverso il tessuto molle del collo, compresa la laringe e dell&#39;esofago, finché la colonna vertebrale ossea viene raggiunto, approssimativamente al livello della giunzione cranio cervicale. </li><li> Avanzare il taglio con un bisturi chirurgico dal lato anteriore della giunzione craniocervicale, sopra l&#39;arco anteriore dell&#39;atlante, e attraverso la membrana atlanto anteriore, esponendo così il canale vertebrale e il midollo spinale (Figura 1B). Allo stesso tempo chiedere un assistente di tirare il corpo del maiale lontano dalla testa di maiale per facilitare l&#39;accesso tra la base del cranio e la prima vertebra cervicale. </li><li> Continuare l&#39;incisione chirurgica attraverso il sacco durale e il midollo spinale (Figura 1B). Prestare particolare attenzione per garantire che una sezione trasversale completa del midollo spinale è raggiunto. NOTA: La mancata esecuzione del passaggio precedente può portare a trazione indesiderati sul midollo spinale e del cervello durante le seguenti fasi del processo di decapitazione. </li><li> Forza estendere la giunzione cranocervical a livello di sezione (Figura 1C). Al tempo stesso, utilizzare il bisturi chirurgico alla sezione restanti legamenti atlanto per rilasciare l&#39;articolazione tra i condili occipitali e il processo articoli superiore dell&#39;atlante. Separare la testa di maiale dal corpo. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55511/55511fig1.jpg" style="font-size: 14px;" /> Figura 1: minipig decapitazione. (A) del collo incisione (freccia, angolo mandibolare). (B) incisione attraverso i legamenti atlanto e il midollo spinale dura circondato (SC) alla giunzione craniocervicale (C1, arco anteriore dell&#39;atlante, OC, condilo occipitale). (C) La parte posteriore dell&#39;articolazione atlanto viene rilasciato da un&#39;estensione forte (frecce) a livello di sezione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55511/55511fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 3. Teschio di apertura <ol><li> Posizionare la testa di maiale su un tavolo. </li><li> Effettuare un&#39;incisione longitudinale dorsale con un bisturi chirurgico attraverso la pelle e il tessuto molle sottostante dal retro del muso, sul vertice della testa, e giù attraverso la parte posterioreregione occipitale. </li><li> Esporre la parte dorsale e posteriore del cranio rimuovendo il tessuto molle situata lateralmente alla incisione iniziale con un bisturi chirurgico. </li><li> Rilasciare il muscolo temporale bilateralmente dal cranio (Figura 2A) con un bisturi chirurgico. Assicurarsi che l&#39;osso occipitale posteriore è pulita dei tessuti molli. </li><li> Utilizzare l&#39;entrata posteriore del foro occipitale per rimuovere l&#39;osso occipitale con Kerrison osso punzone e Bone Rongeurs ed esporre il cervelletto dura coperto (Figura 2B). </li><li> Ritorno al lato anteriore esposta del cranio e selezionare un punto di ingresso nel dell&#39;osso frontale, proprio di fronte agli occhi. A questo punto, utilizzare uno scalpello osso con un martello per penetrare il cranio e immettere il seno frontale (Figura 2C). </li><li> Utilizzare l&#39;entità del seno frontale per favorire la rimozione della lamina dorsoposterior cranio esterno con una rongeur ossea o punzone ed esporre l&#39;interno, sottilecranio lamina ossea che copre il cervello (Figura 2D). </li><li> Aprire delicatamente la lamina interna cranio osseo anteriormente con un martello e scalpello osso per esporre cervello dura coperto (Figura 2E). </li><li> Continuare la rimozione di osso lateralmente usando uno scalpello osseo e una rongeur osso attraverso l&#39;osso temporale e parietale al fine di rilasciare la parte dorsoposterior finale del cranio, situato tra le parti già esposte del cervello e nel cervelletto dura coperto (Figura 2F). NOTA: E &#39;spesso possibile, durante la fase finale di questa procedura, per usare lo scalpello per rompere il restante posteriore ossa del cranio da una parte all&#39;altra, proprio come uno apre una porta. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55511/55511fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;" /> Figura 2: apertura cranio cavia. (A) esposizione della dorsoposteriosuperficie del cranio R, tra cui la rimozione del occipitale e muscoli temporali. (B) La rimozione dell&#39;osso occipitale (CB, dura coperta di cervelletto, OB, osso occipitale, OC, condilo occipitale, e SC, midollo spinale). (C) un martello e uno scalpello osso sono usati per penetrare il cranio anteriormente e per entrare nel seno frontale a livello degli occhi. (D) La portata del seno frontale (FS) viene utilizzato per rimuovere il cranio esterna dell&#39;osso spessore (1), esponendo una sottile lamina ossea interna (2) che copre il cervello. (E) La rimozione del sottile lamina ossea, esponendo il cervello dura coperto (freccia). (F) Infine, un martello e uno scalpello osso vengono utilizzati per il collegamento laterale anteriore e le aperture posteriori cranio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55511/55511fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 4. Cervello Removal <ol><li> Utilizzare pinze chirurgiche per sollevare la dura e creare un dolce un&#39;incisione vicino alla venoso seno longitudinale superiore utilizzando un bisturi chirurgico fine (Figura 3A). </li><li> Utilizzare micro-forbice o un coltello dura per aprire ulteriormente la dura madre che copre la superficie dorsale del cervello. NOTA: Particolare cura deve essere presa quando si rimuove la dura corrispondente al tentorio cerebellare (figura 3B), come conservazione di questo foglio durale impedirà successiva rimozione cervello. </li><li> Posizionare la testa di maiale verticalmente (Figura 3C). </li><li> Utilizzare lo scalpello osso o un dissettore per rilasciare cervello ventroanterior per via smussa del bulbo olfattivo dal pavimento dura coperto della cavità cranica (Figura 3D). </li><li> Utilizzare un bisturi chirurgico fino al punto chiasma ottico esposta (Figura 3E). Esporre e la sezione del peduncolo ipofisario ei nervi oculomotori. </li><li> Rilasciare il tronco cerebrale ventrale sezionando LOwer nervi cranici (Figura 3F) con una multa bisturi chirurgico. Garantire che tentorio cerebellare durale stato completamente inciso (figura 3B), in quanto questa foglia durale sarà altrimenti tagliare il tronco cerebrale durante il processo di rilascio. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55511/55511fig3.jpg" style="font-size: 14px;" /> Figura 3: rimozione cervello cavia. Apertura (A) durale con pinze chirurgiche e un coltello dura. (B) Bisogna fare attenzione a incidere completamente la foglia durale (freccia), che si trova tra il cervello e il cervelletto. (C) La testa di maiale è in posizione verticale per una migliore visualizzazione delle strutture di base del cranio e al fine di gravità per aiutare lo spostamento previsto del cervello. (D) Un dissettore o uno scalpello osso viene usato per alleviare il bulbo olfattivo dalla sezione smussata dalla dura madre-coverebase del cranio d. (E) La dissezione viene continuata in direzione posteriore lungo la base del cranio per l&#39;esposizione e sezionamento del chiasma ottico (freccia), gambo infundibolare e nervi oculomotori. (F) Il rilascio cervello è completato con la sezione dei nervi cranici inferiori come si allontanano dalla superficie ventrale del tronco cerebrale (III, oculomotore, IV, nervo trocleare, V, nervo trigemino e VI, abducente nervi). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55511/55511fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 5. Rimozione pituitaria <ol><li> Identificare il peduncolo ipofisario ei suoi dintorni foglia durale (la sellae diapragma) nel pavimento cranio (Figura 4A). </li><li> Incidere la foglia laterali durale al peduncolo ipofisario utilizzando una multa bisturi chirurgico (Figura 4B). </li><li> Utilizzare un dissettore per rilasciare la fossauitary ed estrarlo dell&#39;ipofisi fossa (Figura 4C). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55511/55511fig4.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;" /> Figura 4: rimozione pituitaria cavia. (A) La fossa pituitaria (*) è identificato nel piano cranio (1, bulbo olfattivo, 2, chiasma ottico e PF, fossa cranica posteriore). (B) La copertura durale (diagphragm Sellar, (freccia)) viene incisa lateralmente. (C) L&#39;ipofisi (freccia) viene rilasciato con un dissettore e tirato fuori dalla fossa pituitaria. barra di scala (AC) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55511/55511fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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<li>Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C., Palomero-Gallagher, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telencephalon+of+the+minipig%2C+cytoarchitecture+and+cortical+surface+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">The telencephalon of the minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy.</a> Brain Struct Funct. , e-pub ahead of print (2016).</li>
<li>Boltze, J., Nitzsche, B., Geiger, K. D., Schoon, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+investigation+of+different+MCAO+modalities+and+impact+of+autologous+bone+marrow+mononuclear+cell+administration+in+an+ovine+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Histopathological investigation of different MCAO modalities and impact of autologous bone marrow mononuclear cell administration in an ovine stroke model.</a> Transl Stroke Res. 2, 279-293 (2011).</li>
<li>Jortner, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+return+of+the+dark+neuron.+A+histological+artifact+complicating+contemporary+neurotoxicologic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">The return of the dark neuron. A histological artifact complicating contemporary neurotoxicologic evaluation.</a> Neurotoxicology. 27, 628-634 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La maggior parte degli studi di neuroscienze sperimentali vengono eseguiti in piccole specie animali, come topi e ratti, in cui l&#39;accesso al sistema nervoso centrale è facilitato da un sottile skull- e durale spessore. Tuttavia, in animali da esperimento più grandi come maiali 1, 4, 8, pecore 32, e primati non umani, l&#39;elevato spessore di queste strutture richiede l&#39;uso di strumenti robusti (...

<html> studi neuroscienze traslazionale nei suini sono diventati sempre più popolari nel corso degli ultimi due decenni. Le grandi dimensioni del cervello di maiale consente l&#39;utilizzo di convenzionali imager cerebrali clinica e l&#39;uso diretto e sperimentazione di procedure neurochirurgiche ed attrezzature dalla clinica umana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Negli ultimi 20 anni, maiali, specialmente maialino (ad esempio, Göttingen cavia), sono stati utilizzati per esaminare modalità di trattamento neuromodulatori, come il trapianto di cellule staminali; Vettore virale trasfezione; e la stimolazione cerebrale profonda diretta verso il morbo di Parkinson, l&#39;obesità, la depressione, e la malattia di Alzheimer 2, 6,= &quot;xref&quot;&gt; 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Questo è stato seguito dallo sviluppo di approcci stereotassica e chirurgici per manipolare cavia CNS 3, 18, 19, 20, 21. I cambiamenti del SNC istituiti sono state valutate in animali vivi mediante imaging cerebrale (PET 10, 13, 22, 24 e MR 23), cistometria 11, 12, 25, analisi del passo17, la valutazione neurologica 9, 17, e l&#39;esame autoptico basato su istologia e analisi stereologica 14, 15, 17, 26, 27, 31. Tuttavia, l&#39;analisi post-mortem richiede l&#39;esposizione e la rimozione del cervello di maiale, che non è un compito facile, come una spessa cranio osseo e durale fibroso che copre circondano il cervello di maiale. L&#39;obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come il cervello post-mortem di suini e dell&#39;ipofisi possono essere esposti e rimossi in uno stato integro in 15-20 minuti utilizzando strumenti chirurgici non motorizzati. Il video didattico e illustrazioni fotografiche mostrano cavie di sesso maschile (età: 6 mesi, a corpo libero: 20-25 kg) utilizzato per uno studio anatomico sulla ghiandola pituitaria cavia.

<table><tbody><tr><td>Manico per bisturi pesante #4</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>10008-13</td><td>Ottimo per l'incisione della pelle e la rimozione dei tessuti molli</td></tr><tr><td>Lame per bisturi non sterili #23</td><td>FST&nbsp;</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi #7</td><td>FST&nbsp;</td><td>10007-12</td><td>Ottimale per l'incisione durale e i lavori di precisione</td></tr><tr><td>Lame per bisturi non sterili #11</td><td>FST&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinze chirurgiche</td><td>FST&nbsp;</td><td>11024-18</td><td>La punta della pinza chirurgica garantisce una presa salda</td></tr><tr><td>Kerrison Bone Punch</td><td>Aesculap Neurosurgery</td><td>FF713R</td><td>Deve essere robusto, dimensione del morso 3-5 mm</td></tr><tr><td>Bone Rongeur</td><td>Aesculap Neurosurgery</td><td>MD615</td><td>Deve essere robusto, dimensione del morso 15 x 5 mm</td></tr><tr><td>Bone Rongeur</td><td>Aesculap Neurosurgery</td><td>FO551R</td><td>Deve essere robusto, dimensione del morso 25 x 15 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Scalpello per ossa</td><td>Lawton</td><td>67-0335</td><td>La dimensione della testa dello scalpello non deve superare i 20 mm</td></tr><tr><td>Martello (martello)</td><td>Millarco</td><td>5624108</td><td>Peso 300 g, lunghezza 30 cm, dimensione dell'area di battuta della testa 2 x 2 cm</td></tr><tr><td>Micro-Scissor</td><td>FST&nbsp;</td><td>14002-14&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dissettore</td><td>Neurochirurgia Esculap</td><td>OL165R</td><td></td></tr><tr><td>G&ouml; ttingen minipigs</td><td>Ellegaard G&ouml; ttingen Minipigs A/S, Danimarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Euthanimal</td><td></td><td></td><td>pentobarbital</td></tr><tr><td>ketamina</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midazolam&nbsp;</td><td>Hameln Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;esposizione del maiale cns per l&#39;analisi istologica: un manuale per la decapitazione, teschio di apertura, e cervello di rimozione

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Suini sono diventate sempre più popolari in larga animale ricerca traslazionale neuroscienze come sostituto economicamente ed eticamente fattibile primati non umani. La dimensione del cervello di grandi dimensioni del maiale permette l&#39;utilizzo di convenzionali imager cervello clinica e l&#39;uso diretto e la sperimentazione di procedure e attrezzature neurochirurgiche dalla clinica umana. Ulteriori analisi macroscopica e istologica, tuttavia, richiede l&#39;esposizione post mortem del maiale sistema nervoso centrale (SNC) e successiva rimozione del cervello. Questo non è un compito facile, come il maiale CNS è incapsulato da una fitta, il cranio ossuto e della colonna vertebrale. L&#39;obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come esporre e rimuovere il cervello post-mortem di suini e la ghiandola pituitaria in uno stato integro, adatto per la successiva analisi macroscopica e istologica.

Per evitare che il materiale del tessuto si secchi, si consiglia di conservare il cervello rimosso e pituitaria in un vaso riempito di fissativo o soluzione salina isotonica immediatamente dopo l&#39;analisi macroscopica è stata eseguita. Il materiale tessuto può essere immagazzinato nel fissativo per anni, mentre stoccaggio in soluzione salina isotonica, anche in frigorifero, porterà a decadimento dei tessuti con il tempo. L&...

L&#39;obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come esporre e rimuovere il post-mortem del cervello di maiale e ghiandola pituitaria in uno stato integro, adatto per la successiva analisi macroscopica e istologica.

L&#39;esposizione del Maiale CNS per l&#39;analisi istologica: Un manuale per la decapitazione, Teschio di apertura, e Cervello di rimozione

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

In questo video, mostriamo come esporre e rimuovere il cervello intero del maiale e l'ipofisi integra aprendo il cranio e la dura madre. Dichiarazione etica: L'anestesia e l'eutanasia sugli animali sono state eseguite in conformità con i "Principi per la cura degli animali da laboratorio" e approvate dal Comitato danese per l'etica nella ricerca sugli animali. L'anestesia è stata indotta in minimaiali maschi di Gottinga mediante iniezione intramuscolare di midazolam e ketamina.Cinque-dieci minuti dopo, quando gli animali erano profondamente sedati, si procedeva alla cannulazione di una vena auricolare e si somministrava una dose letale di pentobarbital sodico per via endovenosa. Per accertare che gli animali fossero completamente eutanasizzati, si testava il riflesso doloroso interdigitale come mostrato in precedenza. Dopo un'adeguata eutanasia, gli animali venivano perfusi transcardialmente con cinque litri di soluzione salina isotonica.Tutte le procedure dimostrate vengono quindi eseguite post mortem, escludendo la necessità di precauzioni per il benessere necessarie per l'anestesia a lungo termine e la sopravvivenza post-procedurale. Strumenti utilizzati: manico di bisturi pesan

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Un modello di Piglet neonatale Hypoxic-ischemica Encefalopatia

La ricerca sulla neurotossicità dello sviluppo sviluppata da anestesia (AIDN) si è concentrata sui roditori, che non sono generalmente applicabili agli esseri umani. I modelli primati non umani sono più rilevanti, ma sono proibitivi e difficili da utilizzare per la sperimentazione. Il maiale, al contrario, è un modello animale clinicamente rilevante e pratico ideale per lo studio della neurotossicità anestetica.

Uso di un modello di maiale per lo studio della neurotossicità dello sviluppo sviluppato da anestetici (AIDN): un approccio di neuroscienza transazionale

Questo studio esplora l'uso novello del microelettrodo basati su enzima matrice (MEA) tecnologia per monitorare l'attività del neurotrasmettitore in vivo nei suinetti. L'ipotesi era che quella dysregulation di glutammato contribuisce al meccanismo di neurotossicità anestetico. Qui, presentiamo un protocollo per adattare la tecnologia MEA per studiare il meccanismo di neurotossicità indotta da anestesia.

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Viene presentato un comodo metodo di perfusione alimentato a gravità per l'analisi istologica del sistema nervoso centrale del topo. Il rilevamento immunofluorescente della α-sinucleina fosforilata è dimostrato in un modello murino di malattia di Parkinson. Questo lavoro descrive anche in modo completo le fasi di perfusione transcardica, dissezione, congelamento / incorporamento dei tessuti e sezionamento congelato.

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Questo protocollo presenta un metodo robusto e dettagliato per ottenere sinaptosomi altamente puri, vescicole sinaptiche e altre frazioni sinaptiche dal cervello del topo. Questo metodo consente la valutazione dei processi sinaptici, compresa l'analisi biochimica della localizzazione e della funzione delle proteine con risoluzione compartimentale.

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Qui, presentiamo un metodo per la valutazione delle prestazioni e della sicurezza a lungo termine di array di elettrodi subdurali morbidi in un modello di minipig, descrivendo il metodo e gli strumenti chirurgici, la risonanza magnetica postoperatoria, l'elettrofisiologia della corteccia uditiva, le proprietà elettrochimiche dell'impianto e l'immunochimica post-mortem.

Impianto di array di elettrocorticografia morbida subdurale (ECoG) e registrazione corticale a lungo termine nei minipig

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Impara a esporre e rimuovere il cervello e l'ipofisi intatti del maiale per analisi istologica. Questa tecnica post-mortem preserva l'integrità dei tessuti neurali per studi neuroscientifici avanzati.

Lesposizione del Maiale CNS per lanalisi istologica: Un manuale per la decapitazione, Teschio di apertura, e Cervello di rimozione (Video) | JoVE Journal

L'esposizione del Maiale CNS per l'analisi istologica: Un manuale per la decapitazione, Teschio di apertura, e Cervello di rimozione

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